HPLC法測(cè)定物質(zhì)時(shí)已知雜質(zhì)的計(jì)算方法

1、HPLC法測(cè)定物質(zhì)時(shí)雜質(zhì)的計(jì)算方法制藥技術(shù)聯(lián)盟凱博思KEYBOS 6月17日根據(jù)藥品注冊(cè)的國際技術(shù)耍求(ICH)中雜質(zhì)的含義,雜質(zhì)分為有機(jī)雜質(zhì).無機(jī)雜質(zhì)和殘留溶劑. 有關(guān)物質(zhì)是雜質(zhì)的一種,主耍是指有機(jī)雜質(zhì).它的檢查方法很多,而其中的HPLC法具有專屬性 強(qiáng)、別離效果好.靈敏度高.分析速度快、重復(fù)性好、操作簡便等諸多優(yōu)點(diǎn),11能與多種類型 檢測(cè)器聯(lián)合應(yīng)用,能滿足大多數(shù)化合物種類的檢測(cè)需要,比擬符合有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)雜質(zhì)含量低. 種類多的特點(diǎn).HPLC法測(cè)定有關(guān)物質(zhì)中己知雜質(zhì)的測(cè)定方法很多,計(jì)算方法也相應(yīng)很多,每種計(jì)算方法都有不 同的意義及其優(yōu)缺點(diǎn),下面參考國內(nèi)外藥品標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)期刊文獻(xiàn),結(jié)合在藥品檢驗(yàn)

2、中的實(shí)際工 作,對(duì)這些計(jì)算方法作一簡單探討,以期為藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立或進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)對(duì)有關(guān)物質(zhì) 檢查中己知雜質(zhì)的計(jì)算方法的選擇提供借鑒和參考.表1是各種計(jì)算方法的計(jì)算公式及其主耍 優(yōu)缺點(diǎn).1面積歸一化法優(yōu)缺點(diǎn)：具有與稱樣量及進(jìn)樣量根本不相關(guān)的特點(diǎn),因此重復(fù)性和巫現(xiàn)性均良好,不需要折算,降低了 實(shí)驗(yàn)中對(duì)稱樣量精密度的耍求,降低了檢驗(yàn)本錢,操作更加簡便.快捷,省去了計(jì)算過程.但當(dāng)雜質(zhì)是微量的時(shí)候需増加方法的靈敬度,就耍增加進(jìn)樣量,此時(shí)主成分可能超出儀器檢測(cè) 范圍,或雖然在儀器檢測(cè)范圍內(nèi),理論上講此時(shí)可能與主成分不在同一線性范圍內(nèi).正是由于各雜質(zhì)的響應(yīng)因子不同.含量較低和需耍較寬的線性范圍等因素的影

3、響,?中國藥典? 2005年版二部附錄中特別強(qiáng)調(diào)本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量.除另有規(guī)定 外,一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查這也在一定程度上限制了本法的使用.2.1不加校正因子的主成分口身對(duì)照法此方法是現(xiàn)行版?中國藥典?和其他國家藥品標(biāo)準(zhǔn)及藥品研發(fā)時(shí)制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用最多. 最廣泛的有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法和計(jì)算方法.方法介紹：本法是配制一個(gè)濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)墓┰嚻啡芤鹤鳛閷?duì)照溶液,一般是由供試品溶液直接稀 釋得到.本法不需要雜質(zhì)對(duì)照品當(dāng)無法獲得雜質(zhì)對(duì)照品時(shí)可采用不加校正因子的主成分自身 對(duì)照法來計(jì)算雜質(zhì)的含量.同面積歸一化一樣,本法也是在假定供試品溶液中所有成分均出峰、 所有雜質(zhì)均與

4、主成分別離且各雜質(zhì)和主成分的響應(yīng)因子均相同的前提下進(jìn)行的.優(yōu)缺點(diǎn)：同面積歸一化一樣,本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、運(yùn)算方便,無需雜質(zhì)對(duì)照品;缺點(diǎn)是忽略了各雜質(zhì) 與主成分的響應(yīng)因子可能不同的事實(shí)導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)測(cè)得的雜質(zhì)含量可能與真正的雜質(zhì)含量不一 致.此外,不加校正因子的主成分自身對(duì)照法會(huì)存在稀釋步驟、進(jìn)樣針和進(jìn)樣閥殘留、進(jìn)樣誤差等 影響因素,往往也會(huì)導(dǎo)致計(jì)算出的雜質(zhì)與真實(shí)含量之間存在一定的誤差；但不加校正因子的主 成分口身對(duì)照法可以解決面積歸一化法中可能出現(xiàn)的儀器檢測(cè)范圍和線性范圍問題.2.2加校正因子的主成分口身對(duì)照法目前在國內(nèi)應(yīng)用較少,但在國外藥品標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用比擬廣泛.方法介紹：該方法的操作步驟根本與2

5、.1相同,唯一不同的是在計(jì)算時(shí)把雜質(zhì)相當(dāng)于主成分的響應(yīng)因子考 慮進(jìn)去.本法相當(dāng)于一個(gè)簡化的內(nèi)標(biāo)法,同時(shí)也是對(duì)雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法的簡化,即在研究方法學(xué) 時(shí),利用雜質(zhì)對(duì)照品和主成分對(duì)照品,分別測(cè)定雜質(zhì)和主成分的線性方程,以斜率之比計(jì)算雜 質(zhì)相對(duì)于主成分的校正因子,此校正因子可直接載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中,在常規(guī)檢驗(yàn)時(shí)用以校正該雜 質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積.在實(shí)際測(cè)定時(shí),可釆用相對(duì)保存時(shí)間進(jìn)行雜質(zhì)定位.優(yōu)缺點(diǎn)：此法的優(yōu)點(diǎn)是在日常檢驗(yàn)中省去了雜質(zhì)對(duì)照品特別是在雜質(zhì)不夠穩(wěn)定或?qū)砉┙o有困難時(shí)顯 得尤其重要,同時(shí)又考慮到了雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子可能不同所引起的測(cè)定誤差;缺點(diǎn)是相 對(duì)保存時(shí)間在不同實(shí)驗(yàn)室間可能有所波動(dòng)特別是當(dāng)供試

6、品中存在多個(gè)雜質(zhì)而又別離不好時(shí)可 能造成雜質(zhì)定位困難.需耍指岀的是,如果己知雜質(zhì)對(duì)主成分的相對(duì)響應(yīng)因子超出091.1 范圍時(shí),宜用加校正因子的主成分口身對(duì)照法或雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法法進(jìn)行計(jì)算.3主成分對(duì)照品外標(biāo)法?美國藥典?多采用加校正因子或不加校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法來對(duì)己知雜質(zhì)進(jìn)行計(jì)算. 方法介紹：主成分對(duì)照品外標(biāo)法包括加不校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法和加校正因子的主成分對(duì)照品外 標(biāo)法.操作、計(jì)算分別與不加校正因子和加校正因子的主成分口身對(duì)照法根本一樣,唯一不同 的是前者耍用主成分對(duì)照品制備一個(gè)濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照品溶液,后者是由供 試品溶液直接稀釋得到一個(gè)濃度與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)?/p>

7、溶液作為對(duì)照溶液.優(yōu)缺點(diǎn)：由于主成分對(duì)照品是經(jīng)過標(biāo)定的,其純度或量值會(huì)比擬準(zhǔn)確,而制劑中主成分的實(shí)際含量與標(biāo) 示量有時(shí)會(huì)不完全一致,因此采用對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算出的雜質(zhì)的實(shí)際絕對(duì)含量要比口身對(duì)照法 準(zhǔn)確一些.當(dāng)然,由于本法耍使用主成分對(duì)照品,從而導(dǎo)致操作本錢會(huì)提升一些,操作過程會(huì)繁 瑣一些.4雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法方法介紹：雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法要求提供一定純度的雜質(zhì)對(duì)照品,分析時(shí)需制備一個(gè)濃度應(yīng)與雜質(zhì)限度相當(dāng) 的溶液作為雜質(zhì)對(duì)照品溶液.由于雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法可以解決上述幾種測(cè)定方法和計(jì)算方法存 在的種種問題,特別是雜質(zhì)與主成分響應(yīng)不一致的問題,因此,本法能反映藥品中該雜質(zhì)的真 實(shí)含量.優(yōu)缺點(diǎn)：如果雜質(zhì)對(duì)照品容

8、易獲得并能持續(xù)供給,建議在有關(guān)物質(zhì)檢查中己知雜質(zhì)的測(cè)定和計(jì)算時(shí)存選 該法,特別是當(dāng)該雜質(zhì)與主成分的相對(duì)響應(yīng)因子相差較大超出09范圍或該雜質(zhì)有毒副 作用時(shí),歐美藥典中采用此法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)計(jì)算的品種也不在少數(shù).雖然雜質(zhì)對(duì)照品的獲得和供給比擬困難,在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中是否引入雜質(zhì)對(duì)照品應(yīng)權(quán)衡并慎重, 但由于該法能真實(shí)反映藥品中某一雜質(zhì)的含量,因此采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法應(yīng)該是今后有關(guān)物 質(zhì)檢查時(shí)努力的方向.5加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法方法介紹：加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法其實(shí)也是雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法的一種.本法的操作方法與測(cè)定方 法同雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法一樣,不同的是在計(jì)算公式中多乘以一個(gè)轉(zhuǎn)換因子,其意義就是把樣

9、品 中某一雜質(zhì)的含量轉(zhuǎn)換成相當(dāng)于主成分本身的重量百分比水平.假設(shè)某一制劑的標(biāo)示量為100 mg,采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算出某一雜質(zhì)的含量為主成分的 1.0%z假設(shè)該雜質(zhì)與主成分的分子量之比為1：2,那么按加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算出的 該雜質(zhì)的含量為2.0%,即該雜質(zhì)的真實(shí)含量為l.Omg,但通過分子量之比換算成相當(dāng)于主成分 的含量為2.0mgo優(yōu)缺點(diǎn)：結(jié)果較準(zhǔn)確.但由于雜質(zhì)的分子量可能大于或小于主成分的分子量即主成分的分子量/雜質(zhì)的 分子量可能小于1或大于it因此采用本法計(jì)算出的某一雜質(zhì)的含量結(jié)果也可能比面積歸一化 法、主成分自身對(duì)照法.主成分對(duì)照品外標(biāo)法和雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法計(jì)算出的結(jié)果

10、偏低或偏高.6加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法方法介紹：加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法其實(shí)也是主成分對(duì)照品外標(biāo)法的一種,就是在加 校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法的根底上乘以轉(zhuǎn)換因子.優(yōu)缺點(diǎn)：其操作和優(yōu)缺點(diǎn)與加校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法一樣,其意義與加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對(duì)照品 外標(biāo)法一樣,也是通過雜質(zhì)和主成分分子量之比的換算把該雜質(zhì)的含量轉(zhuǎn)換成相當(dāng)于主成分本 身的百分比水平.7內(nèi)標(biāo)法方法介紹：按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,分別精密量収含有一定濃度內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的對(duì)照品溶液和供試品溶液,注入 液相色譜儀記錄色譜圖,測(cè)定對(duì)照品溶液中對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積及供試品溶液中待測(cè) 成分這里指待測(cè)雜質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物

11、質(zhì)的峰面積,根據(jù)表1中的公式計(jì)算雜質(zhì)的含量.優(yōu)缺點(diǎn)：內(nèi)標(biāo)法主耍是為了解決儀器進(jìn)樣精密度和藥物中所含成分的回收率的問題,這種方法可以抵消 儀器和過程帶來的誤差.但在以常圧六通閥定量環(huán)進(jìn)樣和回收率己經(jīng)驗(yàn)證的情況下,意義己不 大,加之內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇比擬困難,內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的添加會(huì)導(dǎo)致別離難度的增大,操作過程更加煩 瑣等問題,本法己經(jīng)使用很少.現(xiàn)舉例說明不同計(jì)算方法對(duì)HPLC法測(cè)定有關(guān)物質(zhì)中己知雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果的影響.抗髙血圧藥q來 酸依那普利片中有關(guān)物質(zhì)的計(jì)算方法.?中國藥典?2005年版二部中所有雜質(zhì)包括雜質(zhì)依那普利拉和依那普利雙酮采用的均是 不加校正因子的主成分自身對(duì)照法；?英國藥典?2021年版中雜質(zhì)依那普利拉和依那普利雙酮采用的是雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法,其 他雜質(zhì)采用的是不加校正因子的主成分口身對(duì)照法；?英國藥典?31版中雜質(zhì)依那普利拉采用的是加轉(zhuǎn)換因子的雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法,依那普利 雙酮采用的是加轉(zhuǎn)換因子和校正因子的主成分對(duì)照品外標(biāo)法,其他雜質(zhì)釆用的是不加校正因子 的主成分對(duì)照品外標(biāo)法.由于不同計(jì)算方法所表示的意義不同,所以得出的結(jié)果也不相同.表2就是某企業(yè)生產(chǎn)的q來 酸依那普利片,按上述不同計(jì)算方法得出的雜質(zhì)的含量結(jié)果.由表