人參皂苷Rh2對LoVo細胞遷移和轉(zhuǎn)移能力的影響及機制討論

1、人參皂音Rh2對LoVo細胞遷移和轉(zhuǎn)移能力 的影響及機制討論我國結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，聯(lián)合化療和生物治 療有助于提高患者的5年生存率，然而，其藥物本身的毒副作用 極大限制了其應(yīng)用范圍。隨著傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的復(fù)興，越來越多的中藥 以及中藥單體被應(yīng)用于臨床科學(xué)試驗。人參皂音Rh2是人參中分離提純的一種單體，具在各種腫瘤的相關(guān)研究中有著較為顯著的 作用，研究表明：Rh2能有效抑制人肝癌細胞 SMMC-7721人結(jié)腸 癌細胞Caco-2和HT-29、小鼠宮頸癌細胞 U14人食管癌細胞 Eca-109、馬立克氏病腫瘤細胞系 MSB4人白血病多藥耐藥(MDR) 細胞K562/VCR的增殖，提高機體免疫力

2、，引起腫瘤細胞凋亡，導(dǎo) 致腫瘤生長受到抑制。然而，針對人參皂音Rh2對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的實驗研究，目前尚無研究報道。目前，體外研究腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力主要采用Transwell實驗。Transwell實驗通過檢測體外腫瘤細胞的遷移和侵襲能力來判 斷腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力的高低。本研究擬采用Transwell實驗檢測人參皂音Rh2對體外結(jié)腸癌LoVo細胞的遷移和侵襲能力的影響， 并初步探討其分子機制，現(xiàn)報道如下。1材料與方法1.1 細胞和試劑人結(jié)腸癌細胞LoVo株由香港科技大學(xué)贈送；Rh2購自上海雅吉生物科技有限公司(CatNo.A0241 ,純度大于982.6mg/g),溶于 二甲基亞碉（DMSO中配成10

3、mmol/L母液分裝凍存?zhèn)溆?；四甲基?氮嚏鹽（MTT）購自美國Sigma公司；胎牛血清、液體培養(yǎng)基 RPMI-1640和細胞培養(yǎng)用2.5g/L胰酶購自美國Gibco公司；膠原預(yù) 包被的 Transwell（CatNo.3422） 購自美國 Corning 公司；兔抗人 -Tubulin（BM1453）、-catenin（BA0426） 、CD44（BA0321）基質(zhì)金 屬蛋白酶 MMP2（BA3716）基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑J TIMP2（BA0576-2） 和E-Cadherin（BA0475-2）抗體均購自武漢博士德生物工程有限公 司。1.2 主要儀器BoxunSW-CJ-2F型雙人雙面凈

4、化工作臺（中國上海博迅實業(yè)有 限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;ThermoFisherScientific 細胞培養(yǎng)箱（美國 賽默飛世爾科技公司）;MoticAE2000倒置顯微鏡（中國麥克奧迪實 業(yè)集團有限公司）;IX71 熒光顯微鏡（日本 Olympus公 司）;iMark680 酶標儀（美國Bio-Rad公司）;Bio-Rad 電泳轉(zhuǎn)膜儀 （美國Bio-Rad公司）等。1.3 MTT法測定不同濃度Rh2對LoVo細胞增殖的影響5103/孔LoVo細胞接種 于96孔板內(nèi)，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，加入 0、5、10、20、40、 60mol/LRh2分別處理24、48、72h,每個濃度做6個平行孔，采 用酶

5、聯(lián)免疫檢測儀于 490nm處測取每孔的吸光度（D）值。1.4 Rh2 對 LoVo細胞遷移的影響將細胞密度為5105個/mL的LoVo細胞鋪于 24孔板（每孔500L）上，加入含體積分數(shù)10%臺牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)1624h,使形成單層細胞，換成無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過夜；用200L移液槍槍頭在單層細胞上呈一字劃痕，用磷酸 鹽緩沖液（PBS）清洗3次；加入5、10、20、40、60mol/L無血清培 養(yǎng)基配制Rh2溶液，平行2個樣本，孵育24h,在倒置熒光顯微鏡 下觀察并拍照。最后通過計數(shù)爬入一字劃痕空白區(qū)域內(nèi)的細胞數(shù) 來反映細胞的遷移能力。1.5 Rh2對LoVo細胞轉(zhuǎn)移的影

6、響待測細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌1次；用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為 2105/mL,在24孔板（下室）加入600L含體積分數(shù)15燦清的培養(yǎng) 基;上室用70L無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)箱孵育 3min,吸棄培養(yǎng)基后加入 經(jīng)過不同濃度的人參皂音 Rh2處理的100L細胞懸液；繼續(xù)在孵箱 培養(yǎng)24h,用鏡子小心取出chamber,吸干上室液體，移到預(yù)先加 入約800L甲醇的孔中；室溫固定30min,取出chamber,吸干上室 固定液，移到預(yù)先加入約800LGiemsa染液的孔中；室溫染色30min, 輕輕用PBS沖洗浸泡數(shù)次，取出chamber,吸去上室液體，

7、用濕棉 棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞，用小鏡子小心揭下膜，底 面朝上晾干；移至載玻片上，顯微鏡下隨機取9個大小一致的視野 計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果。最后通過計數(shù)穿膜細胞數(shù)來反映細胞的轉(zhuǎn)移能 力。1.6 Westernblot 檢測CD44 MMP2TIMP2、ECadherin 和-catenin 表達具體方法參 見文獻，對Rh2處理后的細胞進行裂解提取蛋白，經(jīng)十二烷基硫 酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印好的聚偏 二氟乙烯（PVDF）膜封閉后依次加入相應(yīng)一抗和二抗，膜入發(fā)光液中孵育后，用化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)對圖像進行掃描，最后對蛋 白條帶進行灰度值分析。1.7 統(tǒng)計方法應(yīng)用S

8、PSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)標準 差(xs)表示，兩組之間的比較采用t檢驗法分析；多組間的比較采 用單因數(shù)方差分析法分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗法分析。 按=0.05水平，以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1 Rh2對LoVo細胞活性的影響為了排除藥物的細胞毒性或細胞增殖作用對遷移和轉(zhuǎn)移功能 的影響，首先采用MTT法檢測不同濃度 Rh2對LoVo細胞生長的影 響。表1結(jié)果顯示：與空白對照組比較，采用濃度為5、10、20、40mol/LRh2處理LoVo細胞24h后，細胞生長無明顯抑制， 差異無 統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)Rh2濃度mol/L處理24h、濃度 mol

9、/L處理48h、 濃度mol/L處理72h時，LoVo細胞生長明顯受到抑制，差異有統(tǒng) 計學(xué)意義(P0.05或P0.01),提示人參皂音 Rh2對LoVo細胞活力 的影響有時間和濃度依賴性。所以在后續(xù)實驗中，把 Rh2作用濃 度控制在40mol/L以內(nèi)，作用時間為24h進行研究。2.2 Rh2對LoVo細胞遷移能力的影響結(jié)果顯示：560mol/L濃度Rh2對LoVo細胞遷移的影響結(jié)果， 隨著藥物濃度增加對細胞遷移能力的抑制增強，20mol/L以上濃度的Rh2處理LoVo細胞24h,與空白對照組比較有顯著抑制作用 (P0.05)。2.3 Rh2對LoVo細胞轉(zhuǎn)移功能的影響結(jié)果顯示：560mol/L

10、濃度Rh2對LoVo細胞轉(zhuǎn)移的影響，隨著藥物濃度增加對細胞轉(zhuǎn)移能力的抑制增強，20mol/L以上濃度的Rh2處理LoVo細胞24h,與空白對照組比較有顯著抑制作用 (P0.05),結(jié)果與抑制遷移能力一致。2.4 Rh2 對 CD44 MMP-2TIMP-2、E-Cadherin、-catenin 蛋白表達的影響560mol/L的Rh2對各蛋白表達的影響，隨著Rh2藥物濃度的 升高，與空白對照組比較，CD44 MMP清白表達水平顯著下降(P0.05) , TIMP2、E-Cadherin、-catenin 蛋白表達水平顯著上升 (P0.05)。3討論結(jié)腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，晚期治療效果不

11、佳，惡 性腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是最終導(dǎo)致患者死亡的主要原因。人參皂 音Rh2單體能抑制癌細胞生長并誘導(dǎo)其凋亡，逆轉(zhuǎn)其異常分化， 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移能力，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用能提高療效、減少副作 用。本研究結(jié)果顯示：一定濃度的人參皂音Rh2能顯著抑制LoVo細胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力，且抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強， 結(jié)果與陶麗華、樸麗花、Kim和姚興軍等關(guān)于人參皂音 Rh2能顯著 抑制腫瘤細胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力的報道相一致。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移 能力與腫瘤細胞內(nèi)異常表達的某些分子密切相關(guān)。-catenin 和E-Cadherin基因介導(dǎo)細胞與細胞之間的黏附，與細胞黏附分子 CD44相互作用，它們的低表達有助于腫瘤

12、細胞的擴散和轉(zhuǎn)移 18-20。而細胞基底膜的降解是腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的重要因素，基質(zhì) 金屬蛋白酶(MMPs舊組織抑制因子(TIMP)的平衡對維持細胞基底膜的完整具有重要作用。上調(diào) -catenin、E-Cadherin基因表達，促進細胞黏附，下調(diào) MMP并同時上調(diào)TIMP2基因表達，阻止細胞外基質(zhì)的降解，并進而降低與腫瘤遠處轉(zhuǎn)移黏附分子 CD44基因的 表達，可以起到抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的作用。惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性之一就是腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移，惡 性腫瘤從原位增殖性病變發(fā)展到侵襲、轉(zhuǎn)移等復(fù)雜過程，其與降 解酶類、黏附分子、癌細胞運動能力及其受體等多種原因都分不 開，細胞外基質(zhì)的降解、基底膜完整性的破壞

13、，是腫瘤細胞完成 浸潤轉(zhuǎn)移的先決條件。阻止腫瘤細胞浸潤擴散的天然屏障是基底 膜，正?；啄な怯蒊V型膠原等成分構(gòu)成的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，固有 細胞不能正常通過。細胞外基質(zhì)的降解主要由蛋白水解酶來完成， 基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP是一類鋅離子依賴的細胞外蛋白水解酶，能夠降解基底膜，促進惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMPS舌性的主要調(diào)節(jié)因子是組織金屬蛋白酶抑制劑 （TIMPs） , TIMPs能夠與激活 狀態(tài)的 MMPs即TIMP2與MMP2吉合，從而能夠抑制 MMPS勺產(chǎn)生 及其活性，是腫瘤發(fā)生惡變與轉(zhuǎn)移的阻抑因素。陳磊峰等研究證 實在原發(fā)性肝癌細胞中降低 MMP的表達可以抑制肝癌細胞侵襲和 遷移。王文祥等

14、實驗結(jié)果表明 TMIP2的表達與非小細胞肺癌伴淋 巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，即伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中TMIP2的表達減弱。盧錦娥等研究說明在宮頸癌演變過程中，細胞通過TIMP2表達水平的上調(diào)從而起到抑制癌細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移特性。本研究 結(jié)果表明：隨著Rh2藥物濃度的升高，MMP21白表達水平下降， TIMP2蛋白表達水平上升，二者維持在一個相對平衡穩(wěn)定的狀態(tài)， 阻止了細胞外基質(zhì)的降解， 從而抑制了人結(jié)腸癌細胞 LoVo細胞的遷移和轉(zhuǎn)移。E-Cadherin是廣泛存在于各類上皮細胞中的鈣依賴性跨膜糖 蛋白，主要介導(dǎo)同型細胞間的黏附反應(yīng)，除具有調(diào)節(jié)胚胎組織的 發(fā)育、組織形成、參與細胞與細胞間信息傳遞交流

15、等作用外，對 促進細胞的黏附聚集、維持上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性、維持細胞極性 和參與分化調(diào)節(jié)也至關(guān)重要。E-Cadherin在腫瘤細胞中的表達缺失使細胞間的同質(zhì)黏附力下降，導(dǎo)致腫瘤易于擴散和轉(zhuǎn)移。包俊 杰等通過實驗發(fā)現(xiàn)，從正常乳腺組織發(fā)展到乳腺癌組織再到腋窩 轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織的過程中，E-Cadherin表達逐漸減少。翁密霞等 也通過實驗結(jié)果表明，ECadherin的下調(diào)與缺失和非小細胞型肺癌 的進展、分化及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。吳繼鋒等的研究結(jié)果顯示， E-Cadherin表達與腫瘤的類型及分化有關(guān)，惡性程度越高、分化 越差的腫瘤其E-Cadherin喪失越明顯。本研究結(jié)果表明：E-Cadherin蛋白表達

16、水平與 Rh2藥物濃度呈正相關(guān)，也證明了 Rh2 在抑制人結(jié)腸癌細胞 LoVo細胞的遷移和轉(zhuǎn)移方面的作用。-catenin主要位于細胞膜，主要功能為介導(dǎo)細胞間黏附和參 與基因的表達。李進展等研究發(fā)現(xiàn)，-catenin 在胃癌組織中的低表達率提示其與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，而E-Cadherin與-catenin的正相關(guān)表達與協(xié)同作用提示了它們在腫瘤惡性轉(zhuǎn)移中的意義。本研究結(jié)果中，隨著Rh2藥物濃度的升高，E-Cadherin與-catenin 的表達也呈正相關(guān)性的增長， 為Rh2抑制人結(jié)腸癌LoVo細胞的遷 移和轉(zhuǎn)移提示重要意義。CD44分子作為一種細胞表面跨膜糖蛋白的黏附分子，分布十 分廣泛。其主

17、要參與細胞間及細胞與基質(zhì)間的特異性粘連過程，在細胞的黏附、血管的形成和腫瘤的浸潤和增殖中發(fā)揮重要作用姚杰等通過對肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中CD44的表達狀態(tài)的研究,發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶CD44表達與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié) CD44表達呈正相關(guān)，提示患者 肺癌病灶中的腫瘤干細胞標記物 CD44表達越高，其發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移 的風(fēng)險也就越高。本研究結(jié)果中，CD44蛋白表達水平隨著 Rh2藥物濃度的升高而下降，再次驗證了Rh2在抑制人結(jié)腸癌細胞 LoVo細胞的遷移和轉(zhuǎn)移方面的作用。近年來，不止一種中藥成方或中藥單體被用于研究其對人結(jié) 腸癌細胞LoVo細胞侵襲或轉(zhuǎn)移能力的影響，例如安昌勇等研究證實了柳皮素對人結(jié)腸癌細胞 LoVo細胞處理48h后，LoVo細胞增殖、 侵襲能力受到明顯抑制，其半數(shù)