我的基因工程

1、基因工程復(fù)習(xí)提綱1、Gene therapeutics :（基因治療） 指將正常的外源基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或 補償基因缺陷或異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的2、gene engineering:（基因工程）又稱基因拼接技術(shù)和 DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。是指重組DN破術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、 克隆和表達(dá)的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工

2、程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng) 以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。3、promoter :（ 啟動子）RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的位于結(jié)構(gòu)基因5,端上游DNA序列，能活化 RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確的結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。是基因（gene）的一個組成部分，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時間和 表達(dá)的程度。4、RT-PCR :（逆轉(zhuǎn)錄）由一條RNA單鏈為模版，依靠逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，以四種 脫氧核甘三磷酸（dNTP）為底物，在有能量（主要為ATP）的驅(qū)動下產(chǎn)生互補的DNA鏈（cDNA）稱作逆轉(zhuǎn)錄"常見于逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制5、star activity :（星號活性）在非理想的條件下，限制性內(nèi)切

3、酶切割與識別位點相 似但不完全相同的序列，降低酶切的特異性，這一現(xiàn)象稱星號活性。6、molecular hybridization :（分子雜交）使單鏈DNA RNA分子與具有互補堿基的 另一 DNA或RNA片斷結(jié)合成雙鏈的技術(shù)。即核酸分子間的雜交。分子雜交是確定單 鏈核酸堿基序列的技術(shù)。 其基本原理是待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過堿基配對形成可檢出的雙螺旋片段。這種技術(shù)可在DNAf DNA RNAf RNA或DN2 RNA間進(jìn)行，形成DNA-DNARNA-RN域RNA-DN蹲不同類型的雜交分子。7、competence :（感受態(tài)）受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如： CaCl

4、2等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，細(xì)胞處于能吸收許多有外源DNA的載體分子的狀態(tài)稱感受態(tài)，處于感受態(tài)的細(xì)胞稱作感受態(tài)細(xì)胞，8、isoschizomers :（同裂酶）是來源于不同物種但能識別相同 DNA堿基序列的限制 性內(nèi)切酶，切割位點可以相同也可以不同。 同裂酶在基因工程的 DNA重組中有重要的 應(yīng)用，尤其是在載體構(gòu)建方面往往可以取得巧妙的應(yīng)用。9、Northern blotting : （RNA印跡法）將RNA羊品通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離再轉(zhuǎn) 移到硝酸纖維素濾膜上，用同位素或生物素標(biāo)記的 DNM RNA#異探針對固定于膜上 的mRNAS行雜交，洗脫除去非特異性雜交信息，對

5、雜交信號進(jìn)行分析，一確定目的 基因的表達(dá)組織和表達(dá)量10、linker ：（銜接物）用化學(xué)合成法合成的一段 10-12bp的具有特定限制性內(nèi)切酶 識別位點序列的平端雙鏈11、microinjection :（顯微注射技術(shù)）是利用顯微操作系統(tǒng)將外源目的基因直接注入 到真核細(xì)胞內(nèi)，使外源基因整合到受體細(xì)胞的基因組內(nèi)的方法。通常用于轉(zhuǎn)基因植物 和轉(zhuǎn)基因動物的制作。12> transformation :（轉(zhuǎn)化）處于感受態(tài)的細(xì)菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)質(zhì)粒載體DNA子的過程，或者說是將重組質(zhì)量質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)菌細(xì)胞，使受體遺傳性狀發(fā)生改變的方法14> immune-precipitation :（免疫

6、沉淀反應(yīng)）是以抗體和抗原之間的專一性反應(yīng) 為基礎(chǔ)研究兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理活性狀態(tài)下相互作用的有效方法15、hybrid-release translation : （HRT雜交釋放翻譯）一種識別由克隆基因編碼 的翻譯產(chǎn)物的方法.經(jīng)克隆的DNA固定于硝化纖維過濾器，并與未分級制取的 mRNA 雜交。把過濾器經(jīng)過洗脫，雜交的mRNAE含甲酰胺的緩沖液中加熱洗脫。然后把回收的mRNAE無細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行翻譯，并把經(jīng)放射性標(biāo)記的多肽產(chǎn)物用凝膠電泳分離。16、cohesive end site : （COS1立點）當(dāng)入DNA進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，便迅速通過黏性 末端配對形成雙鏈環(huán)狀的 DN心子，這種黏性末

7、端結(jié)合形成雙鏈的區(qū)域稱為cos位點一、 簡答題1、現(xiàn)A蛋白是調(diào)控該信號通路的一個蛋白，現(xiàn)在他推測另外一個蛋白B可能與A蛋白互作用，請你幫他設(shè)計實驗證明在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外這兩種蛋白是發(fā)生相互作用的。（采用酪母雙雜交技術(shù)，在手機上）1.把蛋白A基因插入到BD質(zhì)粒上構(gòu)建成一個載體（餌蛋白載體或B喊體） 2. 把蛋白B基因插入到AD質(zhì)粒上共連成另一個載體 （靶蛋白載體或AD載體）3. 兩 種重組質(zhì)粒共同和分別轉(zhuǎn)化酯母菌4.篩選觀察（用單獨餌蛋白載體轉(zhuǎn)化酯母菌由于缺失AD活性，不能使基因表達(dá)，即不能信號傳導(dǎo)；用單獨靶蛋白轉(zhuǎn)化酯母菌由 于缺失BD活性，也不能使基因表達(dá)，即不能信號傳導(dǎo)，用靶蛋白和餌蛋白共同轉(zhuǎn)

8、化 酯母菌（雙雜交），產(chǎn)生的靶蛋白與餌蛋白可以相互作用，形成GAL4BD吉構(gòu)域-餌蛋白-靶蛋白-GAL4AD吉構(gòu)域復(fù)合體，這時 BD與AD分別發(fā)揮作用是基因表達(dá)，產(chǎn)生信 號傳導(dǎo)，故可以證明）2、基因工程的應(yīng)用A基因工程在醫(yī)藥上的應(yīng)用1 ）基因制藥：通過DNAS組技術(shù)將天然存在于人體內(nèi)起著各種生理功能且含量甚 少以至微量的活性多肽、 蛋白質(zhì)、糖肽所編碼的基因片斷導(dǎo)入微生物或哺乳動物細(xì)胞 中進(jìn)行擴增和表達(dá)，通過純化、提取制備出高純度、高活性的生物有效物質(zhì).1982年，首次批準(zhǔn)重組動物疫苗-抗球蟲病疫苗.1982年，第一個基因工程藥物-人胰島素生產(chǎn)上市.三大類基因藥物產(chǎn)品：生物活性多肽、疫苗、單克隆

9、抗體2）基因治療：將正常的外源基因?qū)氚屑?xì)胞中以彌補靶細(xì)胞所缺失或突變的基 因、或抑制異常表達(dá)的基因。B基因工程在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用1 ）提高植物的光合作用效率（1）提高CO2的固定率：改變與光合作用有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)和組成（如二磷酸核酮糖竣化酶）。（2）提高光能吸收率和轉(zhuǎn)化率：改變光能 交換系統(tǒng)的分子的基因結(jié)構(gòu)。2 ）提高豆科植物的固氮效率：使非固氮植物轉(zhuǎn)變?yōu)楣痰参锘蚰芘c根瘤菌共生固 氮。3 ）轉(zhuǎn)基因植物：是將克隆到的特殊基因?qū)胧荏w植物， 使之增加一些優(yōu)質(zhì)性狀（高 產(chǎn)、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)、抗蟲、抗病等）。4 ）轉(zhuǎn)基因動物：將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞，并在基因組內(nèi)穩(wěn)定整合，遺傳給后代。 改善子代特性；研究遺

10、傳性疾病的動物模型；使動物成為生物反 應(yīng)器生產(chǎn)有用的活性蛋白等。C 基因工程在工業(yè)中的應(yīng)用1 ）纖維素的開發(fā)利用：克隆各種參與纖維素降解的酶的基因，導(dǎo)入釀酒酪母，就 可能利用廉價的纖維素來生產(chǎn)葡萄糖，發(fā)酯成酒。2 ）釀酒工業(yè)：用外源基因改造釀酒酪母，產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的啤酒。或用釀酒酪母生產(chǎn)蛋 白質(zhì)等。D 基因工程在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用1 ）檢測水污染：用重組細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因魚等檢測水污染2 ）生物降解：用帶有重組質(zhì)粒的“超級菌”分解油（烷燒類）、有機農(nóng)藥污染2、簡述PC做術(shù)的基本原理PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端 互補的寡核甘酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基

11、本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNA 的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93 c左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴 增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55 C 左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基 配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán) 變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的 半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下 次循環(huán)的模板。每

12、完成一個循環(huán)需 24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增 放大幾百萬倍3、Sanger雙脫氧鏈終止法DNA1序的基本原理是什么？Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核甘酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成， 每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核甘酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一種不同的雙脫氧核昔三磷酸(ddNTP)o由于ddNT限乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核甘酸選 擇性地在 G A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種 dNTPs 和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的

13、鏈終止產(chǎn)物。 它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核甘酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢 測。 4、真核細(xì)胞基因組中的基因常有內(nèi)含子存在，能否在原核細(xì)胞中表達(dá)？能， 為什么？不能，為什么？ 不能，因為真核生物的基因是間斷的，不連續(xù)的，轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生的信使 RNM、須經(jīng)過加工，將內(nèi)含子不轉(zhuǎn)錄部分剪切掉，將外顯子轉(zhuǎn)錄部分拼接起來，而原核細(xì)胞中無行駛此功能的酶，所以要使真核細(xì)胞的基因在原核細(xì)胞中表達(dá)必須去掉內(nèi)含子。5、什么是Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用 ？Klenow酶是1974年Klenow用枯草桿菌蛋白酶

14、水解 DN課合酶I ,得到兩個片段，其 中大片段的分子量為 75kDa,它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片 段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中會降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。Klenow酶主要有下列用途： (1)修復(fù)反應(yīng)，制備平末端：可用Klenow酶修復(fù)限制性內(nèi)切核酸酶或其他 方法產(chǎn)生的5'或3'突出末端，制備平末端，這樣可以使原來具有不相容的黏性末端 的DNA段通過平末端重組。(2)標(biāo)記DNA3'突出末端(p

15、rotruding end) 該反應(yīng)分兩步進(jìn)行：先用 3'-5'的外切核酸酶活性除去 3突出末端，產(chǎn)生3隱含末端， 然后在高濃度的標(biāo)記底物(-32p-dNTP)存在下，使降解(3'-5')作用與聚合(5'-3') 作用達(dá)到平衡(3)其他的一些用途：包括用雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA序列分析、用于cDNA第二鏈的合成、在定點突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法（primer extension）制備單鏈 DN麻針等。6、什么是藍(lán)白斑篩選法？這種方法是根據(jù)組織化學(xué)的原理來篩選重組體。主要是在l載體的非必要區(qū)插入一個帶有大腸桿菌b一半乳糖甘酶的基因片段，

16、攜帶有l(wèi)ac基因片段的l載體轉(zhuǎn)入lac的 宿主菌后，在含有 5一澳一4一氯一3一引口朵一b 一D 半乳糖昔（X-gal）平板上形成淺 藍(lán)色的噬菌斑。外源基因插人lac（或lac基因部分被取代）后，重組的噬菌體將喪失 分解X-gal的能力，轉(zhuǎn)入lac-宿主菌后，在含有5一澳一4一氯一3一引噪一bD-半 乳糖昔（X-gal）平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍(lán)色噬菌斑。7、基因工程對載體的要求即一個理想的載體要具備的條件（1）具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，并在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨立復(fù)制。（2）有選擇性標(biāo)記，便于重組DN心子的檢測。（3）有一段多克隆位點。外源 DN麗入其中不影響載 體的復(fù)制。（4）分

17、子量小，拷貝數(shù)多。（5）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。（6）具有較好安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。8、為了大量獲得許多用于生化鑒定的產(chǎn)物，你想將擬南芥中的一個序列已知、編碼 單體酶蛋白的基因在單細(xì)胞微生物中表達(dá)，你如何確保最終能得到產(chǎn)物？由于基因已被測序并進(jìn)行了分析，因此前體mRNA吉構(gòu)是已知的。這對了解蛋白質(zhì)的功能區(qū)是十分重要的，可以避免有關(guān)多肽翻譯后加工的一些問題。對于間斷基因，cDNA可以用外顯子DNAf針通過體外雜交得以鑒定。將擬南芥的基因組DNM cDNA分別克隆到酪母人工染色體（YAC）上作為定位或篩選的融合標(biāo)簽，基因可以在酯母中作為 細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)或分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)。法二：由于基因已被測序，

18、可通過RT-PC昉法克隆該基因；也或通過基因文庫分離法獲得該基因；基因可以在大腸桿菌中作為融合蛋白質(zhì)或分泌蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)。具體操作如下： 制備目的基因；連接到 T-載體；轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提質(zhì)粒；測序；酶切，回收目的 基因，連接到原核表達(dá)載體；再轉(zhuǎn)化大腸桿菌，大量培養(yǎng)；分離、純化和檢測表 達(dá)產(chǎn)物。9、比較CDN岐庫與基因組文庫的差別。cDNA是指以mRN朋模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補DNA以細(xì)胞的全部 mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNAA成的重組克隆群體成為 cDNA基因組文庫 指的是將某種生物的基因組 DN砌割成一定大小的片段，并與合適的載體 重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行克隆得到的所有重組體內(nèi)的基因

19、組 DNA>t段的集合，它包 含了該生物的所有基因。基因組文庫與 cDNA文庫的差別：1基因組文庫中包含了所有的基因，而cDNA文庫只包含表達(dá)的基因，缺乏內(nèi)元和調(diào)節(jié)序列，因此在研究基因結(jié)構(gòu)時沒有多 大用處。2 cDNA文庫代表了 mRNA勺來源，其中一些特定的轉(zhuǎn)錄本豐富而另一些很少，所以存在豐度的差別；而基因組文庫在理論上均等地代表了所有基因序列。 3從不同細(xì)胞類型制備的cDNA文庫包含一些共同序列和獨特序列，可用于分離差別 表達(dá)的基因；基因組文庫中不能。4基因組文庫由于含有不表達(dá)序列，因此比cDNA文庫大。5 mRN減不同的組織之間存在豐度的差異，因此cDNA文庫的在構(gòu)建時對于mRN的

20、量較少的就比較困難；而基因組文庫不存在這樣的問題 10、大腸埃細(xì)菌基因表達(dá)系統(tǒng)有什么特點？1.對大腸桿菌的背景知識（完成基因組全測序哦），特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機理有（乳糖操縱子）深刻的了解；2.是一種安全的基因工程實驗體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體；3.許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)；4.大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。5 對大腸桿菌的遺傳背景和生理特性研究已相當(dāng)徹底，已有很多不同抗藥性、不同營養(yǎng)依賴型和不同校正突變型的菌種供選擇應(yīng)用，可以根據(jù)不同的載體而選擇不同的菌種 ；6盡管大腸桿菌細(xì)胞的空間小，但繁殖能力強，在營養(yǎng)條

21、件充足時，2030min即可繁殖一代，而且大規(guī)模發(fā)酪成本低，具 有巨大的生產(chǎn)潛力；7表達(dá)水平一般較真核系統(tǒng)高，某些外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)量可達(dá)總蛋白的 5 %30 %,且下游工藝簡單、易于控制。 8 、基因克隆 表達(dá)系統(tǒng)成熟完善；9 、繁殖迅速，培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；在細(xì)胞質(zhì)中11、在大腸埃細(xì)菌細(xì)胞中，克隆基因表達(dá)產(chǎn)物有哪幾種存在形式? 表達(dá)（如包涵體，存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)）在 周質(zhì)中表達(dá)（需要周質(zhì)和 信號肽共同作用）在 胞外表達(dá)（表達(dá)的外源基因蛋白分泌到細(xì)胞外需要信號肽作用） 13、當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時，若要進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措 施？:1.同步雙

22、酶切：選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步，因為在非最佳緩沖條件下時的切割速率會減緩2.分步酶切：應(yīng)從反應(yīng)要求鹽濃度低的酶開始，酶切完畢后再調(diào)整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求，然后加入第二種酶完成雙酶切3.使用配有特殊緩沖液的酶進(jìn)行雙酶切：在大多數(shù)情況下，采用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的酶也能在這些特殊緩沖液中進(jìn)行酶切，這保證了對緩沖液有特殊要求的酶也能良好工作。由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液中進(jìn)行酶切反應(yīng)時，反應(yīng)速度會減慢，因此需要增加酶量或延長反應(yīng)時間14、影響DNA連接酶催化連接反應(yīng)的因素有哪些 ？1） DNA的純度 （2） DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反應(yīng)的溫度（4） DNA勺分子結(jié)構(gòu) （

23、5）核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液、影響DN艇接酶催化連接反應(yīng)的因素有很多，但溫度對連接反應(yīng)的影響較大。 黏性末端鏈通常以12° C 15° C最好，這種溫度有利于末端退火和連接酶的活性穩(wěn)定。溫度高了難以進(jìn)行末端退火， 低于上述溫度會降低連接酶的活性。 平末端連接以室溫 為宜，因為平末端連接不存在 DNA的退火問題，但是溫度高于 30 C,連接酶特別不夠穩(wěn)定。平末端連接時連接酶的濃度要比黏性末端連接時高10-100倍。DNA中有殘存的tRNA不會抑制DNA連接酶的活性，但是，如果 NaCl的濃度高于150mmoJ/L, 則對連接反應(yīng)有強的抑制作用。另外反應(yīng)體系中有 NH4旃子的存在

24、，對E. coli DNAi1接酶具有?敢活作用。E. coli DNA連接酶需要NAD作輔助因子，而T4 DNA連接酶需要ATR15、堿性磷酸酶和末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶各有什么作用？堿性磷酸酶：一。防止載體自連。用同一種限制性內(nèi)切酶分別酶切載體和目的片段 后，需要將兩個酶切混合物連接起來構(gòu)建重組載體DN粉子。二、獲得5'末端磷酸基團(tuán)標(biāo)記的探針，用堿性磷酸酶先去除待標(biāo)記DNA分子5'的磷酸基團(tuán)，再用 T4多核甘酸激酶將同位素標(biāo)記的 r-32p-dATP的磷酸加在DN心子的5端，從而獲得5' 標(biāo)記的DN域RN粉子探針末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶；主要用于人工黏性末端的構(gòu)建，以及給平

25、末端 DNAffl上同聚物尾巴，也可以用于分子雜交探針的3'端標(biāo)記16、簡述DN心子克隆的基本過程？1、目的基因的分離、獲取和制備 2、目的基因與載體連接構(gòu)建成重組載體分子 3、 重組DN粉子導(dǎo)入受體細(xì)胞 4、外源目的基因陽性克隆的鑒定和帥選 5、外源基 因的表達(dá)17、為什么野生型的 九噬菌體DNA不宜作為基因工程載體？你如何將其構(gòu)建成噬菌 體載體由于野生型入噬菌體DNA寸大多數(shù)目前在分子克隆中 常用的限制酶有多個切點，而且 有些位點恰巧定位于與噬菌體生長繁殖關(guān)系密切的必需基因之中，這些位點的剪切重組必然嚴(yán)重影響噬菌體的繁殖； 其分子量也較大，包裝范圍過大；弁且無選擇標(biāo)記位 點；因此野

26、生型入DN際能直接用作載體而需經(jīng)過改造才能成為有價值的克隆載體（1）菌體DN破有容載能力，因為噬菌體的頭部對 DNA&裝的量是有限制的，不能大于基 因組的105%,所以要將l噬菌體改造成載體，必須削減分子量。（2）野生型的1DNA對于一些常用的酶都有多個識別和切割位點，不便于克隆。（3）沒有可供選擇的標(biāo)記。（4）野生型的1噬菌體具有感染性，因此不夠安全。其構(gòu)建過程主要有：刪除基因組中非必需區(qū)，建立外源DNA片段的替換點，增加承載外源DN*段的容量。在非必需區(qū)內(nèi)插入或替換選擇的標(biāo)記基因和目的基 因。建立重組 入DN粉子的體外包裝系統(tǒng)，使之有效地感染受體細(xì)胞。簡而言之， 將目的基因插入或替

27、換進(jìn)入病毒基因組的可替代區(qū)，再利用病毒的侵染性，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，這就是病毒作為“分子運輸車”的基本機理。18、比較菌落原位雜交篩選法和放射性抗體檢測法各自的特點菌落原位雜交篩選法：對應(yīng)的菌斑或噬菌體位置不變，可以直接找出陽性菌落放射性抗體檢測法：利用抗體作為探針來檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的 外源基因放射性抗體檢測法（radioactive antibody test）的基本原理是什么？這一方法的基本 原理是根據(jù)抗體、抗原分子的三個基本特性而設(shè)計的一種篩選鑒定重組體的方法。這三個基本特性是：（1）抗體分子可以牢固地吸附在固體基質(zhì)（如聚乙烯塑料）上而不被洗脫掉；（2） 一個抗原

28、可以同幾種不同的抗體結(jié)合；（3）抗體分子可以通過碘化作用被 125I標(biāo)記。原位菌落雜交（colony hybridization）?根據(jù)微孔濾膜雜交和原位雜交的原理而改良的一種篩選重組體的一種核酸雜交方法。它是將生長在或影印在微孔濾膜上的菌落 （或噬菌斑）原位溶菌，原位進(jìn)行DN屐性并原位固定在濾膜上，然后用放射性標(biāo)記的探針同固定了的DNA4行雜交經(jīng)放射自顯影后，確定哪一個菌落含有重組的 DN粉子， 再從參比平板上選取重組體。19、cDN成庫的構(gòu)建過程？（1）總RNA（total RNA ）提取（2） mRNA勺分離純化利用mRNAtB含有一段polyA尾巴，將 mRN從總RNA（rRNA tR

29、NA等）中分離純化。分離 mRNA®商業(yè)化 的Oligo dT纖維柱。（3） cDNA的合成cDNA第一鏈合成 逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA模板合成DNA 用Oligo dT （或隨機引物）彳引物，合成 cDNA勺第一 鏈。 降解mRNAK板用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DN雜交分子中的 mRNAcDNA第二鏈合成剩下的cDNAI鏈的3'末端一般形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DN膘合酶合成第 二鏈DNA.。去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉?。?。（4） cDNA與載體連接：在 雙鏈cDN

30、A末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受 體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈 cDNAW 3'端分別加上幾個 C或G,成為粘 性末端。一、基因工程概述1基因工程的基本概念重組DNAK術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體 （受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，供體、受體、載體是重組DN破術(shù)的三大基本元件。基因工程Geneengineering 是指重組DNAK術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用， 包括上游 技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、 克隆和表達(dá)的設(shè)計與構(gòu)建（即重組

31、DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因 產(chǎn)物的分離純化過程。2基因工程的誕生1 ） DNA是遺傳物質(zhì)一.肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗，1944年Avery ,確定了基因的分子載體是 DNA而不是蛋 白質(zhì)。 二.噬菌體轉(zhuǎn)染實驗,1952年Alfred Hershy 和Marsha Chase進(jìn)一步證 明遺傳物質(zhì)是DNA 三.植物病毒TMV®建實驗2 ） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) 1953 年沃森和克里克揭示了 DN心子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留 復(fù)制機制。3 ）中心法則和遺傳密碼1957年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”DNA一RNA 蛋白質(zhì)1964 年 Marsha

32、ll Nirenberg 和 Gobind Khorana 等終于 破譯了 64個遺傳密碼4）感受態(tài)體系1970年發(fā)現(xiàn)CaCl2處理的大腸桿菌易吸收噬菌體DNA 1972年發(fā)現(xiàn)這種處理過的細(xì)菌能吸收質(zhì)粒 DNA3基因工程的研究內(nèi)容1 ）目的基因的獲?。簭膹?fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCRT增等步驟，分 離出帶有目的基因的 DN叫斷。2 ）重組體的制備：將目的基因的DNA>t斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記 （抗 生素抗性）的載體分子上。3 ）重組體的轉(zhuǎn)化：將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。4 ）克隆鑒定：挑選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克隆（含有目的基因）。5 ）目的基因表達(dá)：使導(dǎo)入寄主細(xì)

33、胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物。4基因工程的安全性A基因工程的安全隱患1 ）對環(huán)境的影響；重新組合一種在自然界尚未發(fā)現(xiàn)的生物性狀有可能給現(xiàn)有的 生態(tài)環(huán)境帶來不良影響。2 ）新型病毒的出現(xiàn)；制造帶有抗生素抗性基因或有產(chǎn)生病毒能力的基因的新型微 生物可能在生物體內(nèi)傳播。3 ）癌癥擴散：將腫瘤病毒或其它動物病毒的 DNA引入細(xì)菌有可能擴大癌癥的發(fā)生 范圍。4 ）人造生物擴散： 新組成的重組DNAt物體的意外擴散可能會出現(xiàn)不同程度的潛 在危險。6 .實驗室的物理安全分4級：P1 P4級（2）實驗室的生物安全 分3級（大腸桿菌）：EK1 EK3級。（3）載體的安全 應(yīng)該是失去了自我遷移的能力。二

34、、基因工程的基礎(chǔ)知識與基本技術(shù)1 .基因：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能 RNA所必需全部核甘酸序列,由結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因 組成.結(jié)構(gòu)基因：轉(zhuǎn)錄成各種RNAt接行使功能；轉(zhuǎn)錄成mRNA®譯成功能蛋白質(zhì).調(diào)節(jié) 基因：調(diào)節(jié)或限制其他基因活性的基因,如啟動子，增強子,終止子等.2 .原核生物基因結(jié)構(gòu)特點DNA 1）結(jié)構(gòu)簡練2）存在轉(zhuǎn)錄單元3）有重疊基因mRNA 1)半衰期短 2)以多順反子形式存在3)存在SD序列3 .真核生物基因結(jié)構(gòu)特點DNA 1)不連續(xù)性2)高度重復(fù)序列一衛(wèi)星DNAmRNA 1) 5'帽子結(jié)構(gòu)2) 具ploy(A)尾 3) 單順 反子4 .基因表達(dá)定義；就是基因轉(zhuǎn)錄及翻譯

35、的過程。在一定調(diào)節(jié)機制控制下，大多數(shù)基因 經(jīng)歷基因激活、轉(zhuǎn)錄及翻譯等過程，產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子，但并非所有基因表達(dá)過程都產(chǎn)生蛋白質(zhì)，編碼tRNA、rRNA基因轉(zhuǎn)錄合成RNA勺過程也屬于基因表達(dá)。原核生物基因表達(dá)：轉(zhuǎn)錄與翻譯幾乎同時發(fā)生，表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上.RN咪合酶(RNA polymerase)的作用是轉(zhuǎn)錄 RNA原核生物RN課合酶有比較復(fù)雜 的亞基結(jié)構(gòu)。如大腸桿菌RN課合酶有四條多肽鏈，另有一個促進(jìn)新RN附子合成的 。因子，因此它的組成的是 口23 B ' (T o 這種結(jié)構(gòu)稱為全酶(holoenzyme),除去 了(T因子的酶稱為核心酶。(T因子，識別DN

36、A±的啟動子,提高聚合酶與啟動子的親和力.5 .DNA的提取與純化由于提取DNA勺目的、種類、所用的生物、組織材料、實驗條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是 堿抽提法。所用的試劑作用 溶菌酶-1 , 4糖昔鍵。 在堿性條件(pH>8)下有活性。葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止 DNAS機械力(震蕩)的作用而降解。EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合劑，可抑制 DNA®的活性，防止 DNAt酶降解。NaOH-SDS NaOH強堿，提供pH>12的堿性條件，使 DNA雙鏈變性。 SDS: 溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白， 并結(jié)合成“蛋白一SD6復(fù)合物

37、，使蛋白質(zhì)(包括DNA 酶)變性沉淀。NaAc-HAc緩沖液 冰醋酸把醋酸鈉溶液的 pH調(diào)到4.8。用來中和NaO酸性液， 使DNAM性; 高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、 DNA RN將）沉淀。 乙醇 DNA分子以水合狀態(tài)“溶于"水里，乙醇能奪去DN6子的水環(huán)境。TE緩沖液DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTAg己制。Tris-HCl不含金屬離子 （不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作； EDTA抑制DNAS,防止DN做酶降解。6 .堿抽提法提取質(zhì)粒 DNA勺步驟第一步：溶菌 使用“溶液I”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。第二步：破膜，蛋白質(zhì)和 DNA變性 溶液II破壞

38、細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA性。第三步：中和 溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA RNA元淀。第四步：離心除去沉淀上清液中含有閉合質(zhì)粒 DNA第五步：純化 DNA上清液過柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA 0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的乙醇。7 .DNA的定量和純度測定紫外光譜法 原理：DNA（或RNA）在260nm波長處有特異的紫外吸收峰。蛋白質(zhì)在 280nm處有吸收峰 用微量比色杯（10 l ）在紫外分光光度計直接測定。瓊脂糖凝膠電泳估計原理：澳化乙錠（EB）能插入DN心子中，紫外光照射下能發(fā)紅色熒光。與已知濃度的DNA電泳帶熒光強度對比，就可以估計出DNA含量

39、。8 .電泳的基本原理 帶電荷的分子在電場中會以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動，速度稱 為電泳遷移率。 電泳遷移率同電場的強度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。如果電場強度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）：分子在電場中遷移的速度主要取決于分子 本身的大小和形狀。形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān)：分子量越大，移動越慢。9 .酪母雙雜交系統(tǒng)的作用：有效地分離能與一種已知的靶蛋白相互作用的蛋白編碼 基因10 .酪母雙雜交的實驗過程：報告基因：HIS （合成組氨酸）1 .把蛋白A基因插入到BD質(zhì)粒上（pGBT9 2, 把蛋白

40、B基因插入到AD 質(zhì)粒上（pGAD424 3,兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酯母菌（HF7c）4,篩選觀察三、基因工程所需基本條件1,載體（Vectors ）在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA8入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的DN粉子叫載體。2 .基因工程對載體的要求（1）具有對受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，并在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨立復(fù)制。（2）有選擇性標(biāo)記，便于重組DN份子的檢測。（3）有一段多克隆位點。外源 DNAft入其中不影響載體的復(fù)制。（4）分子量小，拷貝數(shù)多。（5）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。（6）具有較好安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。3,質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（1）具有復(fù)制起點（ORI）（2）具有抗性基因；是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種抗藥性抗性基因。（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點：用來插入外源DNA片斷。且插入后不影響復(fù)制功能。四、基因工程的操作過程1,基因工程的操