pcr擴(kuò)增的原理和步驟以及常見問(wèn)題

1、PCR實(shí)驗(yàn)原理及步驟PCR又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核甘酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。實(shí)驗(yàn)方法原理模板DNA勺變性：模板DNAS加熱至94c左右一定時(shí)間后，使模 板DN敏鏈或經(jīng)PCFT增形成的雙鏈DNAS離，使之成為單鏈，以 便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；模板DNAW引物的退火（復(fù)性）：模板DNAS加熱變性成單鏈后，溫度降至55c左右，引物與模板DNAI鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNAJI板一引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成 一

2、條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制 鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。PCR反應(yīng)體系10 X擴(kuò)增緩沖液10 ul4種dNTP昆合物各 200 umol/L弓I物各10100 pmol模板DNA0.12 ugTaq DNA聚合酶 2.5 uMg2+1.5 mmol/L加雙或三蒸水至100 ul模板制備(1) PCR勺模板可以是DNA也可以是RNA(2)模板的取材主要依據(jù)PCR勺擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病 毒、細(xì)菌、真菌等。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、

3、血液、羊水細(xì) 胞等。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。(3)標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDSffi蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶 菌酶加EDTA#理。所得到的粗制DNA經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用 乙醇沉淀后用作PCR5應(yīng)模板。PCR反應(yīng)條件控制1. PCR5應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子。2. 鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTP用)濃度高，常用1.5 mmol/L3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20200 umol/L 。4. TaqDN螺合酶 2.5U(100 ul )。5. 引物 濃度一般為0.10.5 umol/L 。6. 反應(yīng)溫度(1

4、)變性溫度和時(shí)間95C, 30 s。(2)退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 C左右，一般在4555 Co(3)延伸溫度和時(shí)間72C, 1 min/kb(10 kb 內(nèi))。(4) TmH =4(G+C) +2(A+T)7. 循環(huán)次數(shù)：一般為2530次。循環(huán)數(shù)決定PCFT增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過(guò) 30個(gè)以后，DN膘合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù) 的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。PCR技術(shù)具有高度的特異性、 選擇性、靈敏性，而且快速、簡(jiǎn)便、 易于自動(dòng)化，同時(shí)受到許多條件因素的影響，所

5、以要做得好也不 容易。在PCR技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中會(huì)遇到這樣或那樣的問(wèn)題，更甚至 會(huì)得到與事實(shí)完成相反的結(jié)果。一、 假陽(yáng)性擴(kuò)增在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有時(shí)會(huì)碰到所檢驗(yàn)的樣本全部陽(yáng)性，而且擴(kuò)增產(chǎn)物 電泳條帶亮度均一，這是擴(kuò)增系統(tǒng)受到污染時(shí)最典型的一種表現(xiàn)， 需仔細(xì)檢查，排除污染源，一般應(yīng)從以下步驟著手：1 .試劑污染：廠方提供的試劑或其中的某種組分在出廠或運(yùn)輸、貯存過(guò)程中受到污染。檢測(cè)方法，可按試劑盒說(shuō)明書將試劑分裝好，直接置于PCR儀中擴(kuò)增（不加陰性對(duì)照，可加適量蒸儲(chǔ)水），便可簡(jiǎn)單而 有效地判斷試劑是否已受到污染。2 .實(shí)驗(yàn)室污染：這是最常見的污染源，由于 PCR技術(shù)可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)將模板中 某些特異性序列擴(kuò)增

6、到數(shù)百萬(wàn)倍以上，擴(kuò)弗產(chǎn)物可能在電泳等過(guò) 程中污染移液器、操作臺(tái)或隨著蒸發(fā)所形成氣溶膠而污染整個(gè)實(shí) 驗(yàn)室。擴(kuò)增產(chǎn)物又是最有效的模板，一旦出現(xiàn)產(chǎn)物污染其污染程 度都較嚴(yán)重。判斷方法：可以將實(shí)驗(yàn)中最關(guān)鍵步驟如試劑分裝、樣品處理等轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的環(huán)境中或轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)中完成。當(dāng) 然，所用的移液器、吸咀管（離心管）都應(yīng)徹底更換。解決方法：實(shí)驗(yàn)室污染是 PCR擴(kuò)增過(guò)程中最易出現(xiàn)的現(xiàn)象，而且一旦出現(xiàn)污染，消除污染源又極其困難，往往需對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)器材徹 底清洗處理，所以應(yīng)該以預(yù)防為主，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)基本要求，樣品處理與擴(kuò)增產(chǎn)物及電泳應(yīng)盡量分開，最好能在兩個(gè) 房間進(jìn)行。擴(kuò)增前處理所用的移液器及擴(kuò)增

7、后點(diǎn)樣用的移液器應(yīng) 嚴(yán)格地分開，不可互換。PCR室應(yīng)保持良好的通風(fēng)、清潔、最好能專用。3 .采樣污染：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一批結(jié)果陽(yáng)性率很高，一批結(jié)果陽(yáng)性率又下降很多，如此反復(fù)，這種現(xiàn)象大都是由于采樣時(shí)污染所致， 一般來(lái)講正規(guī)試劑生產(chǎn)廠家，具試劑出廠時(shí)都要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量 檢測(cè)、批間，特別是批內(nèi)差異都極小， 不致出現(xiàn)如此明顯的反復(fù)， 這種現(xiàn)象主要是由于收集樣本的試管或吸管受到污染所致。PCR擴(kuò)增非常敏感，而一般實(shí)驗(yàn)室對(duì)重復(fù)使用的試管所進(jìn)行的洗滌方 法往注不能去除痕量 DNA ,這些痕量DNA便成為PCR模板，出 現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，由于采樣試管受污染程度不一，所以出現(xiàn)忽高 忽低的現(xiàn)象解決方法建議

8、使用一次試管及吸咀取樣。二、假陰性擴(kuò)增：如果連續(xù)幾次擴(kuò)增結(jié)果都是陰性，或已知陽(yáng)性樣本出現(xiàn)陰性擴(kuò)增結(jié)果，一般認(rèn)為這是假陰性，出現(xiàn)這現(xiàn)象有以下幾種原因：1 .儀器故障：出現(xiàn)全陰結(jié)果，首先考慮到儀器運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常。正確判斷儀器的工作狀況，是排除假陰性其它原因的基礎(chǔ)，儀器運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常是PCR擴(kuò)增最關(guān)鍵的步聚之一。判斷儀器是否正常，首先要測(cè)定加 熱體的溫度是否準(zhǔn)確，波動(dòng)范圍是否答合要求，各孔之間差異是 否符合要求，PCR擴(kuò)增往往對(duì)儀器加熱溫度及各管間的差異要求 有很高的精度，如果誤差太大，勢(shì)必出現(xiàn)假陰性。必須注意的是不 能過(guò)信名牌，我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些名牌機(jī)器溫度差異高達(dá)二度以上。2 .試劑失效或無(wú)效：了解機(jī)器是否正常，便可對(duì)試劑進(jìn)行檢測(cè)。首先要了解試劑是否超過(guò)有效期，試存放方法是否達(dá)到要求， 如果試劑盒在有效期內(nèi)， 貯存方法是正確，那么就應(yīng)該仔細(xì)、慎重地判斷試劑