精子頂體酶活性與頂體圖像定量的相關(guān)性研究

1、精子頂體酶活性與頂體圖像定量的相關(guān)性研究吳勵(lì)梅1李林1曹航1黎運(yùn)西1唐躍華2 (1南方醫(yī)科大學(xué)附屬順德第一人民 醫(yī)院生殖健康與不孕科 廣東順德528300) (2惠州市第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn) 中心廣東惠州 516000)【中圖分類號】r321.1【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】a【文章編號】1672-5085 ( 2012 )49-0183-02【摘要】目的 探討精子頂體酶活性與精子頭部頂體面積、灰度值之間的相關(guān) 性。方法用改良kennedy法測定精子頂體酶活性，采用圖像定量分析軟件scoion image測量以改良巴氏染色法染色的精子頭部頂體面積及灰度值。結(jié)果頂體酶 活性與灰度值之間存在相關(guān)性(p &l

2、t;0.05),頂體酶活性與頂體面積不相關(guān)(p &gt；0.05)o結(jié)論 精子頂體圖像定量分析結(jié)合頂體酶活性，在男性不育癥因素分析 中可提高參考價(jià)值?！娟P(guān)健詞】精子頂體酶 頂體面積 灰度值近年來，精子頂體酶活性被認(rèn)為是衡量男性生育力很有價(jià)值的指標(biāo)之一。 精子形態(tài)異常導(dǎo)致精子頂體酶活性降低，可能是畸形精子癥、弱精癥和少精子癥 患者不育的原因之一2。由于頂體酶僅存在于精子頭部頂體內(nèi)，頂體面積及灰 度值與頂體酶之間是否相關(guān)是值得關(guān)注的問題，國內(nèi)也少見報(bào)道。木文研究了 100例勢性不育患者的精子頂體酶活性與頂體面積、灰度值的相關(guān)性，旨在為臨 床評價(jià)另性牛育力提供更客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如

3、下。1資料與方法1.1 一般資料100例樣木來自2011年4月2012年3月來我院生殖 健康與不孕科就診的勢性不育患者，年齡2249歲，平均30.93歲，身體健康， 婚后正常性?；?年以上不育，無外傷及遺傳性疾病家族史,無性功能障礙病史， 排除患者有牛殖系統(tǒng)感染及明顯牛殖系統(tǒng)疾病。剔除液化不良、少精、形態(tài)學(xué)無 頂體畸形精子的標(biāo)木。1.2標(biāo)木的采集 受試者禁欲37天后手淫取全部精液于潔凈無菌的 一次性采精杯內(nèi)，置37°c水浴箱內(nèi)，待其完全液化后進(jìn)行檢測。1.3頂體酶活性測定采用改良kennedy法測定精子頂體酶活性，試 劑盒購自深圳華康生物學(xué)工程有限公司。1.4頂體圖像分析 形態(tài)學(xué)片采

4、用改良巴氏染色，精子核著色較深， 呈現(xiàn)深藍(lán)色，頂體區(qū)域著色較淺，空泡不著色。把經(jīng)過染色的涂片置于顯微鏡下， 用×100油鏡觀察，計(jì)算機(jī)圖像采集系統(tǒng)攝像，再利用專業(yè)圖像定量分析軟 件scion image測量精子頭部頂體面積(減去空泡面積)及灰度值(在頂體區(qū)域 的頂、底、左、右、中部各取一點(diǎn)測灰度值，求得均數(shù)，并且剔除背景灰度值)。 測得的頂體面積以像素值計(jì)量。1.5儀器設(shè)備上?？迫Ast-360酶標(biāo)儀、eppendorf高速離心機(jī)、計(jì)算 機(jī)圖像采集系統(tǒng)。1.6統(tǒng)計(jì)分析 采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以(x-±s) 表示，以p<0.0

5、5為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1頂體酶活性與灰度值呈顯著正相關(guān)(r=0.309, p<0.05)o見表例數(shù)(n)均值±標(biāo)準(zhǔn)差r值p值頂體酶活性(ulu/106 精子)100 91.35±54.71 0.309 0.002灰度值 100 34.95±5.742.2頂體酶活性與頂體面積不相關(guān)(r=0.094, p >0.05)。見表2。例數(shù)(n)均值±標(biāo)準(zhǔn)差r值p值頂體酶活性(ulu/106 精子)100 91.35±54.71 0.094 0.351頂體面積

6、(平方像素)100 310.06±76.733討論正常形態(tài)精子的頂體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為完整的雙層膜性結(jié)構(gòu)，呈平行貼于核表 面。頂體內(nèi)含有多種水解蛋白酶，精子頂體酶以-種胰蛋白酶原形式合成并儲存 在頂體內(nèi)，當(dāng)精子與卵子相遇發(fā)生頂體反應(yīng)吋，精子頂體膜與質(zhì)膜融合并發(fā)生變 化，膜通透性增加，頂體酶原釋放并活化為頂體酶，溶解卵子外圍的放射冠和透 明帶，形成一條通道以利于精子與卵子結(jié)合，完成受精過程。精子頂體酶活性低 下或頂體形態(tài)異常會影響卵丘的分解及對透明帶的穿透3。只有頂體完整的精 子才能與透明帶結(jié)合4。精子頂體的完整性能反映精子頂體酶含量的多少，因 為頂體不完整的精子頂體酶會漏岀5。頂

7、體不完整常有以下情況：頂體缺乏、 頂體薄、體積小、泡狀頂體、無內(nèi)容物或電子密度低等。這些類型的精子頂體酶 缺失或活性降低，精子不能穿透放射冠和透明帶，受精率降低。頂體內(nèi)容物呈中等致密，均質(zhì)性，經(jīng)改良巴氏染色后，頂體區(qū)域著色較 淺呈淡藍(lán)色，清晰可辨。顏色的深淺程度可用圖像灰度值來表示。本研究結(jié)果顯 示，精子頂體酶活性與頭部頂體灰度值存在顯著正相關(guān)(r二0309,p<0.05),說明灰 度值是頂體酶含量在形態(tài)學(xué)上的另一種表現(xiàn)形式，能反映精子頂體酶含量的多少。 為了讓測量結(jié)果更準(zhǔn)確，涂片吋精子要分布均勻無重疊，染色后精子形態(tài)結(jié)構(gòu)清 晰，背景明凈，否則要重新制片。有研究表明，精子頭部犬小

8、可影響自發(fā)性頂體反應(yīng)發(fā)生，與小頂體精子 相比，大頂體和正常頂體精子自發(fā)性頂體反應(yīng)率增高7。張泓、中洪等采用圖 像定量分析系統(tǒng)對男性不育精子進(jìn)行頭面積測量和比較認(rèn)為，精子頭面積有可能 作為判斷精子質(zhì)量的指標(biāo)之一，頭面積增大吋，精子的質(zhì)量可能會降低8。此 研究從定量的角度表明，精子頭部面積與精子質(zhì)量存在線性相關(guān)，但未進(jìn)行單獨(dú) 頂體區(qū)域面積的定量分析。本研究用圖像定量分析軟件測量經(jīng)改良巴氏染色的精 子頭部頂體面積與精子頂體酶活性比較。結(jié)果顯示兩者不存在相關(guān)性。筆者推測， 在一定范圍內(nèi)，頂體面積與頂體酶是呈正相關(guān)的，而當(dāng)頂體面積增大吋，頂體會 變薄，甚至內(nèi)容物分布不均、出現(xiàn)大空泡或密集小空泡，繼而影響

9、酶活性。所以， 研究吋應(yīng)該增大樣本量并分組比較，或者會有新的發(fā)現(xiàn)，亦期待將來有更先進(jìn)的 儀器和技術(shù)對精子圖像分析作進(jìn)一步研究。也有文獻(xiàn)報(bào)道，精子頂體酶與頂 體比呈顯著負(fù)相關(guān)，提示精子頂體酶的含量隨精子頂體比例越多而越少。綜上所 述，或者可以解釋一部分臨床上不育患者的精子正常形態(tài)率低而頂體酶正常的原 因。目前，經(jīng)典光學(xué)顯微鏡油鏡下人工觀察精子形態(tài)學(xué)，主觀因素大，技術(shù) 參差；自動精子形態(tài)分析儀亦需人工修正。做好質(zhì)量控制和加強(qiáng)技術(shù)員培訓(xùn)是提 高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的參考價(jià)值的重要措施?，F(xiàn)行的頂體酶活性測定方法所用大量的精子 中含有活動精子、死精子及無頂體精子，所以并不能準(zhǔn)確地反映精子穿透透明帶 能力。若使用經(jīng)過

10、上游法處理的精子進(jìn)行頂體酶活性測定，并結(jié)合頂體圖像分析 則能更準(zhǔn)確、客觀地預(yù)測精子的受精能力。參考文獻(xiàn)1陳欣潔，龍曉林，孫筱放，等頂體酶活性對體外受精胚胎移植結(jié)局的影響卩中 華男科學(xué)雜志,2009,15(1):17.侯毅，劉媛，劉睿智，等形態(tài)正常精子百分率與頂體酶活性的關(guān)系j中國婦幼 保健，2005,20(23):3153-3154.3 歐陽冰清,曹云霞，等頂體酶活性與精子質(zhì)量的關(guān)系j安徽醫(yī)藥,2007,11(6):528.4 liu dy & baker hwg.inducing the human acrosome reaction whit a calcium ionop

11、hore a23187 decreases sperm-zona pellucida binding whit oocytes that failed to fertilize in vitro. j reprod fertil,1990,89(1):12734.蘇旳,周性明，等人精子頂體完整率的測定及其臨床意義j江蘇醫(yī)藥,1999,25(2):103.6 langlois mr,oorlynck l,vandekerckhove f,et al.discrepancy between sperm acrosin activity and sperm morphology:significanee for fertilization in vitroj.ciin chim acta,2005/351(l-2):121. menkveld r,ei-garem schill wb,et al relatoinship between