組織工程骨血管化的研究進(jìn)展

1、組織工程骨血管化的研究進(jìn)展 作者：何清義李強(qiáng)溫立升許建中【關(guān)鍵詞】 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 組織工程骨具有巨大的臨床需要及應(yīng)用前景，用組織工程骨(tissue engineering bone，TEB）修復(fù)骨缺損的研究方興未艾。目前大部分的研究都停留在小動(dòng)物(如鼠、兔)體內(nèi)原位或異位成骨，修復(fù)部位大都為非負(fù)重骨缺損，新生的骨組織還不能滿足臨床應(yīng)用的需要。目前應(yīng)用大塊TEB修復(fù)大段骨缺損時(shí)，其核心部位往往發(fā)生缺血壞死，使修復(fù)歸于失敗，其主要原因在于未能很好解決TEB的血管化問(wèn)題1。因?yàn)樾K組織工程骨植入體內(nèi)后，早期依靠組織液的滲透可獲得營(yíng)養(yǎng)，而大塊組織工程骨僅靠組織液的滲透是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于血

2、管重建(包括毛細(xì)血管)研究尚處于起步階段，主要方法有：(1)血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞+生物材料2、3；(2)生物材料+預(yù)制血管蒂或筋膜包裹；(3)生物材料+促血管生長(zhǎng)因子4。第1種方法需要大量培養(yǎng)、擴(kuò)增血管內(nèi)皮細(xì)胞，周期長(zhǎng)，而且需要從自體切取血管用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)；第2種方法能夠得到血管化的TEB，但必須將TEB異位植入，待血管束長(zhǎng)入后再斷蒂用于移植，不但有異位創(chuàng)傷的問(wèn)題而且等待的時(shí)間也較長(zhǎng)。直接應(yīng)用促血管生長(zhǎng)因子在體內(nèi)迅速降解為無(wú)活性的片段，并且其在體內(nèi)的半衰期較短，會(huì)很快流失在周圍組織中，達(dá)不到理想的效應(yīng)濃度；如果采用首次大劑量給藥，易導(dǎo)致局部血管瘤5。現(xiàn)常用的緩釋技術(shù)如材料

3、表面化學(xué)結(jié)合、高分子材料微囊包裹技術(shù)等，不僅損害其生物活性，其緩控釋作用也存在多方面不足。有學(xué)者通過(guò)盡量模擬體內(nèi)血管發(fā)生與生成的生理過(guò)程，構(gòu)建組織工程血管來(lái)解決此問(wèn)題。血管的形成分為血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)。血管發(fā)生主要發(fā)生于胚胎期，通過(guò)內(nèi)皮前體細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)分化成內(nèi)皮細(xì)胞，在中胚層內(nèi)形成血管叢，此過(guò)程受VEGF控制；血管叢的塑型、擴(kuò)張屬于血管生成過(guò)程，主要由血管生成素1(angiopoietin1,Ang1)調(diào)控6。血管分子生物學(xué)已破譯了許多復(fù)雜的血管形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括：(1)啟

4、動(dòng)：缺氧環(huán)境刺激VEGF分泌并結(jié)合VEGF受體(VEGFR)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移進(jìn)入微血管間隙；(2)增生：活化的內(nèi)皮細(xì)胞形成纖維條索狀突起結(jié)構(gòu)；(3)塑型：Ang1與內(nèi)皮細(xì)胞受體Tie2結(jié)合7，吸引周細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞包繞幼稚血管。舊的圍繞基質(zhì)消化，并形成新的基質(zhì)沉積。中空結(jié)構(gòu)形成，周細(xì)胞環(huán)繞內(nèi)皮，形成圍繞血管的連續(xù)基膜。(4)血管成熟：在體內(nèi)，通過(guò)灌注率和剪切力、低氧、其他生長(zhǎng)因子等代謝因素作用于內(nèi)皮，使多余細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)、去分化、凋亡而成熟。因此，血管形成是一個(gè)有多種內(nèi)分泌、旁分泌因子相互作用的多步連續(xù)反應(yīng)，是一個(gè)生理需要與病理修復(fù)持續(xù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，它涉及到細(xì)胞(EPCs、內(nèi)皮細(xì)胞)，細(xì)

5、胞因子(VEGF、Ang1)以及生物應(yīng)力等。內(nèi)皮細(xì)胞是血管生成過(guò)程中的最重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞，所有的成血管因素皆圍繞它發(fā)揮作用。但內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)耗時(shí)費(fèi)力，其規(guī)模擴(kuò)增相當(dāng)困難，并且內(nèi)皮細(xì)胞的獲取創(chuàng)傷較大，來(lái)源(靜脈或動(dòng)脈血管)極其有限，因而遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需要。內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPCs)存在于骨髓、臍帶血與外周血中，前二者含量較豐富，后者含量較少(EPCs僅及前二者的十分之一)，EPCs被稱為睡眠中的成體干細(xì)胞(sleeping adult stem cells)，它不僅可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞，還可分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，其特征性的表型為表達(dá)三種細(xì)胞標(biāo)記(CD133，CD34，VEGFR2）8、9。最新

6、的研究表明EPCs在成體血管形成中起著重要作用，在缺血后肢、缺血心肌、損傷角膜、損傷皮膚以及腫瘤增生的血管形成中維持血管形成，替代脫落的內(nèi)皮細(xì)胞并最終完成內(nèi)皮化1012。Yuyama等13的臨床研究發(fā)現(xiàn)，CD34陽(yáng)性的EPCs能夠從骨髓中遷移出來(lái)參與新生血管的發(fā)生(neovascularisation)，運(yùn)用含有EPCs的骨髓單核細(xì)胞(27×1007×10 9 ells人)注入缺血肢體的腓腸肌(試驗(yàn)組),與注射生理鹽水的對(duì)照組比較，4周后其腋踝指數(shù)、透皮氧分壓、靜止疼痛和無(wú)痛行走等指標(biāo)都有顯著提高，這種改善和提高一直持續(xù)到24周，作者認(rèn)為EPCs注射是一種安全、有效的治療性

7、血管手段。從狗的外周血中獲取EPCs，經(jīng)擴(kuò)增后預(yù)植入型膠原網(wǎng)中，聚亞胺酯(polyurethane)包裹其作為內(nèi)襯面并形成管腔，構(gòu)成組織工程血管并移植入狗的兩側(cè)頸動(dòng)脈，3個(gè)月后形成內(nèi)襯為乳白色的血管，腔內(nèi)覆蓋連續(xù)平整的內(nèi)皮細(xì)胞，因子染色陽(yáng)性，并且該動(dòng)脈腔內(nèi)無(wú)血栓形成。因此，EPCs可以作為內(nèi)皮細(xì)胞的較好來(lái)源14。限制EPCs的臨床應(yīng)用主要在于EPCs的數(shù)量很少，根據(jù)不同的分離方法獲得的EPCs數(shù)目不同，用流式細(xì)胞儀分離的細(xì)胞數(shù)量在3 0005 000個(gè)ml之間，用免疫磁珠分離的細(xì)胞數(shù)量在70210個(gè)ml之間。如何使EPCs快速增殖與分裂以及利用其促進(jìn)血管形成是目前研究的熱點(diǎn)之一。生長(zhǎng)因子是血管

8、形成中最核心的因素之一，生長(zhǎng)因子形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)控血管的發(fā)生與形成。目前血管形成領(lǐng)域研究較多的是VEGF和Ang1。VEGF家族包括VEGFA、B、C、D和胎盤形成因子，其中VEGFA是研究較集中的因子，具有四種異構(gòu)體，分別由121、165、189、206個(gè)氨基酸組成，VEGF 121含量最多，而VEGF 165活性最強(qiáng)，它通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體結(jié)合，激活一氧化氮合成酶反應(yīng)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂與增殖。研究表明VEGF作為強(qiáng)有力的趨化因子，能夠促進(jìn)EPCs從骨髓中遷移出來(lái)并參與新生血管的形成15Henrich16等研究發(fā)現(xiàn)含有VEGF 165的血清不但促進(jìn)人EPCs數(shù)量的增殖與分化，

9、并且刺激EPCs參與血管形成，VEGF 165在人EPCs的分化中也起著關(guān)鍵作用。但臨床上直接應(yīng)用VEGF效果不佳，因其在體內(nèi)的半衰期較短，并迅速降解成為無(wú)活性的片段。應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染的方法將編碼VEGF的基因轉(zhuǎn)入EPCs，能夠明顯促進(jìn)EPCs的增殖和粘附，促進(jìn)EPCs整合進(jìn)入新生血管。試驗(yàn)表明應(yīng)用腺病毒VEGF基因轉(zhuǎn)染的EPCs能夠極大增加裸鼠缺血后肢的新生血管形成和血流恢復(fù)，使因缺血壞死截肢率降低63717。臨床上采用含VEGF165的裸質(zhì)粒轉(zhuǎn)染缺血心肌，可顯著提高EPCs的遷移水平和在缺血心肌的新生血管形成。研究還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染VEGF基因的患者血清中VEGF一過(guò)性升高，并導(dǎo)致EPCs數(shù)量顯著上

10、升，相對(duì)于轉(zhuǎn)染空載體和生理鹽水注射組，其血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增加了30倍，有力地促進(jìn)了缺血肢體的血管形成。在美國(guó)的多個(gè)醫(yī)療中心，已經(jīng)運(yùn)用VEGF腺病毒真核表達(dá)載體進(jìn)行基因治療，隨機(jī)、雙盲試驗(yàn)表明VEGF有強(qiáng)大的血管保護(hù)作用(Vasculoprotective)18。由此可見(jiàn)VEGF在促進(jìn)EPCs的增殖、遷移、趨化、分化的作用上舉足輕重，VEGF的基因轉(zhuǎn)染具有確切、高效、安全的特點(diǎn)。血管生成素(angiopoletin，Ang)是另外一種重要的與血管生成相關(guān)的因子，特別是Ang1，它在肌肉、子宮等血管豐富的組織內(nèi)廣泛表達(dá)，特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞Tie2受體，吸引血管平滑肌細(xì)胞、周細(xì)胞等血管周圍細(xì)胞包繞

11、、支持內(nèi)皮細(xì)胞，形成完整的血管壁，促進(jìn)血管重塑、成熟，由單內(nèi)皮細(xì)胞層向多細(xì)胞層過(guò)度，完成血管的精細(xì)結(jié)構(gòu)以及血管成熟。Thurston等發(fā)現(xiàn)VEGF以及Ang1都能特異性地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與分裂，VEGF作用于血管發(fā)生，并且主要促進(jìn)血管的長(zhǎng)度增長(zhǎng)，增加血管的通透性；而Ang1作用于血管的形成，并主要促進(jìn)血管直徑增生，減少血管的通透性，促進(jìn)血管增厚。VEGF與Ang1具有協(xié)同作用，不但可以促進(jìn)血管生成，并且具有防止血管滲漏，促進(jìn)缺血心肌、肢體的血管再形成。Ang1通過(guò)與Tie2結(jié)合促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活、血管形成、塑型、成熟和穩(wěn)定，并能抑制微血管的凋亡，抑制一氧化氮合成酶mRNA表達(dá)減少，能夠提高肺動(dòng)

12、脈高壓小鼠的生存率和肺動(dòng)脈的血液動(dòng)力學(xué)19。室驗(yàn)組用編碼Ang1的腺病毒注射觀察肌皮瓣的血管形成情況，與PBS注射以及空載體對(duì)照組相比，其肌皮瓣活性毛細(xì)血管術(shù)后7 d增加46，14 d增加98，并提高了肌皮瓣的血液動(dòng)力學(xué)20。近期研究表明Ang1和VEGF共同基因轉(zhuǎn)染能夠更好促進(jìn)缺血心肌的動(dòng)脈形成(arteriogenesis)和血管形成。單純VEGF 165或Ang1基因轉(zhuǎn)染，僅能使缺血心肌毛細(xì)血管密度上升36，如果二者協(xié)同轉(zhuǎn)染，可使血管密度上升75倍21。 已有大量的研究證明骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)不僅具有良好的成骨細(xì)胞分化潛能和高成骨活性，而且具有強(qiáng)大的增殖潛能，來(lái)源方便，以微小的創(chuàng)傷

13、即可從自體骨髓中分離并易于體外擴(kuò)增純化，可以滿足自體組織工程骨構(gòu)建的需要，而且避免了免疫排斥問(wèn)題。因此，MSCs是目前骨組織工程種子細(xì)胞的最佳選擇，并日益受到重視。作為實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)，MSCs的分離獲取和成骨細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化的方法已接近成熟。因此可以利用VEGF和Ang1雙重基因轉(zhuǎn)染的自體EPCs與MSCs混合培養(yǎng)，MSCs可旁分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)EPCs的增殖以及血管形成，而經(jīng)VEGF、Ang1雙基因轉(zhuǎn)染的EPCs等也能促使MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，建立血管形成的良性循環(huán)，從而促進(jìn)組織工程骨的快速血管化22。參考文獻(xiàn)：1 Griffith LG,Naughton G.Tissue engin

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