酵母雙雜交技術(shù)篩選與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì)

1、酵母雙雜交技術(shù)篩選與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì)【摘要】 目的: 尋找體內(nèi)能夠與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì),用以揭示該蛋白的功能及其在脊髓損傷修復(fù)過程中的作用.方法: 通過RTPCR技術(shù)克隆scirr1基因編碼區(qū)序列,將其克隆入pSos載體以構(gòu)建質(zhì)粒pSosscirr1. 把該重組質(zhì)粒表達的融合蛋白hSosFbxl16作為誘餌蛋白,用改良的酵母雙雜交技術(shù)篩選大鼠腦cDNA文庫中能與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì),最后用酵母雙雜交回轉(zhuǎn)實驗對獲得的相互作用的可靠性加以驗證. 結(jié)果: 成功構(gòu)建了融合蛋白表達質(zhì)粒pSosscirr1之后,篩選出了14個與Fbxl16陽性相互作用的蛋白質(zhì)；通過回轉(zhuǎn)實驗驗

2、證,確定其中兩個蛋白能與Fbxl16相互作用,分別是cAMP依賴蛋白激酶型催化亞基（protein kinase, cAMPdependent, catalytic, alpha, Prkaca)和衣被蛋白復(fù)合物亞基（coatomer protein complex, subunit zeta 1, Copz1). 結(jié)論: Fbxl16和Prkaca的相互作用為解釋cAMP通路與脊髓損傷的關(guān)系提供了新思路，提示Fbxl16與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān). 【關(guān)鍵詞】 脊髓損傷 Fbxl16 蛋白質(zhì)相互作用 Prkaca Copz1 0引言 Fbxl16,又稱Scirr1,是一個新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì),計算生物學(xué)

3、研究結(jié)果表明它具有“Fbox+LRR”結(jié)構(gòu)域,在脊髓損傷后表達明顯增加1. 為了研究該蛋白的功能以及在脊髓損傷修復(fù)中的作用,我們通過RTPCR技術(shù)克隆出scirr1基因編碼區(qū)序列,將其克隆入pSos載體以構(gòu)建質(zhì)粒pSosscirr1. 把該重組質(zhì)粒表達的融合蛋白hSosFbxl16作為誘餌蛋白,用改良的酵母雙雜交技術(shù)篩選大鼠腦cDNA文庫中能與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì),最后用酵母雙雜交回轉(zhuǎn)實驗對獲得的相互作用的可靠性加以驗證,以期找到能與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì). 1材料和方法 1.1材料成年雄性Wistar大鼠1只,體質(zhì)量220250 g,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供. PCR引物由上海生工

4、合成. 質(zhì)粒提取和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自Stratagene公司. Taq DNA聚合酶、DNA連接酶、NcoI和SalI內(nèi)切酶購自Qiagen公司. 酵母雙雜交試劑盒CytoTrap XR Premade Libraries kit購自Stratagene公司. 1.2方法 1.2.1RTPCR克隆scirr1基因編碼區(qū)序列用Trizol方法提取大鼠脊髓總RNA；上、下游分別引入NcoI和SalI酶切位點設(shè)計scirr1引物,上游：5GAG CCA TGG TGA TGT CGA GCC CTG GTA TC3,下游： 5GAC GTC GAC CTA TTC AAT GAC GAG GC

5、A GC3, RTPCR擴增scirr1基因編碼區(qū). 用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物,按標(biāo)準(zhǔn)程序純化回收以及酶切目的條帶中的DNA產(chǎn)物,送上海生工測序. 1.2.2構(gòu)建融合表達質(zhì)粒擴大培養(yǎng)pSos質(zhì)粒的保存菌種,采用DNA抽提試劑盒提取pSos質(zhì)粒,用NcoI/SalI雙酶切并純化回收質(zhì)粒. 將線性化質(zhì)粒和酶切后的scirr1編碼區(qū)DNA行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,成像拍照后,采用TotalLab軟件進行定量. 將線性化質(zhì)粒和酶切后的scirr1編碼區(qū)DNA按照17的摩爾比進行重組連接,將重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21型大腸桿菌,酶切鑒定后送上海測序鑒定. 1.2.3酵母雙雜交文庫篩

6、選使用誘餌質(zhì)粒pSosscirr1,溫度敏感型cdc25H酵母突變株和5個對照質(zhì)粒(pSos, pMyrLamin C, pSosMAFB, pMyrMAFB和pMyrSB) 進行酵母雙雜交預(yù)實驗,用以排除Fbxl16的毒性和自激活. 之后按照酵母雙雜交手冊以pSosscirr1為誘餌質(zhì)粒篩選大鼠腦cDNA文庫pMyrcDNA. 篩選與Fbxl16陽性相互作用的cDNA融合質(zhì)粒,這些質(zhì)粒將用于下一步的回轉(zhuǎn)驗證. 1.2.4回轉(zhuǎn)驗證陽性相互作用將篩選出的每個cDNA融合質(zhì)粒分別與pSosscirr1共轉(zhuǎn)化入酵母突變株進行回轉(zhuǎn)驗證. 在葡萄糖和半乳糖培養(yǎng)基上都不生長的克隆是假陽性相互作用克??；在葡

7、萄糖缺陷培養(yǎng)基上不生長而在半乳糖缺陷培養(yǎng)基上生長的克隆是真陽性相互作用克隆. 之后從驗證為真陽性的克隆中提取cDNA融合質(zhì)粒，擴大培養(yǎng)后純化、測序, 從NCBI數(shù)據(jù)庫中查出該cDNA對應(yīng)的蛋白質(zhì). 該蛋白就是能夠與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì). 2結(jié)果 2.1融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建引入NcoI和SalI酶切位點,將RTPCR得到的scirr1基因編碼區(qū)片段克隆入pSos空載體,構(gòu)建出融合蛋白表達質(zhì)粒pSosscirr1（圖1）. M1: DNA marker DL15 000; M2: DNA marker DL2000; 1: NcoI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒pSosscirr1. 圖1重組

8、質(zhì)粒pSosscirr1的酶切鑒定 2.2酵母雙雜交文庫篩選預(yù)試驗排除了Fbxl16的毒性和自激活, 酵母雙雜交篩選出14個陽性相互作用克隆，它們在同源復(fù)制的兩塊葡萄糖培養(yǎng)基上不生長，而在另兩塊同源復(fù)制的半乳糖培養(yǎng)基上生長（圖2）. A,C: 葡萄糖缺陷培養(yǎng)基上克隆不生長； B,D: 半乳糖缺陷培養(yǎng)基上克隆生長. 圖2文庫篩選出的一個陽性相互作用克隆 2.3回轉(zhuǎn)驗證陽性相互作用從篩選出的14個克隆中提取cDNA融合質(zhì)粒，分別與pSosscirr1共轉(zhuǎn)化入酵母突變株回轉(zhuǎn)驗證. 結(jié)果表明其中2個克隆為真陽性相互作用，其他的克隆為假陽性. 將這2個真陽性相互作用克隆擴大培養(yǎng)、純化、提質(zhì)粒后測序, 從

9、NCBI數(shù)據(jù)庫中查出該cDNA融合質(zhì)粒對應(yīng)的蛋白質(zhì)分別為Prkaca和Copz1，即蛋白Prkaca和Copz1是能夠與Fbxl16相互作用的蛋白質(zhì)（圖3）. A: 假陽性相互作用克隆; B,C: 真陽性相互作用; A1，B1，C1: 葡萄糖培養(yǎng)皿；A2，B2，C2： 半乳糖培養(yǎng)皿. 圖3回轉(zhuǎn)實驗驗證陽性相互作用 3討論 cAMP通路在急性脊髓損傷中表現(xiàn)出重要意義：刺激cAMP信號通路能夠提升受損感覺神經(jīng)元的內(nèi)在生長能力2；神經(jīng)營養(yǎng)因子能增加神經(jīng)元的cAMP水平，激活cAMP通路，繼而阻斷鞘磷脂相關(guān)糖蛋白對脊髓損傷后神經(jīng)元再生的抑制3；在脊髓損傷局部和在大腦運動皮層給入cAMP能誘導(dǎo)大鼠脊髓損

10、傷后神經(jīng)再生4. Prkaca是體內(nèi)該酶催化亞基的主要存在形式5，在急性脊髓損傷中發(fā)揮重要作用. 脊髓損傷修復(fù)相關(guān)蛋白Scirr1和蛋白激酶A催化亞基Prkaca相互作用的發(fā)現(xiàn)無疑為解釋cAMP通路與脊髓損傷的關(guān)系，進而為闡明脊髓損傷的分子機制帶來新的思路. Copz1，即衣被蛋白復(fù)合體1亞基，是衣被蛋白I（COPI）的組成蛋白，COPI是一種構(gòu)成運輸膜泡表面衣被的蛋白復(fù)合體，負(fù)責(zé)從高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜泡運輸6. 此兩者相互作用的發(fā)現(xiàn)提示Fbxl16可能與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān).【參考文獻】 1 Liu T, Ma Z, Que H, et al. Identification and chara

11、cterization of scirr1, a novel gene upregulated after spinal cord injuryJ. Exp Mol Med, 2007,39:255-266.2 Neumann S, Bradke F, TessierLavigne M. Regeneration of sensory axons within the injured spinal cord induced by intraganglionic cAMP elevation J. Neuron, 2002,34(6):885-893.3 Cai D, Shen Y, De Be

12、llard M. Prior exposure to neurotrophins blocks inhibition of axonal regeneration by MAG and myelin via a cAMPdependent mechanism J. Neuron, 1999,22:89-101.4 Han PJ, Shukla S, Subramanian PS, et al. Cyclic AMP elevates tubulin expression without increasing intrinsic axon growth capacity J. Exp Neurol, 2004,189:293-302.5 Morris RC, Morris GZ, Zhang W. Differential transcriptional regulation by the alphaand gammacatalytic subunit isoforms of cAMPdependent protein kinaseJ. Arch Biochem Biophys, 2002,403(2):219-228.6 Benichou S, Bomsel M