項(xiàng)目十七 T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志和功能檢測(cè)

1、項(xiàng)目十七T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志和功能檢測(cè)一、E花環(huán)形成試驗(yàn)(Erythrocyte rosette formation assay)【實(shí)驗(yàn)原理】人外周血T淋巴細(xì)胞表面具有綿羊紅細(xì)胞(SRBC)受體，可與SRBC結(jié)合形成花環(huán)樣細(xì)胞團(tuán)(即E花環(huán))。此試驗(yàn)用于計(jì)數(shù)T細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而可判斷機(jī)體細(xì)胞免疫狀況。由于T 細(xì)胞的異質(zhì)性，其中在4放置1h以上，所形成的花環(huán)數(shù)代表T細(xì)胞總數(shù)，稱為總花環(huán)(Et花環(huán))，而淋巴細(xì)胞與SRBC混合后不經(jīng)4作用，立即反應(yīng)形成的花環(huán)稱為活性花環(huán)(Ea花環(huán))?！驹噭┖推鞑摹?肝素抗凝劑用Hanks液將肝素配成500U/ml，分裝，每管0.1ml，置4備用。2淋巴細(xì)胞分離液(密度為1.

2、077±0.001)。3小牛血清56加熱滅活30min，按2:1比例與沉積SRBC混合，置3730min，離心，收集血清備用。40.5SRBC懸液取脫纖維或Alsever液保存的羊血，用510倍量生理鹽水洗 3 次。第3次2500r/min離心10min，棄上清液，用生理鹽水配成0.5的SRBC懸液(約108個(gè)細(xì)胞/ml)。50.8戊二醛取30.25ml 4.5 g/L NaCl 鹽水，加入1ml 25戊二醛即可。6姬姆薩-瑞氏染液取磷酸緩沖液(PB：1/15 mol/L, pH7.07.4)10ml，加入姬姆薩染液6滴及瑞氏染液1滴。7Alsever液、Hanks液(無(wú)Ca2+和M

3、g2+, pH7.27.4)、PB(1/15 mol/L, pH7.07.4)、生理鹽水。8離心機(jī)、水浴箱、電冰箱、顯微鏡、離心管、載玻片、蓋玻片、吸管、吸球、注射器?！静襟E和方法】1淋巴細(xì)胞懸液的制備取2ml肝素抗凝血，加入2ml Hanks液，疊加于2ml 淋巴細(xì)胞分離液上，水平離心2000 r/min 20 min。取出單個(gè)核細(xì)胞層，用45倍Hanks液洗2次，每次離心1000r/min 10min。棄去上清液，留下沉淀細(xì)胞約0.2ml。 2Et花環(huán)試驗(yàn)(1)取0.2ml 0.5SRBC懸液和0.1ml小牛血清，加入到沉淀細(xì)胞管中混勻，置37水浴5min。(2)取出離心500 r/min

4、 5min，置412h或過夜。(3)沿管壁加入0.8戊二醛0.2 ml，置420min。(4)棄上清，留約0.2ml，輕輕吹吸混勻沉淀細(xì)胞。(5)結(jié)果觀察濕片法觀察：取1滴細(xì)胞懸液滴加于載玻片上，加入少許姬姆薩-瑞氏染液染色，加蓋玻片后高倍鏡下觀察。干片法觀察：取細(xì)胞懸液涂片，自然干燥，用姬姆薩-瑞氏染液染10min，水洗，干燥后高倍鏡或油鏡下觀察。3Ea花環(huán)試驗(yàn) 與Et花環(huán)試驗(yàn)基本相同，不同之處是SRBC懸液的濃度為0.1， SRBC與淋巴細(xì)胞混合之比為10:120:1，混合后立即離心1000r/min 5min。加入戊二醛固定，染色，觀察均與Et花環(huán)試驗(yàn)相同?！窘Y(jié)果判定】淋巴細(xì)胞呈藍(lán)紫色或

5、淡藍(lán)色，SRBC不著色，凡結(jié)合3個(gè)SRBC或以上者為E花環(huán)形成細(xì)胞(ERFC)。計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，求出E花環(huán)形成率()。正常值：EtRFC為 60%80，EaRFC為20%40?！咀⒁馐马?xiàng)】1SRBC與淋巴細(xì)胞混合后離心速度不能過高，在Et花環(huán)試驗(yàn)中，置4應(yīng)至少1h以上或過夜。2綿羊紅細(xì)胞以保存1周內(nèi)者最好，超過2周與淋巴細(xì)胞結(jié)合力下降，超過56周則不能再用。3Et花環(huán)試驗(yàn)SRBC與淋巴細(xì)胞混合比例以100:1200:1為宜，Ea花環(huán)試驗(yàn)中以10:1 20:1為宜；淋巴細(xì)胞離體后不能超過6h；否則會(huì)影響花環(huán)形成率。4溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，故實(shí)驗(yàn)溫度條件應(yīng)保持一致，從4取出后應(yīng)立即計(jì)數(shù)。5

6、計(jì)數(shù)前將沉淀細(xì)胞重懸時(shí)，使細(xì)胞團(tuán)塊松散均勻即可，不可強(qiáng)力吹打，以免SRBC從淋巴細(xì)胞上脫落?！痉椒ㄔu(píng)價(jià)】方法簡(jiǎn)便易行，曾被廣泛應(yīng)用，但影響因素較多，結(jié)果偏差較大，故細(xì)胞計(jì)數(shù)已被CD抗原免疫檢測(cè)法取代?！九R床意義】 可用于先天性細(xì)胞免疫缺陷病的檢測(cè)；腫瘤病人療效觀察及預(yù)后判斷；評(píng)價(jià)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，某些感染和組織器官移植，可了解機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)；探討某些疾病發(fā)病機(jī)理；考核藥物療效及研究藥物作用機(jī)理；也可用于T淋巴細(xì)胞的分離?！舅伎碱}】E花環(huán)試驗(yàn)原理與EA、EAC花環(huán)試驗(yàn)有何不同？二、T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)(T lymphocyte subset assay)人T淋巴細(xì)胞表面具有CD3、CD4、CD8

7、等多種分子，通過檢測(cè)這些分化抗原鑒定T細(xì)胞及其亞群的方法有多種，歸納起來有兩大類：一類是用標(biāo)記的抗體著染細(xì)胞，之后根據(jù)標(biāo)記物不同，采用相應(yīng)的方法對(duì)CD抗原進(jìn)行檢測(cè)分析，如免疫熒光法、免疫酶法、ABC法及免疫金銀染色法等；另一類是用抗CD抗原抗體致敏的紅細(xì)胞與淋巴細(xì)胞做花環(huán)形成試驗(yàn)。兩類方法各具特點(diǎn)，以下分別選取兩類方法中較具代表性的一種加以介紹： (一) 間接免疫熒光法【實(shí)驗(yàn)原理】 利用鼠源抗CD抗原單克隆抗體與淋巴細(xì)胞反應(yīng)，然后再采用熒光素標(biāo)記的羊(或兔)抗鼠IgG的第二抗體進(jìn)行染色，最后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，即可測(cè)知T細(xì)胞亞群數(shù)量、百分率及比值。 【試劑與器材】

8、1抗CD3、CD4、CD8抗原單克隆抗體。 2FITC標(biāo)記羊(或兔)抗鼠IgG抗體(第二抗體)。 3淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077±0.001)。 4含2% BSA的無(wú)Ca2+、Mg2+ Hanks液(PH7.2±0.2)，Hanks液。 5熒光顯微鏡、離心機(jī)、離心管、吸管、試管、Eppendorf微量管、玻片等。 【步驟與方法】 1取肝素抗凝靜脈血2ml，常規(guī)用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，以含2% BSA的無(wú)Ca2+、Mg2+ Hanks液洗滌3次并重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/ml備用。 2取4只Eppendorf 微量管，各加入淋巴細(xì)胞懸液5

9、0l，然后分別加入適當(dāng)稀釋的抗CD3、CD4、CD8 單抗各50l，另一管加50l Hanks液作為陰性對(duì)照，輕輕混勻，冰浴或4作用3060 min。 3取出反應(yīng)管，用Hanks液洗滌3次(每次1000r/min離心1 min)，棄上清，留取沉淀細(xì)胞。每管加入適當(dāng)稀釋的FITC標(biāo)記羊(或兔)抗鼠IgG抗體(第二抗體)50l，輕輕混勻，冰浴或4作用3060 min。 4取出反應(yīng)管，用Hanks液洗滌3次(每次1000r/min離心1 min)，并用Hanks液重懸至原量。用吸管取樣滴于載玻片上，加蓋玻片后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。 【結(jié)果判定】 1先用普通光源計(jì)數(shù)視野中的淋巴細(xì)胞總數(shù)，再改用紫外光

10、源計(jì)數(shù)同一視野中的熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)其百分比。 2熒光強(qiáng)度分級(jí)：“”為無(wú)熒光著色；“±”為弱的可疑熒光；“”為細(xì)胞膜點(diǎn)狀熒光著色，熒光弱但清晰可見；“”為細(xì)胞膜點(diǎn)狀熒光著色，熒光清晰明亮；熒光閃亮為“”至“”。特異性反應(yīng)熒光強(qiáng)度應(yīng)達(dá)“”以上。3一般需計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，從中統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞百分率，計(jì)算CD4+/CD8+比值。4正常參考值： CD3+：66.0±9.9%； CD4+：43.8±9.0； CD8+：31.3±7.0%。在確定正常值范圍時(shí)，應(yīng)據(jù)不同試劑盒情況加以調(diào)整，以求準(zhǔn)確?！咀⒁馐马?xiàng)】 1實(shí)驗(yàn)過程中，離心速度不宜過大，洗滌和混勻操作亦應(yīng)動(dòng)作

11、輕柔。 2非特異熒光的問題：由于非特異熒光來源較多，首先應(yīng)在進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定各抗體的最佳濃度，尤其是熒光標(biāo)記第二抗體的濃度；其次在判定結(jié)果時(shí)，應(yīng)認(rèn)真觀察陰性對(duì)照，對(duì)于非特異熒光導(dǎo)致的假陽(yáng)性仔細(xì)加以排除。為減少試驗(yàn)誤差，對(duì)于死細(xì)胞及分散不好的細(xì)胞團(tuán)塊應(yīng)不作計(jì)數(shù)。 3被檢測(cè)標(biāo)本應(yīng)新鮮，熒光染色后的標(biāo)本最好當(dāng)日觀察，否則隨時(shí)間延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降而影響結(jié)果的可靠性?！痉椒ㄔu(píng)價(jià)】 該方法是目前臨床上檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群較為常用的方法，其優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)且敏感性較好，缺點(diǎn)是標(biāo)本不能長(zhǎng)期保存，而且結(jié)果判定易受主觀因素影響。在熒光染色后，如能采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在一定程度上可以使結(jié)果更為客觀、

12、準(zhǔn)確。【臨床意義】 T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定對(duì)于檢測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能具有重要的參考價(jià)值，對(duì)于臨床上一些免疫缺陷病、自身免疫病、移植免疫、及腫瘤性疾病的診斷及療效觀察均有一定的參考意義。CD4+/CD8+比值可作為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能的重要指標(biāo)之一。 (二)抗體致敏紅細(xì)胞花環(huán)形成法【實(shí)驗(yàn)原理】 用抗CD抗原單克隆抗體致敏的醛化綿羊紅細(xì)胞作為指示物，在將該紅細(xì)胞與受檢淋巴細(xì)胞反應(yīng)后，借助單抗與淋巴細(xì)胞表面對(duì)應(yīng)CD抗原的結(jié)合，使抗體致敏的紅細(xì)胞吸附于對(duì)應(yīng)淋巴細(xì)胞表面而形成花環(huán)，然后在顯微鏡下計(jì)數(shù)花環(huán)陽(yáng)性細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其百分率。【試劑與器材】 1CD系列單抗致敏紅細(xì)胞試劑。 2無(wú)Ca2+、Mg2+ Hanks

13、液。 3含20%新生牛血清的無(wú)Ca2+、Mg2+ Hanks 液。 4離心機(jī)、離心管、吸管、試管、Eppendorf 微量管、玻片，普通顯微鏡等?！静襟E與方法】 1取肝素(50U/ml)抗凝血2 ml，常規(guī)用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，以含20%新生牛血清的無(wú)Ca2+、Mg2+Hanks 液洗滌3次，并重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/ml。將試管呈20°角傾斜放置，于37孵育45min后將細(xì)胞懸液取出置于另一只試管中，原管棄去以去除粘附細(xì)胞。離心去上清并恢復(fù)至原量備用。2根據(jù)待檢樣品取一定量CD系列單抗致敏紅細(xì)胞懸液，離心棄上清，再用含20%新生牛血清的無(wú)Ca

14、2+、Mg2+ Hanks 液恢復(fù)至原量。 3將淋巴細(xì)胞懸液與致敏紅細(xì)胞懸液等量混合(各25l)，室溫(2225)置10min后500 r/min離心10 min，室溫繼續(xù)放置1h, 之后4作用2h 或過夜。4取出反應(yīng)管，輕輕重懸后用Giemsai染液染色30min，用吸管輕輕混勻并吸取標(biāo)本少許滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，普通顯微鏡下觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果判定】用高倍鏡檢查，淋巴細(xì)胞周圍粘附有3個(gè)或以上紅細(xì)胞者為花環(huán)陽(yáng)性細(xì)胞，未粘附紅細(xì)胞者為陰性細(xì)胞，粘附一、二個(gè)紅細(xì)胞者不作計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。共計(jì)數(shù)100200個(gè)淋巴細(xì)胞，算出形成花環(huán)細(xì)胞的百分率?！咀⒁馐马?xiàng)】 1本實(shí)驗(yàn)中抗體致敏紅細(xì)胞試劑務(wù)求新鮮，試劑打開后

15、，盡量避免長(zhǎng)期、反復(fù)使用。 2實(shí)驗(yàn)過程中，離心速度宜?。换靹蚣叭拥纹瑱z測(cè)時(shí)，操作宜輕柔。 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)盡快于當(dāng)日或次日觀察，不應(yīng)長(zhǎng)期放置?！痉椒ㄔu(píng)價(jià)】本方法簡(jiǎn)便、快捷，計(jì)數(shù)結(jié)果方便，不需要熒光顯微鏡等特殊儀器，因此易于應(yīng)用，而且本方法尚可應(yīng)用于淋巴細(xì)胞及其亞群的分離提取，但是結(jié)果同樣易受主觀因素影響。也可以通過用第二抗體(羊或兔抗鼠IgG)致敏的紅細(xì)胞試劑，采取間接花環(huán)形成法進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)，這樣可避免應(yīng)用多種單抗致敏紅細(xì)胞而帶來的不便，使本法應(yīng)用更為方便?！九R床意義】 同方法(一)【思考題】 1T淋巴細(xì)胞表面CD抗原與其細(xì)胞亞群之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系是怎樣的？ 2如何利用上述方法(二)進(jìn)行T細(xì)胞及其亞群

16、的分離與提?。?3為何熒光抗體活細(xì)胞染色在冰浴或4進(jìn)行？ 三、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(Lymphocyte transformation test) T淋巴細(xì)胞在受到非特異性有絲分裂原或特異性抗原刺激后能發(fā)生增殖反應(yīng)，細(xì)胞代謝旺盛，蛋白質(zhì)和核酸合成增加；與此同時(shí)細(xì)胞體積增大，分裂呈母細(xì)胞樣，此為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。因此可借助形態(tài)學(xué)方法，3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)摻入法或MTT比色法測(cè)定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化程度。此處只介紹形態(tài)學(xué)方法和MTT比色法。(一) 形態(tài)學(xué)方法小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)法【實(shí)驗(yàn)原理】植物血凝素(PHA)在小鼠體內(nèi)能刺激T細(xì)胞發(fā)生增殖，可逐漸轉(zhuǎn)化為體積較大的母細(xì)胞，胞漿增多，核增大并可見核仁，也可

17、出現(xiàn)有絲分裂現(xiàn)象。根據(jù)形態(tài)鑒別、計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的百分率可反映機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況?！驹噭┖推鞑摹?小鼠昆明種小白鼠，雄性。2PHA Difco產(chǎn)品(PHA-P)，每瓶用5ml蒸餾水溶解，再加入生理鹽水20ml，終濃度為2mg/ml。3瑞氏染液、75酒精棉球。4注射器、載玻片、剪刀、顯微鏡?！静襟E和方法】每只小鼠每天肌內(nèi)注射PHA 10mg/kg體重(0.10.2 ml)，連續(xù)3天。第8天采尾血推片，自然干燥，瑞氏染色后油鏡下觀察?！窘Y(jié)果判定】1鏡下淋巴細(xì)胞形態(tài)可以見到以下幾種類型。(1)淋巴母細(xì)胞胞體比未轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞大34倍，呈圓形或橢圓形，胞漿染色淡藍(lán)，可有偽足、空泡，細(xì)胞核增大，核質(zhì)疏松

18、，呈細(xì)網(wǎng)狀，可見分裂現(xiàn)象。(2)過渡型淋巴細(xì)胞形態(tài)介于淋巴母細(xì)胞和正常淋巴細(xì)胞之間，體積稍大，多為1215mm，胞漿稍多，淡藍(lán)色，核稍大，核質(zhì)疏松。注意與大淋巴細(xì)胞區(qū)別，后者雖然體積較大，但核質(zhì)致密，胞漿較少，嗜堿性強(qiáng)。(3)正常淋巴細(xì)胞與未經(jīng)刺激的淋巴細(xì)胞一樣，體積小，核質(zhì)致密，胞漿少，嗜堿性強(qiáng)。2淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率計(jì)算按上述判斷標(biāo)準(zhǔn)檢查推片頭、體、尾三部分，計(jì)數(shù)200 個(gè)淋巴細(xì)胞，算出轉(zhuǎn)化率?！咀⒁馐马?xiàng)】1PHA 劑量應(yīng)預(yù)先確定，太大對(duì)小鼠有毒性作用，太小不足以刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，注射劑量常為610mg/kg體重。2為使結(jié)果穩(wěn)定應(yīng)選用體重相近的雄性小鼠，最好選用近交系小鼠?！痉椒ㄔu(píng)價(jià)】本法操作簡(jiǎn)

19、便，排除了體外試驗(yàn)時(shí)人工條件所致的各種因素的影響，結(jié)果穩(wěn)定，能較好反映體內(nèi)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況?！九R床意義】常用于藥物篩選及免疫藥理學(xué)研究，比體外試驗(yàn)結(jié)果較為客觀。(二) MTT比色法【實(shí)驗(yàn)原理】MTT3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，噻唑藍(lán)是淡黃色可溶性物質(zhì)，細(xì)胞增殖時(shí)通過線粒體能量代謝過程，可將MTT代謝裂解還原成藍(lán)紫色的甲(formazan)，沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，甲的形成量與細(xì)胞增殖程度呈正比。甲經(jīng)異丙醇溶解后呈藍(lán)紫色，比色測(cè)定即可知細(xì)胞增殖程度。 【試劑和器材】1RPMI-1640培養(yǎng)液用前加入10小牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100g/ml、谷氨酰胺30.0g/L，用NaHCO3調(diào)pH至7.27.4。2PHA 用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液配成10mg/ml。3MTT取MTT 50mg，溶于10ml 0.01mol/L pH7.4 PBS中，用