腫瘤免疫治療新方法

1、 自體細(xì)胞免疫療法 CIK cytokine-induced killer ，中文名：自體細(xì)胞免疫療法多 種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子如抗 CD卅克隆抗體、IL-2和 IFN- 丫等共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得 的一群異質(zhì)細(xì)胞。由于該種細(xì)胞同時(shí)表達(dá) CD3菲口 CD56-W種膜蛋 白分子,故又被稱為 NK細(xì)胞樣 T淋巴細(xì)胞,兼具有 T淋巴細(xì)胞強(qiáng) 大的抗瘤活性和 NK細(xì)胞的非 MHC艮制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。因此，應(yīng)用 CIK細(xì)胞被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療的首選方案。 CIK細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞 CD3卻 CD56老田胞在正常人外周血中極其 罕見，僅 1吩 5% 1

2、 CIK特點(diǎn) CIK 細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞 CD3+CD56+胞在正常人外周血中極 其罕見，僅 1吩 5% 在體外經(jīng)多因子培養(yǎng) 28 30天，CD3+CD56+ 細(xì)胞迅速增多，較培養(yǎng)前升幅可達(dá) 1000倍以上。實(shí)驗(yàn)證明，擴(kuò) 增出的 CD3+CD56+胞來源于 CD3+CD56-T胞，而非 CD3-CD56+N酬胞。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在 CD3+CD56的 T細(xì)胞中，除 CD4-CD8-T細(xì)胞外，其余三種 T細(xì)胞亞群CD4-CD8+ CD4-CD8- CD4+CD8+均可通過體外多因子培養(yǎng)而獲得 CD56分子的表達(dá)， 而由于 CD4+CD8+胞和 CD4-CD8細(xì)胞在正常人外周血中含量極 低而間接提示此 CD

3、3+CD56+胞絕大多數(shù)來源于外周血中 CD4-CD8+1H胞。而由于CD4-CD8-T細(xì)胞在培養(yǎng)1個(gè)月后有近56% 的T細(xì)胞同時(shí)表達(dá) CD56和 CD3說明其也是 CIK細(xì)胞的重要來 源。比擬 CD3+CD56+CIK田胞中表達(dá) CD8苗口 CD8-,的兩群細(xì)胞其 殺瘤活性沒有顯著性差異，提示 CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒性與 CD3CD56 表達(dá)成相關(guān)趨勢，而與 CD8的表達(dá)未表現(xiàn)出相關(guān)性。 殺傷原理 CIK細(xì)胞能夠通過三種途徑殺滅腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞： CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的直接殺傷： CIK細(xì)胞 可以通過不同的機(jī)制識(shí)另 U 腫瘤細(xì)胞，釋放顆粒酶 /穿孔素等毒性 顆粒，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞

4、裂解。 CIK細(xì)胞釋放的大量炎性細(xì)胞因子具有抑瘤殺瘤活性： 體外 培養(yǎng)的CIK細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，如 IFN- 丫、TNF-a、 IL-2等，不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，還可通過調(diào)節(jié)機(jī)體 免疫系統(tǒng)反響性間接殺傷腫瘤細(xì)胞。 CIK細(xì)胞能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡： CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中 表達(dá)FasL 口型跨膜糖蛋白 通過與腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)的 Fas I 型跨膜糖蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 CIK細(xì)胞發(fā)揮作用的三種途徑 殺瘤特點(diǎn) 應(yīng)用 LAK細(xì)胞是目前較為普及的腫瘤過繼免疫治療方案， 廣 泛使用于黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、非霍奇金淋巴瘤、肺癌和結(jié)腸癌。 因LAK 細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量有限，殺瘤活性也較 TI

5、L 等 T 淋巴細(xì)胞為 低，故雖然殺瘤譜廣，但效果局限。相比擬而言， TIL細(xì)胞本身 較 LAK 細(xì)胞具有更強(qiáng)大的抗瘤效力，但由于殺瘤譜窄，制備困難， 及在收集過程中可能導(dǎo)致的功能改變而限制了其臨床應(yīng)用價(jià)值。 與上述兩種效應(yīng)細(xì)胞過繼免疫治療相比， CIK細(xì)胞具有獨(dú)特的優(yōu) 勢，列舉如下。 1. 增殖速度快 CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中參加 IFN- 丫、IL-1、抗 CD3 McAb IL-2 等多因子后，細(xì)胞增殖速度迅速加快，遠(yuǎn)超過 LAK細(xì)胞。 在培養(yǎng)第 22天增殖曲線達(dá)頂峰，約增加 100倍，其中 CD3+CD56+ 細(xì)胞不僅絕對(duì)數(shù)量增加 1000倍以上，且所占百分比也大幅上升， 培養(yǎng)至28 3

6、0天時(shí)達(dá)平臺(tái)期，細(xì)胞毒活性亦達(dá)峰值，而 LAK細(xì) 胞培養(yǎng)前后數(shù)量沒有明顯增加。 2. 殺瘤活性高 CIK細(xì)胞是以CD3+CD56+TB胞為主的異質(zhì)細(xì)胞群，大量體內(nèi) 外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CIK細(xì)胞較以NK胞為主的LAK細(xì)胞具備 更強(qiáng)大的殺瘤活性，而且其體內(nèi)殺瘤細(xì)胞毒性的維持不必依賴大 劑量外源性 IL-2 的持續(xù)給予。體外實(shí)驗(yàn)中，任歡和 Lu等均發(fā)現(xiàn) 在體外等數(shù)量的 CIK細(xì)胞比 LAK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞系的殺傷能力稍 高或相近，但因 CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中 CD3+CD5微應(yīng)細(xì)胞增長 迅速，故CIK細(xì)胞的總殺傷單位TLU為 LAK細(xì)胞的 73倍甚 至更高，其殺傷效率顯著高于 LAK細(xì)胞。腫瘤克隆抑制實(shí)驗(yàn)顯示

7、， CIK細(xì)胞的瘤細(xì)胞抑制 Log指數(shù)為 2.5 3.5 ,較 LAK細(xì)胞的瘤細(xì) 胞抑制指數(shù)高 2個(gè) Log。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺 陷小鼠身上構(gòu)建的人類 B細(xì)胞淋巴瘤 SU-DHL4 模型，CIK細(xì)胞在 去除荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤病灶， 抑制轉(zhuǎn)移，延長生存期等方面的作用 均明顯優(yōu)于 LAK細(xì)胞。 3. 殺瘤譜廣 CIK 細(xì)胞雖然以 CD3+CD56+T 細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞，但卻沒有 T 淋巴細(xì)胞殺傷時(shí)的 MHC限制性，故對(duì)于多種腫瘤細(xì)胞系包 括 NK敏感的 K562 和 NK 不敏感的 Hela、HL6Q 人 T 細(xì)胞急淋白 血病細(xì)胞系 OCRF-CEM 人淋巴瘤細(xì)胞系 OCI-LY8、

8、LAM53 人結(jié) 腸癌細(xì)胞系HT-29、CR7Q人腎癌細(xì)胞系 A704和新鮮腫瘤組織 均表現(xiàn)出強(qiáng)大的殺傷活性。 4. 對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感 Wolf用阿霉素和長春新堿誘導(dǎo)出多重耐藥細(xì)胞系 K562/DOXffi CCRF-CEM-VB匿現(xiàn) CIK細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感的親本細(xì)胞和不敏 感的轉(zhuǎn)化細(xì)胞均具有強(qiáng)大的殺傷活性，兩者比擬無差異。 5. 殺瘤活性不受 CsA FK506等免疫抑制劑的影響 Mehta觀察到免疫抑制劑 CsA和 FK506雖然可以抑制抗 CD3H 抗介導(dǎo)的 CIK 細(xì)胞脫顆粒過程，卻不影響靶細(xì)胞誘導(dǎo)的 CIK 細(xì)胞 脫顆粒，并且 CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性不會(huì)因此降低。

9、6. 對(duì)正常骨髓造血前體細(xì)胞毒性很小 Seheffold通過 CFU-G噬成實(shí)驗(yàn)檢測 CIK細(xì)胞對(duì)骨髓造血前 體細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn) CIK細(xì)胞對(duì) K562細(xì)胞的殺傷強(qiáng)度高達(dá) 3級(jí)， 但對(duì)GM-CF成有缺乏 1級(jí)的抑制。 Holye 也證實(shí) CIK 細(xì)胞對(duì)正常髓系克隆生成幾乎沒有影響， 只 是對(duì)紅系的生成顯示出輕度抑制， 這可能與 CIK細(xì)胞自身分泌較 高水平的IFN- T有關(guān)。 7. 能抵抗腫瘤細(xì)胞引發(fā)的效應(yīng)細(xì)胞 Fas-FasL凋亡 已證明過繼免疫治療失敗的一個(gè)重要原因是過繼效應(yīng)細(xì)胞被 腫瘤細(xì)胞外表表達(dá)的某些蛋白主要是 FasL誘導(dǎo)凋亡，而 CIK 細(xì)胞雖然在 Fas被占據(jù)后會(huì)引起少量細(xì)胞凋亡

10、， 但對(duì)其殺瘤細(xì)胞 毒性沒有明顯影響。Verneris的實(shí)驗(yàn)提示 CIK細(xì)胞內(nèi)有抗凋亡 基因表達(dá)，并檢出多種保護(hù)基因，如 cFLIP、Bcl-2、Bcl-X1、 DAD1和survivin 的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn) CIK細(xì)胞具備合成 FasL的能力，CIK細(xì)胞培養(yǎng)上清中可以檢測到具生物學(xué)活性的水 溶性 FasL,說明 CIK細(xì)胞可以對(duì)抗體內(nèi) FasL陽性腫瘤所引發(fā)的 效應(yīng)細(xì)胞活性下降甚至消 失。 影響殺傷活性的因素 1. 外源性細(xì)胞因子的補(bǔ)充 CIK細(xì)胞的體外擴(kuò)增需要外源性細(xì)胞因子，如 IL-2、IL-7、 IL-12等的輔助，這些因子控制著人免疫系統(tǒng)內(nèi)各種抗原特異性 細(xì)胞的擴(kuò)增及其生物學(xué)活

11、性。 外源性 IL-2、IL-7、IL-12可以顯 著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的生長，尤其存在有 IL-2和 IL-7 條件下 CIK 細(xì)胞的增殖率為高，而外源性,IL-2、IL-7、IL-12對(duì) CIK細(xì)胞 的細(xì)胞毒活性沒有影響。 外源性 IL-2和 IL-7 的刺激會(huì)降低 CIK 細(xì)胞外表相應(yīng)受體的表達(dá)量，而 CD28分子在 IL-7 存在條件下較 IL-2時(shí)表達(dá)更高。IL-12會(huì)降低 CIK細(xì)胞外表 ICAM-1 的表達(dá)， IL-7 那么會(huì)提高 CD56的表達(dá)。與 IL-2相比,IL-7可明顯增加 CD4+ 細(xì)胞的比例。雖然外源性 IL-2、IL-7 和 IL-12培養(yǎng)過程中均可 出現(xiàn)少量凋亡細(xì)胞，

12、但有研究顯示外源性 IL-12的添加會(huì)增加 CIK細(xì)胞中壞死細(xì)胞的比例。 抗 CD3McA蝦僅在 CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程中起著重要作用， 在提高 CIK細(xì)胞對(duì)白血病及淋巴瘤的殺傷敏感性上同樣具有促進(jìn)作用。 Lefterov將抗 CD3McAlfe 靶細(xì)胞預(yù)先共同孵育可增加 CIK細(xì)胞 對(duì)其的殺傷敏感性，而且這種增強(qiáng)作用可以被抗 FcR的抗體如 抗 CD36抗 CD32所局部阻斷，間接證明抗 CD3McAlg|發(fā)的殺 傷活性增高與 FcR介導(dǎo)的抗體結(jié)合有關(guān)。 2. 多種細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)染 由于 CIK 細(xì)胞擴(kuò)增對(duì)外源性細(xì)胞因子有依賴，因此通過基因轉(zhuǎn) 移方法將相關(guān)基因轉(zhuǎn)入 CIK 細(xì)胞，不僅可減少外源

13、性細(xì)胞因子的 使用量，還可提高 CIK細(xì)胞自身的抗瘤活性。 IL-7 : Fitke 利用改良的腺病毒轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)將人 IL-7 基因轉(zhuǎn) 染 CIK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞可以生成較高濃度 IL-7 ,最多者 可達(dá) 1 100pg/106cell/24h 。合成的 IL-7 具有明顯的生物學(xué)活 性，可以促進(jìn)轉(zhuǎn)染 CIK 細(xì)胞的增殖，顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。外源 IL-7基因的表達(dá)同時(shí)改變了 CIK 細(xì)胞對(duì)其他細(xì)胞因子的分泌， 其中尤以TNF-a 分泌顯著升高，這一現(xiàn)象在未轉(zhuǎn)染 CIK體外添 加 IL-7 時(shí)并未觀測到。雖然轉(zhuǎn)染后 CIK細(xì)胞外表各種與細(xì)胞殺 傷活性相關(guān)的外表抗原，如 ICAM-1等與未轉(zhuǎn)

14、染 CIK細(xì)胞相比無 明顯變化，但轉(zhuǎn)染后 CIK細(xì)胞在對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系如腎癌、 惡性 黑色素瘤以及結(jié)腸癌的殺傷能力較未轉(zhuǎn)染 CIK細(xì)胞有明顯增強(qiáng)。 IL-2 : Lu 等發(fā)現(xiàn) CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程中 CD56分子的表達(dá)是 IL-2 依賴性的，但單獨(dú) IL-2 的存在卻會(huì)降低培養(yǎng)后 CIK細(xì)胞的表型 變化幅度。盡管有實(shí)驗(yàn)指出 CIK細(xì)胞的體內(nèi)治療并不需要 IL-2 體外持續(xù)供應(yīng)，但 Zoll等的研究結(jié)果說明，體外培養(yǎng)中 IL-2 對(duì) CIK細(xì)胞的增殖和殺傷功能有促進(jìn)作用。 Schmidt-Wolf將包 含人 IL-2 基因片段的重組質(zhì)粒用電穿孔法導(dǎo)入 CIK細(xì)胞治療轉(zhuǎn) 移性實(shí)體瘤，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞可

15、分泌較高水平的 IL-2 (330-1 800pg/106 cell/24h ，平均達(dá) 836pg/106 cell/24h )。雖然轉(zhuǎn) 染前后 CIK細(xì)胞外表各種膜蛋白表達(dá)并無顯著變化， 但體外檢測 轉(zhuǎn)染后 CIK細(xì)胞在增殖率和細(xì)胞殺傷活性上均高于未轉(zhuǎn)染細(xì) 胞。 制備流程 CIK細(xì)胞制備流程 抽取患者的外周血，在 37C, 5%勺二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育 2h,使用高速離心機(jī)別離，收集懸浮細(xì)胞，在體外(模擬人體內(nèi) 環(huán)境)，參加多種細(xì)胞因子如 CD3單抗，IFN-R , IL-2 等培養(yǎng)， 每隔 2-3天換一次培養(yǎng)液，第 7、11、13、15天收集 CIK細(xì)胞， CD3苗口 CD56老田胞迅速增多

16、，較培養(yǎng)前升幅可達(dá) 1000倍以上。 開展歷程 1985年美國外科醫(yī)生首次發(fā)現(xiàn)大劑量的 IL-2 在體外可以將 淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成具有很強(qiáng)腫瘤殺傷作用的細(xì)胞，稱為 LAK細(xì)胞。 以后發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中參加 CD3單克隆抗體可以將這些細(xì)胞的腫 瘤殺傷活性提高十幾倍，擴(kuò)增的數(shù)量也大幅提高，這種細(xì)胞稱為 CD3AK在這個(gè)根底上再在培養(yǎng)液中參加 INF-r、IL-1 等細(xì)胞因 子，得到表達(dá) CD3CD8CD5邵日性的異質(zhì)細(xì)胞群，這些細(xì)胞稱為 CIK,相比 LAK細(xì)胞增殖倍數(shù)更多，殺毒活力更強(qiáng)。 1991年美國斯坦福大學(xué) Schmidt Wolf等人首次報(bào)道了 CIK細(xì) 胞。 國內(nèi)臨床應(yīng)用情況和相關(guān)政策法規(guī) 早

17、在 1996年國內(nèi)已有 CIK細(xì)胞治療技術(shù)臨床應(yīng)用的研究論 文發(fā) 表，目前國內(nèi)已有超過百家的醫(yī)療單位開展了該項(xiàng)治療技術(shù) 的相關(guān)臨床應(yīng)用與研究。 根據(jù)國際國內(nèi)細(xì)胞治療臨床應(yīng)用的進(jìn)展?fàn)顩r， 2021年 5月 1 日衛(wèi)生部頒發(fā)執(zhí)行的 ?醫(yī)療技術(shù)臨床管理應(yīng)用方法? 將“自體免 疫細(xì)胞治療技術(shù)列為三類醫(yī)療技術(shù)。 2 適應(yīng)癥 CIK 細(xì)胞治療屬于過繼細(xì)胞免疫療法，由于 CIK 細(xì)胞溶瘤作 用是非 MHC艮制性的，即不受腫瘤組織類型的限制， 因此對(duì)任何 一種腫瘤均有殺傷作用，但對(duì)高抗原表達(dá)的癌癥療效最好，如： 髓性白血病、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性腎癌、非何杰金氏淋 巴瘤等。其它癌癥如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、

18、肝癌、胃癌、大腸 癌等，CIK細(xì)胞治療亦有較好的療效。 CIK細(xì)胞治療適用于任何 一期的癌癥患者，但對(duì)早期腫瘤患者或經(jīng)過手術(shù)及放化療后腫瘤 負(fù)荷較小的患者效果好。它對(duì)于手術(shù)、放化療或造血干細(xì)胞移植 后患者體內(nèi)微小殘留病灶的去除， 防止癌細(xì)胞擴(kuò)散和復(fù)發(fā)，提高 患者自身免疫力，減少毒性反響等方面具有重要作用。 某些不適 臺(tái)手術(shù)、不能耐受放化療的中晚期腫瘤患者， CIK細(xì)胞治療可以 提高其生活質(zhì)量，延長帶瘤生存時(shí)間。 特點(diǎn) 1. CIK細(xì)胞增殖速度快，抗腫瘤活性細(xì)胞可大量增殖，且細(xì) 胞活性也大大增強(qiáng)。 2. CIK細(xì)胞具有識(shí)別腫瘤的機(jī)制，對(duì)正常的細(xì)胞無毒性作用。 3. 殺瘤譜廣，可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、腸癌等多 種腫瘤的治療，對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感。 4. 是典型