影響PCR的主要因素

1、影響PCR的主要因素PCF術(shù)必須有人工合成的合理引物和提取的樣品DNA然后才進行自動熱循環(huán)，最后進行產(chǎn)物鑒定與分析。引物設(shè)計與合成目前只能在少數(shù)技術(shù)力量較強的研究院、所進行，臨床應(yīng)用只需購買PCR金測試劑盒就可開展工作,PCR自動熱循環(huán)中影響因素很多，對不同的DNA羊品，PCR反應(yīng)中各種成份加入量和溫度循環(huán)參疝云一致?，F(xiàn)將幾種主要影響因素介紹如下。一、溫度循環(huán)參數(shù)在PCR自動熱循環(huán)中，最關(guān)鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作范例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94C60s, 37C60s, 72C 120s，共2530個循環(huán)，擴增片段500bp。在這里，每一步的時間應(yīng)從反應(yīng)混合液達到所 要求的

2、溫度后開始計算。在自動熱循環(huán)儀內(nèi)由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要3060s,這一退滯時間的長短取決于幾個因素，包括反應(yīng)管類型、壁厚、反應(yīng)混合液體積、熱源(水浴或加熱塊)以及兩步驟間的溫度差， 在設(shè)置熱循環(huán)時應(yīng)充分給以重視和考慮，對每一儀器均應(yīng)進行實測。關(guān)于熱循環(huán)時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長，前 文給出的反應(yīng)時間是按最適于合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。1.模板變性溫度變性溫度是決定PC版應(yīng)中雙鏈DNAB鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA莫板，PC趾就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNAa鏈

3、會很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取9095Co樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNAe性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應(yīng)盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過95C。2.引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37 C反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度。也可根據(jù)引物的(G+C炳量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度Ta(annealing

4、temperature)比擴增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5C,可按公式進行計算：Ta = Tm - 5 C = 4(G+C)+ 2(A+T)- 5 C其中A, T, G C分別表示相應(yīng)堿基的個數(shù)。例如，20個堿基的引物，如果(G+C %念量為50%時，貝U Ta的起點可設(shè)在55C。在典型的引物濃度時(如0.2 mol/L )，退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長時間退火沒有必要。3.引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度。一般取7075C ,在72 C時酶催化核昔酸的標準速率可達35100個核昔酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長度，其速度取決于緩沖溶液

5、的組成、pH值、鹽濃度與DNA莫板的性質(zhì)。擴增片段如短于150bp,則可省略延伸這一步，而成為雙溫循環(huán)，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對于100300bp之間的短序列片段， 采用快速、簡便的雙溫循環(huán)是行之有效的。此時，引物延伸溫度與退火溫度相同。對于1kb以上的DN喝段，可根據(jù)片段長度將延伸時間控制在17min,與此同時，在PCR沖液中需加入明膠或BSA試劑，使Taq DN麻合酶在長時間內(nèi)保持良好的活性與穩(wěn)定性；15吩20%勺甘油有助于擴增2.5kb左右或較長DNA段。4.循環(huán)次數(shù)常規(guī)PC般為2540個周期。一般的錯誤是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴重，復(fù)雜度增加。 當

6、然循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。所以，在保證產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。擴增結(jié)束后，樣品冷卻并置4C保存。二、引物引物設(shè)計要擴增模板DNA首先要設(shè)計兩條寡核昔酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶DN昕列互補的寡核背酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5端決定擴增產(chǎn)物的兩個5末端位置。由此可見，引物是決定PCFT增片段長度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計也就更為重要。引物設(shè)計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為1520個堿基，可以用DNA合成儀合成與其對應(yīng)互補的二條引物，除此之外，引物設(shè)計一般遵循的原則包 括：1

7、.引物長度根據(jù)統(tǒng)計學(xué)計算， 長約17個堿基的寡核昔酸序列在人的 基因組中可能出現(xiàn)的機率的為1次。因此, 引物長度一般最低不少于16個核昔酸，而最高不超過30個核昔酸，最佳長度為2024個核昔酸。這樣短的寡核 昔酸在聚合反應(yīng)溫度(通過72C)下不會形成穩(wěn)定的雜合體。有時可在5端添加不與模板互補的序列，如限制性 酶切位點或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5端生物素標記或熒光標記可用于微生物檢測等 各種目的。有時引物不起作用，理由不明，可移動位置來解決。2.(G+C%念量引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個引物中(G+C %量應(yīng)盡量相似，在已知擴增片段(G+C垢量時宜接

8、近于待擴增片段，一般以40% 60溶佳。3.引物內(nèi)部應(yīng)避免內(nèi)部形成明顯的次級結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin structures)。例如：4.引物之間兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補，特別是在引物3端，即使無法避免，其3端互補堿基也不應(yīng)大于2個堿基，否則易生成引物二聚體”或引物二倍體(Primer dimer)。所謂引物二聚體實質(zhì)上是在DN麻合 酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈DNA片段，是PC見的副產(chǎn)品，有時甚至成為主要產(chǎn)物。另外，兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續(xù)6個以上相同堿基的寡核昔酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣，引物與待

9、擴增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上堿基的同源序列。否則，引物就會與其它位點結(jié)合，使特異擴增減少，非特異擴增增加。5.引物3端配對DN成合酶是在引物3端添加單核昔酸， 所以，引物3端56個堿基與靶DNA勺配對要 求必須精確和嚴格，這樣才能保證PCR有效擴增。引物設(shè)計是否合理可用PCRDES嗽件和美國PRIME啾件進行計算機檢索來核定。人工合成的寡核昔酸引于最好經(jīng)過 此(層析)純化或PAGE屯化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì)。純 化引物在25宜睛溶液中4C保存可阻止微生物的生長；一般情況下，不用的引物應(yīng)保存在-20C冰箱中，在液體中引物能保存6個月，凍干后可保存12年。三、D

10、N麻合酶早在1956年Kornberg等就從大腸桿菌提取液中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶，并且得到了DN成合酶I純品。DNA合酶I是由分子量為109000的一條多肽鏈構(gòu)成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解為兩個片段，一個片段分子量為76000,有聚合酶活性，并有3 5外切酶活力，即Klenow片段(Klenow fragment )。另一個片段分子量為34000,具有5 ： 3外切酶活力。因此，DN成合酶具有幾種功能：一是聚合作用，以DNA為模板，將dNTP中的脫氧單核昔酸逐個加到3-OH末端。二是有35，外切酶活力，能識別和消除錯配的引物末端，與復(fù)制過程中校正功能有關(guān)。三是53外切酶活力，它能從5端水解核昔

11、酸，還能經(jīng)過幾個核昔酸起作用，切除錯配的核昔酸。1985年Mullis等發(fā)明了PCR方法，以Klenow片段完成3-珠蛋白的PCR，世界上許多實驗室就考慮用耐熱DN麻合酶代替Klenow片段進行PCR使耐熱多聚酶的研究得以迅速發(fā)展。人們從生活于60C（B.Stearothermophilus）到87C（S.Solfatavicus ）的許多菌中分離純化出耐熱DNA聚合酶，但有些酶不能耐受DNA變性所需溫度，所以無法應(yīng)用于PCR現(xiàn)就PCR反應(yīng)中常用的DNAM合酶等作一詳細介紹。1.Taq DN麻合酶用Taq DNAM合酶代替大腸桿菌DN麻合酶I的Klenow片段是使PC麗及應(yīng)用的關(guān)鍵。Kleno

12、w片段不能耐受95C的雙鏈DN/性溫度，所以每次循環(huán)都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受9395C的高 溫，避免了不斷補加多聚酶的繁瑣操作，同時使退火和延伸溫度得以提高，減少了非特異性產(chǎn)物和DNAT級結(jié)構(gòu)對PCR勺干擾，增進了PCR特異性、產(chǎn)量和敏感度，二者相比，其主要區(qū)別在于：Klenow酶的最適溫度為37C,擴 增的產(chǎn)物并非全是目的序列，需用探針檢測。Taq酶則不僅產(chǎn)率高而特異性也高。它的最適溫度為7475Co因而使退火溫度可以提高，使退火嚴格性提高，減少錯配引物的延伸。循環(huán)后期酶量漸感不足而產(chǎn)生平坡。到達平玻的循環(huán)次數(shù)，Klenow酶為20個 （均用1 g基因組DNA開始） 而T

13、aq酶為30個。 延伸片段長度Taq酶為10kb以內(nèi)， 而Klenow酶為400bp以內(nèi)。Taq酶由水棲高溫菌（Thermus aquatics ） YT1蹺株中分離而得。此菌于1969年由Brock分離自美國黃石公園 溫泉，作為棲熱桿菌的標準菌株，其生長溫度為7075C。最初從中分離到分子量6068KDa比活性為20008000U/mg的DNA聚合酶。后來Cetus公司的Kary Mullis等又分離到比活為20萬U/mg的純酶，分子量為93910。此種9.4KDa酶的最適溫度為7580C，與單純核昔酸的結(jié)合率（Kcat ）可達150核昔酸（nt）/s酶分子。以M3模板，用富含G+C的30b

14、p引物延伸，70C時Kact60nt/s ; 55C可達24nt/s ; 37C時為1.5nt/s，而22C時低至0.25nt/s。高于90C時DN成活性甚差，這種高溫條件下，引物與模板已不能牢固結(jié)合。在PCR應(yīng)混合液中，Taq酶于92.5 C,95 C及97.5C保持其50嘛力的時間分別為130、40及56min ,在50次循環(huán)的PCR中當管內(nèi)最高溫度為95C。每循環(huán)為20s時尚可保持65購力。Taq酶在95C的半壽期為40min ,故在PCRB環(huán)中選用的變性溫度，不宜高于95CoTaq酶現(xiàn)已可用基因重組的方法生產(chǎn)，商品名為Ampli Taq （Cetus公司）。Taq酶的完整基因長2499

15、bp,在大腸桿菌中表達生產(chǎn)，含832個氨基酸。在氨基酸序列上與大腸桿菌DN成合酶I有38泌一致的，包括對dNTP結(jié)合，引物與模板作用區(qū)均存在于Taq酶中。Taq酶具有依賴DNA合成的53外切酶活性，因此，模板上有一段退火的3-磷酸化的“阻斷物”， 會被逐個切除而不會阻止來自上游引物鏈的延伸，而對于5 -32P標記的合成寡核昔酸引物，則無論是單鏈或是與模板復(fù)性，都未發(fā)現(xiàn)降解，所以該種活性不會影響PCR吉果。Taq酶沒有35外切酶活性，如果發(fā)生dNTP錯誤摻入，這種酶沒有校正能力，因此運用Taq酶進行PCR產(chǎn)物中點突變較多，對克隆等不太有利。一般錯摻率為1.25 X 10-41X 10-5（4 X

16、dNTPs濃度分別為200 mol/L , M&+為1.5mmol/L ,在55C退火）。但不含35外切酶活性對測序有利。2.影響酶活力的因素Taq酶的活力受M&+離子的影響。用鮮精DN網(wǎng)模板，總dNTP濃度0.70.8mmol/L,Mg2+ 為2.0mmol/L時激活能力最高。 濃度超過此值產(chǎn)生抑制。10mmol/l MgCb抑制活力達40% 50% dNTP能與M&+結(jié)合， 故游離Mc2+只是結(jié)合后剩余的量。若總dNTP度高至46mmol/L時,Taq酶活力要降低2030%即底物抑制。dNTP度低時PCRT率及特異性均增高， 適合于用擴增摻入法標記生物素及放射性元素

17、。當100 l PCR夜中含dNTP各40 mol/L時就足以合成2.6 g的DNA（ dNTP消耗一半）。表22-3有機溶劑對Taq聚合酶活力的影響物質(zhì)濃度活力（%）乙醇3%10010%110尿素0.5mol/L1001.0mol/L1181.5mol/L107DMSO1%10010%15320%11二甲基甲酰胺5%10010%8220%17甲酰胺10%10015%8620%39SDS0.001%1050.01%100.1%0.1%用鮮精DNA 70C, 10min內(nèi)dNTP的摻入量計算，標準條件為100%純9.4KDa Taq酶不含35核酸外切酶活力。誤摻入率取決于dNTP度。但Taq酶具

18、有DNAa賴的鏈移位53核酸外切酶活力。對53，32P標記寡核昔酸單鏈，或與MB莫板雜交時均只有極少的降解力。中等濃度KCl能刺激Taq酶合成活力達50%H60%最佳KCl濃度為50mmol/L,濃度更高有抑制作用，200mmol/L的KCl可使酶失活。加入50mmol/L NH4Cl或NHAc或NaCl，可產(chǎn)生中度抑制或無作用。低濃度尿素、DMSODM誠甲酰胺影響不大，吐溫20/NP40可消除SDS (0.01%及0.1%)的抑制作用。3.第二代耐熱DNA聚合酶Stoffel片段：Cetus公司的Stoffel將Taq DNA聚合酶的53外切酶活性片段(N端289個氨基酸)去除，稱為stof

19、fel片段。其97.5 C的半衰期從Taq DN成合酶的56min提高到20min,同時該酶片段也對兩個或更多模板位點的擴增反應(yīng)即復(fù)合PCR( Multiplex PCR)更為有利。VentTMDN彩聚酶：是美國New England Biolabs公司從潛水艇排氣孔(Vent)中分離的超級嗜熱菌-能生長于98C中的Thermococcus litoralis中分離純化得到的，故名Vent酶。它的一些酶學(xué)性質(zhì)較Taq DNA聚合酶更為優(yōu)越，它能耐100C高溫且2h以上仍有活力，并且具有3 5外切酶活性的校正能力，錯誤擴增的機率比Taq酶降低一倍。后來該公司又從深水潛艇(2010g排氣孔分離的能

20、在104C生長的Pyococcus菌GB-D株植入DeepVent DN成合酶基因而表達的Deep Vent DNA聚合酶，在95C的半壽期達23h (Vent酶為6.7h,Taq酶為1h)。4.RTth逆轉(zhuǎn)錄酶(rTth Reverse Transcriptase)目前逆轉(zhuǎn)錄-PCR (RT-PCR的發(fā)展很快，所以對耐熱的依賴于RNA的DNA多聚酶的研究也有進展。有實驗表明Taq DNA多聚酶有依賴于RNA的DN成合酶活性，但活性較弱。Cetus公司于1991年推出一種rTth Reverse Tran scriptase,有很好的依賴于RNA的耐熱DNA聚合酶活性和依賴 于DNA的耐熱DN

21、A聚合酶活性，二種活性分別依賴于Mn+M&+,這樣就可分別控制酶活性。利用該酶只需250ng的總RNA可有效地進行RT-PCFR得到特異的DNA片段，從而非常有利于逆轉(zhuǎn)錄PCR的發(fā)展。耐熱DN成合酶的研究近幾年來得到長足的發(fā)展，這在PCRt展中起到了重要的作用。我們相信隨著進一步的研究，將使人們對耐熱DNA聚合酶的認識和應(yīng)用更進一步地發(fā)展。我國的PCR研究發(fā)展很快，其關(guān)鍵試劑 -耐熱DN腺合酶-也已有幾個實驗室能夠分離純化，如復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué) 研究所、華美公司、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。后二者的菌株為Thermus aquaticus YT-1。前者則是從自己篩選的嗜熱菌中分離純化，

22、復(fù)旦大學(xué)遺傳所亦已成功地克隆了該聚合酶的基因并獲得了耐熱F4DNA聚合酶，其酶學(xué)性質(zhì)非常接近于Taq DNA聚合酶，為我國PCR的開展提供了保證。四、 影響PCR特異性的因素通過上述內(nèi)容?？梢钥闯鲇性S多因素可以影響PCR的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考：退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及 錯誤延伸。引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。 改變MgCb(有時KCl)濃度可以改進特異性， 這可能是提高反應(yīng)嚴格性或者對Taq酶的直接作用。模板中如果存在次級結(jié)構(gòu)，例如待擴增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，可在PCR昆合物中的4X dNTPs中加入7-脫氮-2-脫氧鳥昔-5-三磷酸(7-deaza- 2 -deoxyguanosine- 5 -trihosph