生化制品中還原糖的測(cè)定柱前衍生高效液相色譜法編制說(shuō)明

1、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)生化制品中還原糖的測(cè)定柱前衍生高效液相色譜法編制說(shuō)明（一）工作簡(jiǎn)況，包括任務(wù)來(lái)源、協(xié)作單位、主要工作過(guò)程、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及其所做的工作等；1、任務(wù)來(lái)源本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國(guó)標(biāo)委公布的2018 年第四批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃項(xiàng)目（國(guó)標(biāo)委綜合83號(hào)），本項(xiàng)目計(jì)劃編號(hào)為20184459-T-469，名稱(chēng)為生化制品中還原糖的測(cè)定柱前衍生高效液相色譜法。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC 387）提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由聯(lián)合起草。2、目的和意義目前，糖的測(cè)定主要是滴定法（直接滴定法、高錳酸鉀滴定法、鐵氰化法、奧氏試劑滴定法）、色譜法（ PMP衍生法、 RID、ELSD）、分光光度法（硫酸苯酚法和硫酸

2、蒽酮法）。食品中還原糖測(cè)定的最新標(biāo)準(zhǔn)為GB5009.7-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定，將原有標(biāo)準(zhǔn) GB/T5009.7-2008食品中還原糖的測(cè)定 、GB/T5513-2008糧油檢驗(yàn)糧食中還原糖和非還原糖測(cè)定中還原糖測(cè)定部分和NY/T1751-2009甜菜還原糖的測(cè)定進(jìn)行了合并。新標(biāo)準(zhǔn)由原先的“推薦使用”變?yōu)榱恕皬?qiáng)制使用”；將原標(biāo)準(zhǔn)中的還原糖測(cè)定方法分別命名為第一法直接滴定法、第二法高錳酸鉀滴定法、第三法鐵氰化法和第四法奧氏試劑滴定法。新標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)大了適用范圍、完善了檢測(cè)方法，使之在實(shí)際應(yīng)用中更加廣泛合理。 GB/T 30986-2014 生化制品中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量的測(cè)定液

3、相色譜示差折光法，直接測(cè)定含量較大的3 種糖，對(duì)含量較小的糖無(wú)標(biāo)準(zhǔn)辦法測(cè)定。 藥典 2015第一部中規(guī)定了鐵皮石斛中甘露醇的PMP衍生試劑法 ,測(cè)定的糖的種類(lèi)只針對(duì)一種糖。SC/T3049-2015 刺參及其制品中海參多糖的測(cè)定高效液相色譜法。 SN/T 4260-2015 出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定苯酚- 硫酸法等標(biāo)準(zhǔn)中多糖的測(cè)定采用的是硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法，兩種方法大同小異。已有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于糖的測(cè)定主要是對(duì)糖的總量和較大含量糖的測(cè)定，不能同時(shí)兼顧到含量較小的糖，對(duì)于生化制品的質(zhì)控有一定的局限性。為此，以操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、線性范圍寬、所用試劑毒性小等為原則，建立適合生化試劑

4、中不同含量的還原糖的測(cè)定方法迫在眉睫，皆在為更為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)生化試劑等級(jí)和功效進(jìn)行評(píng)價(jià)，為生化制品的發(fā)展解決基礎(chǔ)技術(shù)問(wèn)題。13、協(xié)作單位4、標(biāo)準(zhǔn)編制過(guò)程和主要工作過(guò)程4.1 項(xiàng)目預(yù)研（1）2017 年2月至2018年3 月，標(biāo)準(zhǔn)起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對(duì)標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行了預(yù)研，課題組成員廣泛收集了國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)，了解了國(guó)內(nèi)外相關(guān)技術(shù)動(dòng)態(tài)，并且明確了工作思路和進(jìn)程安排。（2）2018年4月標(biāo)準(zhǔn)起草單位在收到全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)2 號(hào)文件后，提交了項(xiàng)目建議書(shū)以及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)草案。（3）2018年 9月，起草小組對(duì)全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)匯報(bào)了生化制品中還原糖的測(cè)定柱前衍生高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)

5、的起草工作，與會(huì)專(zhuān)家就生化制品中還原糖的測(cè)定柱前衍生高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)（草案）進(jìn)行了討論，提出了寶貴的意見(jiàn)和建議。主要意見(jiàn)包括適用對(duì)象、檢測(cè)濃度范圍對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法等。標(biāo)準(zhǔn)起草小組根據(jù)專(zhuān)家意見(jiàn)進(jìn)行了修改和完善。4.2 項(xiàng)目立項(xiàng)（ 3） 2018年12 月收到全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)生檢標(biāo)2019 1 號(hào)文件以及該標(biāo)委會(huì)轉(zhuǎn)發(fā)的國(guó)標(biāo)委綜合83 號(hào)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委關(guān)于下達(dá)2018年第四批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知立項(xiàng)文件，計(jì)劃編號(hào)：20184459-T-469。（4） 2018 年 9月至 2020 年 4 月，進(jìn)行 生化制品中還原糖的測(cè)定柱前衍生高效液相色譜法 標(biāo)準(zhǔn)的起草研制工作。完成了生化制品中還原糖

6、的測(cè)定柱前衍生高效液相色譜法 標(biāo)準(zhǔn)的編制說(shuō)明，并對(duì)全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)匯報(bào)了生化制品中還原糖的測(cè)定柱前衍生高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)（草案）進(jìn)一步完善和修改情況。（5） 2020 年 4 月 9 日，全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)就生化制品中還原糖的測(cè)定 柱前衍生高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)向全體委員專(zhuān)家（ 44 位專(zhuān)家）征求意見(jiàn)。共收集44位委員專(zhuān)家回函，其中收到？份有意見(jiàn)或建議的單位回函。起草小組已按照專(zhuān)家意見(jiàn)建議進(jìn)行修改完善。詳見(jiàn)“國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)反饋意見(jiàn)匯總表生化制品中還原糖的測(cè)定柱前衍生高效液相色譜法 標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿?！?020 年 5 月 14 日-2020 年 7 月 13 日在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂系統(tǒng)征

7、求意見(jiàn)。(6)年月至月，標(biāo)準(zhǔn)起草小組根據(jù)專(zhuān)家意見(jiàn)， 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)（征求意見(jiàn)稿）進(jìn)行修改和完善，形成送審稿，報(bào)全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)行審定。2(7)年月日至月日，全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)就標(biāo)準(zhǔn)送審稿組織審查。本 TC 全體委員人數(shù)為44 人，參與投票 44 人，投票同意本標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)審查人，通過(guò)。全體委員中，有人為起草組成員。(8)年月日至月日，標(biāo)準(zhǔn)起草組針對(duì)函審專(zhuān)家提出的意見(jiàn)建議進(jìn)行了匯總整理，主要是單位、格式等一般編輯性的建議，已按專(zhuān)家意見(jiàn)建議修改。有幾條技術(shù)性意見(jiàn)修改情況如下：(9)年月日，會(huì)后起草小組對(duì)標(biāo)準(zhǔn)文本進(jìn)行了進(jìn)一步修改和完善。形成了報(bào)批稿。報(bào)全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)。5、國(guó)家

8、標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及其所做的工作（二）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容（如技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則等）的論據(jù)（包括試驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)） ，修訂國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)增列新舊國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)水平的對(duì)比；1、標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)的編制依據(jù) GB/T 1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě) ，并參照 GB/T 6379.1-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第1部分 總則與定義和 GB/T 6379.2-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2部分 確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法。2、確定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容（如技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、

9、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則等）的論據(jù)（包括試驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)）2.1分析結(jié)果計(jì)算與表示式中：X-樣品中還原糖的含量， g/100g ；K-樣品稀釋系數(shù)；C-從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的被測(cè)組分溶液濃度，g/mL；V-樣品溶液定容體積， mL；m-所稱(chēng)試樣的質(zhì)量， g。2.2 參數(shù)確定3標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用液相色譜 -紫外法法測(cè)定生化樣品中甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖的含量測(cè)定。本標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容：方法原理：生化制品中還原糖經(jīng)水提取，與 1-苯基 -3-甲基 -5-吡唑啉酮在堿性條件下反應(yīng)，生成糖衍生物，經(jīng)液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。 (1) 儀器條件 : 色譜柱：

10、Alltima C18，5.0 m，4.6*250mm (2) 流動(dòng)相：A 相為含 20 mM 甲酸銨水溶液（氨水調(diào)節(jié) pH=8.5）； B 相為乙腈 (3) 流速： 0.4 mL/min (4) 柱溫： 20 (5) 檢測(cè)器波長(zhǎng)： 245nm (6) 進(jìn)樣量： 10 L； 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 分別稱(chēng)取各還原糖標(biāo)準(zhǔn)樣品 0.025g 于 25mL 容量瓶中，純水定容，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液母液濃度為 1000g/mL 。分別取 0.05mL 、0.10mL 、0.25mL、0.5mL、1mL 、2mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液母液定容至 10mL 容量瓶，配制成 5g/mL 、10 g/mL、25g/mL、 50g/

11、mL 、100g/mL 和 200g/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度系列。 試樣的測(cè)定： 分別吸取待測(cè)試樣和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各 200L 置于 15mL 具塞試管中，加入 1mol/L NaOH 溶液 100L ， 0.5mol/L PMP 衍生化試劑 500L ，于 70恒溫水浴 90min，冷卻至室溫，加入 1mol/L HCl 溶液 100L ，減壓蒸餾后加入 2mL 水溶解定容，再加入 2mL 三氯甲烷萃取，充分震蕩、離心，棄去下層有機(jī)相，重復(fù)此操作 2 次，取上層水相 1mL 經(jīng) 0.45m 濾膜過(guò)濾用于 HPLC 分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工

12、作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量。（三）主要試驗(yàn)（或驗(yàn)證）的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果；1、實(shí)驗(yàn)材料及儀器1.1 試劑總體要求本方法所用試劑均為分析純，除特殊說(shuō)明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T 6882 規(guī)定的一級(jí)水。乙腈：色譜純?nèi)燃淄椋悍治黾儽交?-3- 甲基 -5- 吡唑啉酮 (PMP)衍生溶液稱(chēng)取 87.1 g PMP ，加甲醇溶解并稀釋至1L。溶液稱(chēng)取 40.0 g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1L。鹽酸溶液取 83.2mL 濃鹽酸 , 加水溶解并稀釋至1L。4甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)： 99%。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稱(chēng)取 0.1 g糖，精

13、確至 0.0001 g，用水溶解并定容至100 mL ，配置成濃度約為1 000 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于 4 條件下，應(yīng)在 1個(gè)月內(nèi)使用。工作曲線的配置分別取 0.05mL 、 0.10mL 、 0.25mL、 0.5mL、 1mL、2mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液母液定容至10mL容量瓶，配制成 5g/mL、10g/mL、 25g/mL、50g/mL、 100g/mL和 200g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度系列。1.2 儀器與設(shè)備除實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備外，應(yīng)有下述儀器設(shè)備：高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器分析天平：感量0.1mg數(shù)顯恒溫水浴鍋電熱恒溫干燥箱樣品粉碎機(jī)2、實(shí)驗(yàn)方法2.1 試樣制備移取一

14、定量生化制劑，在 100水浴中浸提 30分鐘超聲， 浸提完成后趁熱過(guò)濾，用容量瓶定容至 （根據(jù)需要決定稀釋倍數(shù)），經(jīng)0.45 m濾膜過(guò)濾后待用。樣品前處理：固體樣品：將樣品粉碎，研細(xì)，稱(chēng)取研細(xì)后樣品5g（精確到 0.01g ）于 50mL離心管中，加入 20mL水，在沸水浴中提取30min，超聲提取10min，加入正己烷5mL，振搖或渦旋2min，于5000 轉(zhuǎn) /min 離心 5min。得到最上層為正己烷層，中間為水層，最下面為固體沉淀。取中間水層清液待用（可以根據(jù)需要進(jìn)行稀釋?zhuān)?。含油脂及蛋白?lèi)液體樣品：稱(chēng)取樣品 5g（精確到 0.01g ）于 50mL離心管中， 加入 20mL水，在沸水浴

15、中提取30min，超聲提取10min，加入正己烷5mL，振搖或渦旋2min，于 5000 轉(zhuǎn) /min 離心 5min。得到最上層為正己烷層，中間為水層，最下面為蛋白沉淀。取中間水層清液待用（可以根據(jù)需要進(jìn)行稀釋?zhuān)?。不含油脂及蛋白類(lèi)液體樣品：稱(chēng)取樣品5g（精確到 0.01g ）于 50mL離心管中，加入20mL5水，在沸水浴中提取30min，超聲提取 10min，加入正己烷5mL，振搖或渦旋2min，于 5000 轉(zhuǎn)/min離心 5min。得到最上層為正己烷層，中間為水層，最下面為蛋白沉淀。取中間水層清液待用（可以根據(jù)需要進(jìn)行稀釋?zhuān)?。2.1.3 試樣衍生：分別吸取試樣和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液2

16、00L 于 15mL具塞試管中，加入 1mol/L氫氧化鈉，0.5mol/L 的 PMP 衍生試劑 0.5mL，在 70恒溫水浴中反應(yīng)90min，冷卻至室溫，加入1mol/L 鹽酸溶液 100L，搖勻后， 70恒溫水浴中氮?dú)獯蹈桑尤?mL 蒸餾水定容，再加入1mL 三氯甲烷，充分渦旋后靜置或離心，使溶液分層，棄去下層有機(jī)層，重復(fù)此操作三次，取上層水相過(guò)0.45 m濾膜后進(jìn)入液相色譜分析。2.3儀器參考條件色譜柱： Alltima C18 ， 250*4.6 mm ， 5.0 m；流動(dòng)相： A相為含 20 mM甲酸銨水溶液（氨水調(diào)節(jié)pH=8.5）； B相為乙腈流速： 0.6 mL/min柱溫：

17、 20檢測(cè)器波長(zhǎng)： 245nm進(jìn)樣量： 10 L2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液從低到高依次注入液相色譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的響應(yīng)值（峰面積），以標(biāo)準(zhǔn)工作液中糖的濃度為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)值（峰面積）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖參見(jiàn)附錄A 中圖 A.1。2.5樣品溶液的測(cè)定將待測(cè)樣品液上機(jī)測(cè)定。 若待測(cè)樣品液中木二糖含量超出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線5.0g/mL 200 g/mL范圍，應(yīng)稀釋合適倍數(shù)后重新測(cè)定，記錄色譜圖。根據(jù)保留時(shí)間定性，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品液中糖的濃度，平行測(cè)定次數(shù)不少于兩次。表 1液相色譜梯度洗脫參考條件時(shí)間 /min流速 /(mL/min)流動(dòng)相 A/%流動(dòng)相 B

18、/%00.49010350.48020370.41090420.41090430.4901063 分析結(jié)果計(jì)算與表示式中：X- 樣品中還原糖的含量，g/100g ；K- 樣品稀釋系數(shù)；C- 從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的被測(cè)組分溶液濃度，g/mL；V- 樣品溶液定容體積，mL；m-所稱(chēng)試樣的質(zhì)量，g。33 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 2回收率及精密度（ 5 g/mL 加標(biāo)）序號(hào)化合物回收率RSD%(N=3)備注1甘露糖86.2-95.3%4.222核糖87.3-92.0%3.673鼠李糖84.9-91.1%3.554乳糖84.7-92.3%4.155麥芽糖83.8-92.0%3.126葡萄糖81.3-94.3%2.9

19、67半乳糖81.2-92.5%3.348阿拉伯糖82.3-97.3%2.379木糖85.1-96.8%3.7510巖藻糖86.0-91.2%3.28試驗(yàn)結(jié)論： 加標(biāo)濃度較低時(shí)收校準(zhǔn)曲線影響較大。表 3 檢出限結(jié)果序號(hào)化合物檢出限（ g/mL ）定量限（三倍檢出限）備注（ g/mL ）1甘露糖0.2340.7022核糖0.2370.7113鼠李糖0.2410.7234乳糖0.4511.3535麥芽糖0.4541.3626葡萄糖0.2140.6427半乳糖0.3230.9698阿拉伯糖0.1930.5799木糖0.2100.6310巖藻糖0.3180.9547表 4 線性范圍序號(hào)化合物線性范圍R2

20、備注1甘露糖5g/mL-200 g/mL0.99932核糖5g/mL-200 g/mL0.99953鼠李糖5g/mL-200 g/mL0.99914乳糖5g/mL-200 g/mL0.99965麥芽糖5g/mL-200 g/mL0.99976葡萄糖5g/mL-200 g/mL0.99947半乳糖5g/mL-200 g/mL0.99928阿拉伯糖5g/mL-200 g/mL0.99969木糖5g/mL-200 g/mL0.999410巖藻糖5g/mL-200 g/mL0.99924.方法驗(yàn)證課題組對(duì)回收率、線性方程、樣品數(shù)據(jù)結(jié)果等參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證樣品由本標(biāo)準(zhǔn)起草單位提供，將驗(yàn)證樣品送至甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司、四川省