銅藻纖維素酶解條件的初步研究

1、溫州大學(xué)本科畢業(yè)論文銅藻纖維素酶解條件的初步研究本 科 畢 業(yè) 論 文( 2012屆 )題 目： 銅藻纖維素酶解條件的初步研究 學(xué) 院： 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 專業(yè)： 生物技術(shù) 班級： 08生技一 姓 名： 葉偉芬 學(xué) 號： 08112213129 指導(dǎo)老師： 周峙苗 完成日期：_(注：本頁面要求用彩色卡紙或70克的銅板紙做封面，字體要求用電腦打印，顏色由各學(xué)院統(tǒng)一)銅藻纖維素酶解條件的初步研究作者：葉偉芬 指導(dǎo)老師：周峙苗(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州，325027)摘要：纖維素的酶解與纖維素酶的用量、酶解液溫度、pH以及酶解時間等因素有關(guān)，本研究以銅藻為原料進(jìn)行纖維素酶解條件的初步研

2、究，以纖維素降解后還原糖的含量為指標(biāo)，考察了纖維素酶的用量、酶解液溫度、 pH以及酶解時間等四個因素對銅藻纖維素酶解的影響。在以上四個單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)對上述四個酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示：在纖維素酶用量為100萬U/g、酶解液溫度為50、 pH為4.5和酶解時間2.0h條件下的銅藻的纖維素酶解效率最高，其酶解液中的還原糖含量為0.767mg/ml。關(guān)鍵詞：銅藻、纖維素、酶解 Preliminary Study On The Conditions of Cellulose Enzymolysis of Sargassum horneriYe Weifen Zhou Shimiao

3、(College of Life and Environment Science ,WenzhouUniversity,Wenzhou,Zhejiang,325027)Abstract :The efficiency of Cellulose enzyme is related to the dosage of cellulose enzyme , temperature, pH and the time of enzymolysis,etal. The Conditions of Cellulose Enzymolysis was studied on the dosage of cellu

4、lose enzyme, temperature, pH and the time of enzymolysis, using Sargassum horneri as material and the content of reducing sugar after cellulose enzymolysis as inspection index. Based on the experiment of single factor, orthogonal experiment was taken to optimize the four conditions of cellulose enzy

5、molysis. It was apparent that the effect of cellulose enzymolysis is the optimum under the conditions of 1 million U/g for cellulose enzyme dosage, 50,pH4.5 and 2.0 h for enzymolysis, in which the content of reducing sugar after cellulose enzymolysis is 0.767mg/ml.Key words: Sargassum horneri、Cellul

6、ose、Enzymolysis前 言纖維素（Cellulose）是一種廣泛存在的可再生資源，它是地球上最豐富的多糖化合物，是植物細(xì)胞壁的主要成分，其含量可高達(dá)植物干重的55，有研究資料顯示，地球上的綠色植物每年進(jìn)行光合作用可生成45×1010噸左右的纖維素1。纖維素是葡萄糖分子通過-1,4-糖苷鍵連接而形成的葡聚糖，天然纖維素以直鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)存在, 鍵與鍵之間有一定的晶狀結(jié)構(gòu)和排列次序較差的無定形結(jié)構(gòu)許多纖維素分子以定形或無定形方式組合成微原纖維, 許多微原纖維集束成微纖維, 微纖維穿插于填充性物質(zhì)之中2。纖維素屬于大分子多糖, 分子量可達(dá)數(shù)十萬甚至數(shù)百萬, 不能為微生物細(xì)胞直接利用,

7、而是需要通過纖維素酶進(jìn)行降解, 再被微生物吸收利用3。纖維素酶（Cellulase）于1906年在蝸牛的消化道中被首次發(fā)現(xiàn)，而后自1954年開始，美國的Natick 實(shí)驗(yàn)室就已著手研究軍用纖維素材料微生物降解的防護(hù)問題4。在后來的研究中人們發(fā)現(xiàn)纖維素經(jīng)微生物降解后,可產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)、豐富的生產(chǎn)原料，于是纖維素酶得到了廣泛的關(guān)注。目前利用纖維素酶水解纖維素的方法因其酶解速度較慢，并且受到纖維素酶用量、酶解溫度、pH值、酶解時間等多種因素的影響，使得目前纖維素酶對纖維素降解效率較低，從而使纖維素酶降解纖維素的工業(yè)化應(yīng)用無法實(shí)現(xiàn)規(guī)模化5。目前，研究最多的生物可降解纖維主要有海藻纖維、聚乳酸纖維、Loyce

8、ll纖維、牛奶纖維、甲殼質(zhì)與殼聚糖纖維、合成蜘蛛絲纖維等。海藻纖維的原料來自天然海藻，產(chǎn)品具有良好的生物相容性、可降解吸收性等特殊功能，屬可再生資源，是一種良好的環(huán)境友好材料6。海藻纖維屬硫酸多糖或酸性多糖之類的物質(zhì)，除具有食用功能外，有些還具有抗癌活性。褐藻的褐藻糖是海藻的抗腫瘤及抗凝血活性成分中研究得最多的一種化合物，此單糖可抗腫瘤及延長小老鼠壽命；許多種褐藻，如裙帶菜及馬尾藻的褐藻聚糖，同樣能抑制腫瘤及增強(qiáng)老鼠的免疫抗體機(jī)能；褐藻酸是褐藻細(xì)胞壁的主要成分，其抗癌活性，和所含的甘露糖醛酸及古羅糖醛酸成分有關(guān)7。銅藻Sargassum horneri( Turn.) Ag, 又稱竹茜菜、丁香

9、屋, 屬于褐藻的一種。銅藻藻體呈黃褐色，廣泛分布于我國沿海地區(qū)，浙江沿海地帶的銅藻為其優(yōu)勢種，主要產(chǎn)于嵊山、中街山、漁山、韭山、大陳和南麂等，資源豐富8。銅藻是藻膠工業(yè)的重要原料， 在食品、有機(jī)肥料、醫(yī)學(xué)以及飼料等方面具有廣泛應(yīng)用，因而具有較高的商品價值9。本課題采用銅藻為材料，采用單因素實(shí)驗(yàn)和多因素正交實(shí)驗(yàn)方法，以纖維素降解后還原糖含量作為主要考察指標(biāo)，對纖維素酶解的條件進(jìn)行初步研究，獲得最佳的工藝參數(shù)，為銅藻的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1 材料和方法1.1 材料1.1.1原料：銅藻：取自浙江溫州南麂。銅藻經(jīng)清洗干凈后置于恒溫干燥箱內(nèi)70oC下烘干，再放入組織絞碎機(jī)內(nèi)進(jìn)行粉碎。預(yù)處理后的銅藻常溫

10、下保存待用。 1.1.2 試劑：纖維素酶：140萬U/g，甘肅華羚生物科技有限公司生產(chǎn), 醋酸，醋酸鈉，葡萄糖，3，5-二硝基水楊酸，氫氧化鈉，四水酒石酸鉀鈉，無水亞硫酸鈉，苯酚均為分析純。1.1.3 儀器設(shè)備：722可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司生產(chǎn)）、組織絞碎機(jī)、臺式離心機(jī)（TDL-60B型、上海安亭科學(xué)儀器廠）、pH酸度計、電子天平（北京賽多利儀器系統(tǒng)有限公司）、微電腦智能化控制恒溫干燥箱（101-2型、寧波萊福科技有限公司）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2102型、上海智城分析儀器制造有限公司）1.2方法1.2.1 1DNS試劑的配制稱取3，5-二硝基水楊酸3.15 g，加水500

11、 mL，攪拌5 s，水浴至45 。然后逐步加入100 mL 0.2g/ mL的氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌。直到溶液清澈透明(注意：在加入氫氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48)。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0 g、苯酚2.50 g和無水亞硫酸鈉2.50 g。繼續(xù)45 水浴加熱，同時補(bǔ)加水300 mL，不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000 mL。用燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取濾液，儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后方可使用10。1.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取1.000g經(jīng)預(yù)先烘干的葡萄糖，將其溶解在適量水中，然后轉(zhuǎn)移至容量瓶定容至1L，制得1mg

12、/ mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取1mg/ mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL于試管中，補(bǔ)水至2 mL，分別加入3 mL 的1DNS試劑。充分混勻后置于100恒溫水浴保溫5min，之后立即用流動水進(jìn)行冷卻。最后加蒸餾水稀釋至25mL。充分混勻后，于550nm處測吸光度。1.2.3酶解液中還原糖含量的測定纖維素酶解結(jié)束后，將錐形瓶放入沸水中水浴加熱5min以滅酶活（滅酶活的時間不能過長，防止酶解液因受熱過久引起顏色的變化而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果），將酶解液離心，取上清液和對照(蒸餾水)各2mL，分別加入3 mL的1DNS試劑，沸水浴煮沸5分

13、鐘顯色，冷卻后用蒸餾水稀釋至25 mL，充分混勻后用分光光度計在550nm比色，以對照液調(diào)零點(diǎn)，測得吸光度。對照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶解液中的還原糖含量。1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)1.2.3.1纖維素酶的用量對酶解效果的影響在五個錐形瓶中準(zhǔn)確加入2.0g經(jīng)粉碎預(yù)處理的銅藻，分別稱取一定量的纖維素酶使其加入20ml Hac-NaAc 緩沖液后的的濃度分別為70萬U/g 、80萬U/g 、90萬U/g 、100萬U/g 和110萬U/g，混合均勻，調(diào)節(jié)酶解液pH至5.0，用保鮮膜封住瓶口以防止酶解過程中水分的蒸發(fā)，然后將錐形瓶置于溫度為55恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)振蕩酶解1.5h。1.2.3.2酶解液溫度對酶解效

14、果的影響在五個錐形瓶中準(zhǔn)確加入2.0g經(jīng)粉碎預(yù)處理的銅藻，稱取一定量的纖維素酶使其加入20ml Hac-NaAc 緩沖液后的的濃度為100萬U/g，混合均勻，調(diào)節(jié)酶解液pH至5.0，用保鮮膜封住瓶口，然后將錐形瓶分別置于溫度為40、45、50、55和60的恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)振蕩酶解1.5h。1.2.3.3溶液pH對酶解效果的影響在五個錐形瓶中準(zhǔn)確加入2.0g經(jīng)粉碎預(yù)處理的銅藻，稱取一定量的纖維素酶使其加入20ml Hac-NaAc 緩沖液后的的濃度為100萬U/g，混合均勻，分別調(diào)節(jié)酶解液pH至3.5，4.0,4.5，5.0和5.5，用保鮮膜封住瓶口，然后將錐形瓶置于溫度為55的恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)

15、振蕩酶解1.5h。1.2.3.4酶解時間對酶解效果的影響在五個錐形瓶中準(zhǔn)確加入2.0g經(jīng)粉碎預(yù)處理的銅藻，稱取一定量的纖維素酶使其加入20ml Hac-NaAc 緩沖液后的的濃度為100萬U/g，混合均勻，調(diào)節(jié)酶解液pH至5.0，用保鮮膜封住瓶口，然后將錐形瓶置于溫度為55的恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)振蕩酶解，酶解時間分別為0.5h，1.0h，1.5h，2.0h和2.5h。 上述各單因素實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，每次酶解結(jié)束后需測量酶解液中的還原糖含量，并計算平均值。1.2.4正交試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以纖維素酶用量(A)、酶解液溫度 (B)、pH (C)、酶解時間(D) 四因素各三個水平，按L9 (

16、34 )正交表11，對銅藻纖維素酶酶解的條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平如表 1 所示。表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment水平纖維素酶用量（萬U/g）溫度(oC)pH酶解時間(h)A BCD190454.51.52100505.02.03110555.52.5 2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以光吸收值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖1 所示。圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1. The Standard Curve of Glucose由圖1顯示的相關(guān)系數(shù)R2=0.998

17、3可知，葡萄糖濃度在01mg/mL的范圍內(nèi)，與吸光度呈較好的直線關(guān)系，可為下面的單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)過程中的還原糖含量的測定提供可靠的參考標(biāo)準(zhǔn)。2.2單因素實(shí)驗(yàn)2.2.1纖維素酶的用量對酶解效果的影響纖維素酶作為催化劑，其用量的大小對纖維素的酶解過程起重要影響。一般而言，酶解反應(yīng)速率隨纖維素酶用量增加而增大。但出于經(jīng)濟(jì)效益以及酶用量對底物濃度造成一定的影響等方面的考慮，研究酶用量對酶解的影響就顯得尤為重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。圖 2 纖維素酶用量對酶解效果的影響Figure 2. The Effect of Enzymolysis on the Dosage of Cellulose Enzy

18、me 從圖 2 可以看出，隨著纖維素酶用量的增加，酶解液中的還原糖含量呈上升趨勢，這意味著酶解效率與纖維素酶用量是正相關(guān)。100萬U/g的纖維素酶用量情況下測得的還原糖含量為0.738mg/mL,比90萬U/g增加約60%，而100-110萬U/g的增幅僅為7.3%；另外，實(shí)驗(yàn)過程中，纖維素酶用量的增加可能會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響，并增加成本投入。綜上所述，纖維素酶的用量選取100萬U/g較為適宜。2.2.2 酶解液溫度對酶解效果的影響酶的催化作用受溫度的影響很大，一方面與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，提高溫度可以增加酶促反應(yīng)的速度，最后反應(yīng)速度達(dá)到最大值。另一方面酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度過高可引起蛋

19、白質(zhì)變性，導(dǎo)致酶的失活。因此，反應(yīng)速度達(dá)到最大值以后，隨著溫度的升高，反應(yīng)速度反而逐漸下降，以至完全停止反應(yīng)。反應(yīng)速度達(dá)到最大值時的溫度稱為某種酶作用的最適溫度。高于或低于最適溫度時，反應(yīng)速度逐漸降低。大多數(shù)植物酶的最適溫度為506012。不同溫度對銅藻纖維素酶解影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 3 所示。圖 3 酶解液溫度對酶解效果的影響Figure 3. The Effect of Enzymolysis on Temperature 由圖 3可知，纖維素酶解過程受溫度的影響明顯。在4055溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶解液中的還原糖含量呈上升趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到55時，酶解效率達(dá)到最大，此時酶解液還原糖含

20、量為0.758mg/mL，當(dāng)溫度超過55時，酶解效率則呈明顯下降趨勢。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合上述內(nèi)容：大多數(shù)植物酶的最適溫度為5060。綜上所述，在銅藻纖維素酶解過程中，酶解液最適溫度為55，使纖維素酶得以發(fā)揮最大活性。2.2.3 溶液pH值對酶解效果的影響酶的生物學(xué)特征之一是它對酸堿的敏感性，這表現(xiàn)在酶的活性和穩(wěn)定性易受環(huán)境pH的影響。pH 值對纖維素酶的活性影響極大。通常各種酶只在一定的pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)出活性，同一種酶在不同的pH值下所表現(xiàn)的活性不同，與溫度效應(yīng)類似，酶在最適pH 值條件下，其活性表現(xiàn)出最大，此時的pH值稱為酶的最適pH。各種酶在特定條件下都有它各自的最適pH。 不同種類的纖維素酶

21、的最適pH 也不一樣，一般在4.05.5 之間。不同 pH對酶解得率的影響結(jié)果如圖 4 所示。圖 4 溶液pH對酶解效果的影響Figure 4. The Effect of Enzymolysis on pH由圖 4可知， pH 小于4.5 時，酶解效率隨pH的上升而增大，當(dāng)pH 處于 4.5到 5.5之間時，酶解效率漸趨平穩(wěn)下降趨勢。這與多數(shù)文獻(xiàn)資料報道的纖維素酶最適宜pH為4.5相符13。因而確定最佳pH為4.5。2.2.4 酶解時間對酶解效果的影響一般而言，隨著酶解時間的延長，纖維素酶解得率呈上升趨勢。但由于酶的穩(wěn)定性較差，因而不同的時間段纖維素酶的效率不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 5 所示。圖

22、5 酶解時間對酶解效果的影響Figure 5. The Effect of Enzymolysis on Enzymatic Hydrolysis Time 由圖 5可以看出，隨著酶解時間的延長，還原糖的產(chǎn)生量逐漸增加，即纖維素被酶水解程度逐漸提高。但在0.51.0h的時間范圍內(nèi)，酶解速率上升相對較快，酶解1.0h的時候還原糖的含量比0.5h時提高了37.5%。當(dāng)超過1.0h之后，隨著產(chǎn)物的增多，酶解得率的上升趨勢逐漸平緩，酶解2.5h的還原糖得率僅比酶解2.0h的提高了2.3%。有研究表明，出現(xiàn)這個現(xiàn)象的原因是產(chǎn)物對酶解反應(yīng)具有一定的抑制作用。隨著反應(yīng)時間的延長，抑制作用逐漸增強(qiáng)14。為獲得

23、較高的酶解得率，確定2h為最佳的酶解時間。2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果如表 6所示。表6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)序號因素吸光度還原糖濃度（mg/ml）ABCD酶用量（萬U/g）溫度(oC)pH酶解時間(h)111110.2540.694212220.2860.779313330.2240.614421230.2320.635522310.2820.768623120.2760.752731320.2320.635832130.2680.731933210.2560.699K12.0871.9822.1772.161K22.1552.2782.1132.166K32.0652.0652.0171.826k10

24、.6960.6610.7260.720k20.7180.7590.7040.722K30.6880.6880.6720.609極差R0.0300.0980.0540.113由表6可知，極差DBCA，由此可見影響酶解的四個因素中首先是酶解時間，然后依次是酶解液溫度，pH，纖維素酶用量對酶解效果影響最小。根據(jù)表6中各項(xiàng)因素的K值，可確定銅藻纖維素酶解的最優(yōu)組合條件為A2B2C1D2，即：纖維素酶用量100萬U/g，酶解液溫度50， pH4.5，酶解時間2.0h。2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)將優(yōu)化獲得的工藝條件與正交實(shí)驗(yàn)中獲得結(jié)果最好的第2組條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表7所示。表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)序號纖維素酶用量（萬U

25、/g）溫度(oC)pH酶解時間(h)吸光度還原糖濃度（mg/mL）190505.02.00.2770.7542100504.52.00.2810.767結(jié)果表明，優(yōu)化條件下的酶解效率比正交實(shí)驗(yàn)第2組中的條件高出1.7%，因而確定優(yōu)化得到的最佳組合條件：纖維素酶用量100萬U/g，酶解液溫度50, pH4.5，酶解時間2.0h為銅藻纖維素酶解的最優(yōu)條件。3.結(jié)論纖維素酶對銅藻纖維素具有一定的降解作用，其降解效率與纖維素酶的用量、酶解液溫度、pH以及酶解時間等因素有關(guān)，通過正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化得到銅藻纖維素酶解的最佳條件為: 纖維素酶用量100萬U/g，酶解液溫度50,酶解液pH4.5，酶解時間2.0h

26、。在本工藝條件下銅藻纖維素酶解液中的還原糖含量為0.767mg/mL。結(jié)束語我國海藻資源極其豐富，充分開發(fā)并利用這些自然資源對于我國發(fā)展海洋事業(yè)、保護(hù)生態(tài)環(huán)境都有很重要的意義。另一方面食品工業(yè)是我國的一個重要支柱行業(yè)，海藻酸鈉等海藻纖維作為重要的天然食品添加劑，具有性質(zhì)優(yōu)良、無毒無味等特點(diǎn)，具有廣闊的開發(fā)前景15。參考文獻(xiàn)：1 趙慶新,袁生.植物細(xì)胞壁研究進(jìn)展J.生物學(xué)通報,2007,(42)7:8-92 王蘭芬.纖維素酶的作用機(jī)理及開發(fā)應(yīng)用.釀酒科技.1997.(6):16-17.3 高培基. 纖維素酶降解機(jī)制及纖維素酶分子結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展J. 自然科學(xué)進(jìn)展, 2003,13(1):21-29.4 余興蓮,王麗,徐偉民.纖維素酶降解纖維素機(jī)理的研究進(jìn)展J.寧波大學(xué)學(xué)報（理工版）,2007,20(1).5 周建, 羅學(xué)剛, 蘇林. 纖維素酶法水解的研究現(xiàn)狀及展望J. 化工科技, 2006, 14(2):51-56.6 郭肖青;朱平;王新