斑馬魚原位雜交實驗方案

1、表觀遺傳學與表觀基因組學斑馬魚全胚胎原位雜交技術(shù)Form Dr. Kevin 第一節(jié)   原位雜交技術(shù)的歷史Joseph G. Gall被譽為現(xiàn)代細胞生物學的一位奠基人，他在染色體結(jié)構(gòu)和功能領(lǐng)域作出了杰出貢獻，并發(fā)明了原位雜交技術(shù)（in situhybridization，ISH）。自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性標記DNA在爪蟾組織切片中檢測基因表達后，原位雜交技術(shù)逐漸發(fā)展為一種能使研究人員在一個染色體上定位并確定出基因和特殊的DNA序列的強大方法，推動了分子生物學的巨大進步。Kathl

2、een H. Cox于1984年發(fā)明了用單鏈RNA探針進行原位雜交的技術(shù)。ISH技術(shù)在斑馬魚中的應用始于Westerfield等利用該技術(shù)在斑馬魚切片中檢測基因的表達。同年, Nusslein-Volhard 等將Cox 建立的RNA 原位雜交技術(shù)進行了改進, 用地高辛（digoxin）標記的RNA 在斑馬魚胚胎中檢測基因表達。2008 年, Bernard Thisse 等將該技術(shù)進一步優(yōu)化, 使之更敏感, 也提高了基因表達檢測的分辨率，我們在這里介紹的整胚原位雜交技術(shù)主要參照Thisse實驗室2008年版本 （Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High re

3、solution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 69）。第二節(jié) 原位雜交技術(shù)的原理原位雜交能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對于那些細胞數(shù)量少且散在于其他組織中的細胞內(nèi)DNA或RNA研究更為方便；同時由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細胞的形態(tài)，更能準確地反映出組織細胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。整胚原位雜交（whole-mount in

4、situ hybridization）不同于一般的在載片上對細胞和組織切片進行探針雜交及檢測的原位雜交，而是對完整的斑馬魚胚胎進行探針雜交及檢測，從整體上把握探針的結(jié)合部位。整胚原位雜交指在胚胎組織或細胞結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測組織中相應的基因片段相結(jié)合（雜交），所形成的雜交體 (Hybrids）經(jīng)顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內(nèi)相應的mRNA、rRNA和tRNA分子。該技術(shù)不僅可以用于檢測基因的時空表達, 為研究該基因功能以及基因分類提供線索，還可以應用于高通量藥物篩選或突變體篩選中, 以特異表達的基因標

5、記作為篩選的重要依據(jù)。（圖5.1）圖5.1 斑馬魚整胚原位雜交技術(shù)原理。地高辛標記的反義RNA 探針與細胞內(nèi)的mRNA 特異性結(jié)合, 利用免疫組織化學的方法, 堿性磷酸酶結(jié)合的抗地高辛抗體與雜交的核酸探針特異性結(jié)合, 然后用堿性磷酸酶的發(fā)光底物進行顯色。圖中原位雜交結(jié)果為24 hpf myl7和tpma基因的表達情況。第三節(jié) 原位雜交技術(shù)的要點由于核酸探針的種類和標記物的不同，在具體應用的技術(shù)方法上也各有差異，但基本方法和應用原則大致相同。主要包括以下幾步：雜交前準備（取材和固定）組織的處理（增強核酸探針的穿透性/減低背景染色）雜交反應雜交后處理顯示（放射性自顯影

6、或非放射性標記的顯色）1、固定原位雜交技術(shù)(In Situ Hybridization, ISH)在固定劑的應用和選擇上應兼顧到三個方面：保持細胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細胞內(nèi)DNA或RNA的水平，使探針易于進入細胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。故對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。而在RNA的定位上，要使RNA的降解減少到最低限度，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。最常用的固定劑是多聚甲醛，多聚甲醛不會與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞或組織。我們常采用的方法是將組織固定

7、于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中置4?C冰箱過夜。各種固定劑均有各自優(yōu)缺點，如沉淀性(Precipitating)固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouins液、 Carnoys液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。戊二醛能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認為ISH較為理想的固定劑。2、組織的處理2.1、增強組織的通透性和核酸探針的穿透性此步驟根據(jù)應用固定劑的種類、組織的種類和核酸探針的長度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應用較

8、強的增強組織通透性的試劑。增強組織通透性常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑(detergent)或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。這種廣泛的去蛋白作用可以增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但也會影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此應掌握好用量和孵育時間。使用較為廣泛的是蛋白酶K(Proteinase K)，一般工作濃度為1g/ml，孵育時間視胚胎組織發(fā)育階段而定，跨度從1到30min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為準。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號。在蛋白酶

9、K消化后，應用0.1mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。2.2、減低背景染色ISH中背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。預雜交和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。將固定的組織浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。有的實驗室在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液(20 g/ml)洗滌一次，以減低殘留的和內(nèi)源性RNA，減低背景染色。2.3、防止RNA酶的污染由于在手指皮膚及實驗用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結(jié)果，在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實驗用

10、玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫烘烤或使用DEPC過夜處理以達到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150?C左右?？梢栽谙镜牟Ａ髅笸獍藻a箔紙以利于標記和防止取出時空氣污染。雜交前及雜交時所應用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。3、雜交反應雜交前的一切準備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進入細胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合，雜交是ISH中關(guān)鍵且最重要的一個環(huán)節(jié)。要獲得滿意的實驗結(jié)果，在雜交這一實驗過程中還須注意以下的環(huán)節(jié)。3.1、探針的濃度很難事先確定每一種實驗探針的濃度，但要掌握一個原則，即探針濃度必須給予該實驗最大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針

11、濃度有關(guān)。原位雜交的探針可以是同位素的探針，用放射自顯影來檢測；也可以是非同位素的探針，通過熒光或化學顯色法予以檢測。探針濃度依其種類和實驗需要略有不同，放射性標記的dsDNA或cRNA探針濃度在15 ng/l，而非放射性標記（生物素或地高辛）cRNA探針，其最佳濃度在0.55 ng/l。同時雜交液的量要適當，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導致高背景染色等不良后果。我們實驗中使用的是以地高辛(DIG)標記的反義RNA探針，通過DNA 轉(zhuǎn)錄而來的。常采用的方法是以總RNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板, 克隆得到相應的DNA 片段, 并將該片段連接到pGEM-T 或pGEM-T easy 載體中, 通

12、過轉(zhuǎn)化獲得反向重組質(zhì)粒。并以此為模板, 在體外用相應的T7 或T3 RNA 聚合酶進行轉(zhuǎn)錄（應避免使用SP6 RNA 聚合酶，整合DIG標記的UTP效率較低）。相對于直接用PCR產(chǎn)物為模板轉(zhuǎn)錄得到反義RNA 探針的方法, 該方法所需時間比較長, 但探針獲得量較大, 而且各階段所得的產(chǎn)物相對比較穩(wěn)定, 可長時間儲存。3.2、探針的長度用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。對于反義RNA 探針，要想獲得較理想的標記效果，長度最好大于1 Kb。有時候短探針也可以獲得較好的效果，但最短也不宜小于200 bp。當兩個基因的序列相似度較高，設計特異性的探針相當有挑戰(zhàn)性。一

13、般而言探針長度為2001200 bp，過長則雜交效率減低。為減少非特異性結(jié)合，在設計探針時常常選擇覆蓋部分3非翻譯區(qū)（3' untranslated region, UTR）。3.3、雜交的溫度和時間雜交的溫度也是雜交成功與否的一個重要環(huán)節(jié)，DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。能使50%的核苷酸變性解鏈所需的溫度，叫解鏈溫度或融解溫度(melting temperature, 簡稱Tm)。原位雜交中，多數(shù)DNA探針需要的Tm是90?C，而RNA則需要95?C。這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。Tm值與鹽的濃度、探針的長度、甲酰胺的百分比等諸多

14、因素有關(guān)。因此，在雜交的程序中常規(guī)的加入30%50%甲酰胺(formamide)于雜交液中。McConaughy發(fā)現(xiàn)，反應液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72?C。此外還可以通過調(diào)節(jié)鹽濃度的辦法來調(diào)節(jié)Tm。在實際操作中，采用的雜交溫度在（Tm-25?C）左右，即比Tm減低25?C，大約在5070?C之間，根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異。雜交的時間如過短會造成雜交不完全，而過長則會增加非特異性染色。理論上核苷酸雜交的有效反應時間在3h左右，為穩(wěn)妥起見，一般將雜交反應時間定為1620h（雜交孵育過夜）。雜交反應的時間與核酸探針長度與組織通透性有關(guān)，在確定雜交反應時間應予以考慮，并經(jīng)反

15、復實驗確定。此外，甲酰胺還可防止在低溫時非同源性片段的結(jié)合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩(wěn)定的作用。故有研究者主張雜交反應的孵育應在黑暗環(huán)境中進行，因為光線會促進甲酰胺的電離作用。3.4、雜交嚴格度雜交嚴格度(Hybridization stringency)表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。不完全配對雜交體的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應亦然。一般來說，低嚴格度雜交及沖洗條件在（Tm-35?C）至（Tm-40?C）之間，高鹽或低甲酰

16、胺濃度下，大約有70%90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，其結(jié)果是導致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。中嚴格度，（Tm-20?C）至（Tm-30?C）的范圍。高嚴格度為（Tm-10?C）至（Tm-15?C），低鹽和高甲酰胺濃度下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。原位雜交技術(shù)多數(shù)是在Tm-25?C進行的，不屬于高嚴格度范圍，會產(chǎn)生非特異性結(jié)合導致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強雜交后沖洗的嚴格度使非特異性的雜交體減少。由于RNA雜交的穩(wěn)定性，應用cRNA探針進行細胞或組織的原位雜交時的雜交溫度比其它核酸探針要高1015?C。實驗證明，cRNA產(chǎn)生的信號比雙鏈cDNA要強。單鏈的RNA探針

17、其雜交信號大于雙鏈的cDNA的約8倍。 4、雜交后處理雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。因為大多數(shù)的原位雜交實驗是在嚴格度不高的條件下進行的，非特異性的結(jié)合會增強背景染色。RNA探針雜交時產(chǎn)生的背景染色特別高，但能通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低。在漂洗液中常加入Tween-20，有復性抗原的作用，可提高特異性的識別能力。Tween-20為聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯和一部分聚氧乙烯雙去水山梨醇單月桂酸酯的混合物，是

18、一種非離子型去污劑。如何控制漂洗的嚴格度從而達到理想的信/噪比無既定方案可循，必須從反復的實踐中取得經(jīng)驗。在做抗體反應前，需要先用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉組織上的未結(jié)合位點可以降低抗體的非特異性結(jié)合。封閉劑應該封閉所有未結(jié)合位點而不替換靶標，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應。最常見的封閉劑是BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液。5、顯示根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。放射自顯影可利用人工或計算機輔助的圖象分析檢測儀(computer-assisted image analysis)檢測銀粒的數(shù)量和分布的差

19、異。非放射性核酸探針雜交的細胞或組織可利用酶檢測系統(tǒng)顯色。5.1、幾種常見探針及其特點探針是指帶有標記的能與組織內(nèi)相對應的核苷酸序列互補結(jié)合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。根據(jù)在雜交中所使用的探針依其來源可分為三種：即特異性cRNA、cDNA探針和人工合成寡核苷酸探針。cRNA探針cRNA探針是以cDNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄而獲得的單鏈探針。cRNA與RNA之間形成的雜交體要比cDNA-RNA雜交體穩(wěn)定。cRNA-RNA雜交體不受RNA酶的影響，雜交反應后可用RNA酶處理，以除去未結(jié)合的探針。cRNA探針的雜交飽和水平又比雙鏈DNA探針高出8倍，在原位雜交中應用廣泛。但cRNA探針的制備過程

20、比較復雜，需要較好的分子生物學實驗設備，它對RNA酶敏感，易降解，操作中要謹防RNA酶污染。單鏈cDNA探針由于cDNA中不存在內(nèi)含子及其它高度重復序列，又克服了雙鏈cDNA探針在雜交反應中兩條鏈之間復性的缺點，從而提高了雜交反應的敏感性。但由于單鏈cDNA探針的制備比較困難，在RNA原位雜交中已很少見有應用。寡核苷酸探針人工合成的寡核苷探針是以核苷酸為原料，通過DNA合成儀合成，避免了真核細胞中存在的高度重復序列帶來的不利影響。由于大多數(shù)寡核苷酸序列較短，不需要純化，組織穿透性極好。根椐目的基因的特異性序列設計的探針，特異性較強。合成的寡核苷酸探針的缺點是：探針長度必須適宜，探針太長可造成內(nèi)

21、部錯誤配對雜交，探針太短可形成非特異性結(jié)合。它與mRNA形成的雜交體不如cRNA-RNA雜交體穩(wěn)定，再則探針較短，所攜帶的標記物少，敏感性較低。探針設計的位置很重要,為了避免檢測mRNA時基因組序列的干擾，設計探針時盡量選擇在跨內(nèi)含子的部位，就是能檢測到mRNA，但檢測不到基因組序列。依標記物不同，探針又可分為同位素標記探針和非同位素標記探針兩大類。前者主要包括3H 、35C、32P和125I等，不同的同位素探針其穿透力，定位和半衰期各不相同，無一種同位素探針具有穿透力強、定位好和半衰期長所有優(yōu)點。由于半衰斯短，性能不穩(wěn)定，污染環(huán)境和危害健康等原因，在RNA原位雜交中應用同位素標記探針已日趨減

22、少，而非同位素標記探針在近年來得到迅速發(fā)展，其標記物主要有生物素、地高辛、酶和熒光標記等。其中地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優(yōu)點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干擾等缺點，其應用越來越廣泛。第四節(jié) 斑馬魚整胚原位雜交實驗流程斑馬魚整胚原位雜交（whole-mount in situ hybridization, WISH）技術(shù)流程如圖5.2所示，藍色框部分表示探針合成，深綠色部分表示材料準備，淺綠色部分表示W(wǎng)ISH第1天實驗內(nèi)容，黃色部分代表WISH第2天實驗內(nèi)容，橙黃色部分表示W(wǎng)ISH第3天實驗內(nèi)容，粉色部分表示W(wǎng)I

23、SH最后一步。每一步實驗需要的時間在框旁注明（O/N：過夜處理）。箭頭上并行的兩條紅線表示W(wǎng)ISH可在上一步結(jié)束后依據(jù)相應條件有較長時間中斷而不影響實驗結(jié)果。（圖5.2）1、探針制備探針制備體系如下表所示ComponentAmount per reactionFinalLinear Template DNA6.0 l100-200 ng5x Transcription buffer2.0 l1XDTT 0.1M10 mMDIG-RNA labeling mix (UTP)1.0 lRNAsein (40U/l)0.5 l10 UT3 or T7 RNA polymerase (20U/l)0.

24、5 l5UTotal10 ul  圖5.2 整胚原位雜交技術(shù)流程圖 （引自：Thisse, C. and Thisse, B., 2008）1)      混勻后在37°C 反應2小時。2)      10 l的反應體系中加入2 l RNAse-free DNAse I和18 l RNAse-free水?；靹蚝笤?7°C 反應30 min。3)      加入1 l RNAse-free

25、的 0.5 M EDTA 和 9 l RNAse-free水終止反應。4)      將Sigma spin Post Reaction 純化柱放入一個收集管中，750 g (=2800 rpm)離心15 s。5)      將純化柱去尾去蓋，750 g離心2 mins。6)      將純化柱放入一個新的RNAse-free的EP管中，將RNA反應液慢慢加入到純化柱的凝膠柱上，750 g離心4 mins。7)   

26、   加入1 l RNAse-free的EDTA 0.5M 和 9 l of RNAlater （RNAlater 有防止RNA降解的作用，毒性較大，小心操作)，取1-2 ul合成液電泳檢測。 2、材料準備1)      收集斑馬魚受精卵，放于35mm平皿中，加入少量的egg water覆蓋胚胎即可。2)      待胚膜略微膨起，加入100-200 ul Pronase (1/100比例加入，儲液為20 mg/ml)，混勻，定時查看，一般消化1min左右

27、。3)      當觀察到有個別胚胎出膜，立即將整皿胚胎轉(zhuǎn)入裝滿養(yǎng)殖水的250 ml燒杯中，輕輕洗3次，即可將大部分的胚膜脫除。4)      使用玻璃吸管將胚胎轉(zhuǎn)入盛滿0.3 x Danieau medium 的2%瓊脂平皿中，注意此時的胚胎十分脆弱，應小心操作，保持處于液面下，避免接觸空氣。重復操作一次后即可轉(zhuǎn)入干凈的瓊脂平皿中飼養(yǎng)。5)      養(yǎng)殖密度大約是100枚胚胎/100 mm平皿，胚胎盡量分散培養(yǎng)，以保證充足的生存空間。6)&#

28、160;     28.5度生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，前2天每半天換一次新鮮的0.3 x Danieau medium。7)      當胚胎發(fā)育到目標時期，使用4% (wt/vol) 多聚甲醛（PFA, paraformaldehyde）PBS緩沖液4?C固定過夜。8)      胚胎于24 hpf開始出現(xiàn)少量的黑色素，后期日漸增多，色素會影響觀察。一般采取在體節(jié)期或20 hpf時加入1-Phenyl-2-Thiourea (PTU，使用濃度為0.0045%)，

29、以阻斷色素形成，一天換一次液?；蛘呤褂秒p氧水處理，以去除色素。9)      第二天進行梯度脫水：將固定的胚胎從4%多聚甲醛中逐步替換成100%甲醇(三次每次15min)。10)   更換新鮮的100%甲醇，在-20?C 保存，可達數(shù)月之久。待用胚胎最好在甲醇中過夜或至少2個小時，可以使組織間的空隙更大，利于探針的結(jié)合。 3、原位雜交原位雜交第一天梯度復水（室溫下）1)      1次x 5 min     

30、0;                                    100% Methanol2)      1次x 5 min   

31、0;                                       75% Methanol -25% PBS3)     

32、1次x 5 min                                           50% Methanol -50% PBS4)

33、      1次x 5 min                                           25

34、% Methanol -75% PBS5)      4次x 5 min                                      &

35、#160;    PBT (PBS 1 x / tween20 0.1%)蛋白酶處理與固定（室溫下）6)      胚胎雜交前應先使用蛋白酶K（儲液為10 mg/ml，以1/1000比例加入PBT稀釋）處理，以疏松組織，便于雜交。發(fā)育時期不同的胚胎采用不同消化的時間（下列時間以供參考）。              For embryos at 75 % epiboly

36、 (Gastrula)                             0 min              For embryos from 5-6 somit

37、es (ES)                                  1 min              For e

38、mbryos from 18-20 somites (MS)                             3 min              For embryos

39、of 24 h                                                 

40、;         10 min              For embryos of 36 h                       

41、60;                                  20 min              For embr

42、yos of 48 h and later                                            30 min7)  

43、    終止酶消化與固定： 1次x 20 min  4% PFA-PBS8)      洗脫：5次 x 5 min  PBT9)      將胚胎轉(zhuǎn)入1.5 ml RNAse-free 的EP管中。 圖5.3 原位雜交第一天，在24孔板中胚胎梯度復水與蛋白酶K處理過程圖示。 預雜交反應10)   每管胚胎中置換成大約0.6 到 1 ml 雜交液，70?C水浴，預雜交2-5小時（3-4小時為宜）。雜

44、交液（HM）配方： volume              finalFormamide25,0 ml              50% formamide20 x SSC12,5 ml5 x SSCHeparin 5 mg/ml0,5 ml50 g/mltRNA 50 mg/ml0,5 ml500 g/ml

45、Tween 20 20%0,25 ml0,1%Acide citrique 1M0,46 ml              -> pH 6H2Oto 50 ml ü  對于信號較強，不需要過長孵育時間的探針，無需在雜交液中加入heparin 和 tRNA。ü  胚胎在雜交液中的保存時間：4度可以存放一天，-20度可以存放數(shù)個星期。雜交11)   吸去預雜交液，加上200 ul已加入探

46、針的雜交液（包含30-100 ng探針）12)   70?C 水浴過夜 原位雜交第二天漂洗回收探針，放于20?C保存（通常探針可重復使用3次左右）使用HM/SSC混合液，2xSSC和0.2xSSC進行梯度漂洗1)      1次x 10 min   75% HM / 25% 2 x SSC     at 70°C2)      1次x 10 min   50% HM / 50% 2 x

47、SSC     at 70°C3)      1次x 10 min   25% HM / 75% 2 x SSC     at 70°C4)      1次x 10 min   2x SSC                at 70

48、6;C5)      2次x 30 min   0.2 x SSC                  at 70°C6)      1次x 10 min   75% 0.2 x SSC / 25% PBT       

49、at RT7)      1次x 10 min   50% 0.2 x SSC / 50% PBT        at RT8)      1次x 10 min   25% 0.2 x SSC / 75% PBT        at RT9)      1次x 10 min &#

50、160; PBT                        at RT封閉反應10)   在胚胎中加入1 ml blocking buffer，室溫下在搖床上低速反應3-4小時。blocking buffer：在PBT中加入2%羊血清和2 mg/ml BSA抗體反應11)   按1：5000的比例在blocking buffer中加入

51、Anti-Dig-AP（酶連地高辛抗體），稀釋好后加入胚胎中（500-1000 ul），4度下?lián)u床上低速反應過夜。原位雜交第三天漂洗1)      棄抗體反應液，PBT快速漂洗一次6次x1 5min    PBT    at RT搖床上低速漂洗最后一次漂洗后在轉(zhuǎn)移至下一個溶液前，應盡可能移去前PBT溶液，以防在胚胎上形成磷酸鹽沉淀。2)      堿性tris緩沖液（alkaline tris buffer）快速漂洗一次3次x 5 mi

52、n     alkaline tris buffer     at RT搖床上低速漂洗堿性tris緩沖液（alkaline tris buffer）配方： volume              finalTris HCl pH 9,5 1M10 ml          

53、;    100 mMMgCl2 15 ml50 mMNaCl 5M2 ml100 mMTween 20 20%0,5 ml0,1%lH2Oto 100 ml  顯色反應3)      小心吸去多余的alkaline tris buffer，加入700 ul 新鮮配制的顯色液顯色液：20 ul NBT-BCIP/ 1 ml alkaline tris buffer4)      將胚胎轉(zhuǎn)移到12孔白瓷盤，室溫下避光顯色半小時以內(nèi)，每5

54、min查看一下胚胎顯色情況1小時以后，每30min或1hr查看一下胚胎顯色情況5)      顯色成功后，及時吸去多余的顯色液，加入1 ml stop solution（PBS pH 5,5 EDTA 1 mM）終止反應1次x 10 min     stop solution     at RT1次x 30 min     stop solution     at RT1次x 1 hr&

55、#160;          stop solution     at RT搖床上低速漂洗。胚胎可以在stop solution中避光保存數(shù)月至數(shù)年6)      將胚胎轉(zhuǎn)入6孔板盛放的100%甘油中，注意盡量少帶入stop solution，室溫下?lián)u床上低速避光平衡過夜，以保證胚胎中的水和甘油的充分交換，增加胚胎的光透性。7)      第二天使用Olympus顯微

56、鏡，使用頂光源進行拍照，保存照片。將胚胎轉(zhuǎn)入6孔板盛放的100%甘油中，注意盡量少帶入stop solution，室溫下?lián)u床上低速避光平衡過夜，以保證胚胎中的水和甘油的充分交換，增加胚胎的光透性。圖5.4 原位雜交第三天，胚胎顯色反應觀察圖示圖5.5 拍照用載玻片圖示 圖示中的載玻片分別在兩側(cè)用膠水粘附有3-4層蓋玻片，具體使用幾層視胚胎厚度而定，大于24 hpf的胚胎，建議使用3層蓋玻片，小于24 hpf的胚胎，建議使用4層。胚胎在100%甘油中平衡過夜后，可以進行拍照，先在載玻片中間滴一小滴甘油（不能太多，勿將兩端蓋玻片橋連起），將一個胚胎轉(zhuǎn)入油滴中，蓋上長蓋

57、玻片，通過輕輕移動蓋玻片可以改變胚胎的方位。本節(jié)附錄：實驗試劑1)    cDNA or genomic DNA2)     PCR master mix (Promega, cat. No. M7505)3)    Sterile double distilled water4)    Trizma? base (Sigma, cat. no. T1503)5)    Ethylenediaminetetraacetic a

58、cid (EDTA) (Eurobio, cat. no. GAUEDT00-66)6)    Boric acid (Sigma, cat. no. B7901)7)    Agarose (Sigma, cat. no. A9539)8)    Transcription buffer (Promega, cat. no. P118B)9)    DL-Dithiothreitol (DTT) (Promega, cat. no. P117B)10) DIG R

59、NA Labeling Mix (UTP) (Roche, cat. no. 1277073)11)  RNAsein (Promega, cat. no. N251X)12) T3 RNA-Polymerase (Promega, cat. no. P207C)13) T7 RNA-Polymerase (Promega, cat. no. P207B)14) RNAse free DNAse I ( Roche, cat. no. 776785 )15) NaOH (Sigma, cat. no. S8045)16) RNAlater (Sigma, cat.

60、 no. R-0901)17)  Adult male and female zebrafish ( Danio rerio ) of comparable size and age (within the range of 3 months to 2 years old).  所有的動物實驗應遵循實驗動物管理規(guī)則和條例。18) Pronase (Protease from Streptomyces griseus, Sigma, cat. no. P6911)19) Fish water (養(yǎng)殖系統(tǒng)水)20) Dulbeccos P

61、hosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. (PBS) (Sigma, cat. no. D-5652)21) Paraformaldehyde (PFA) (Sigma, cat. no. P-6148) 有毒試劑，使用應注意防護眼睛，避免接觸皮膚，有條件的話可以穿防護服。22) Methanol (Technisolv , cat. no. prol83809-360 )，避免吸入，避免接觸到眼睛和皮膚。23

62、) 1-phenyl-2-thiourea (PTU) (Sigma, cat. no. P7629) 高毒試劑，吞入或吸入可致命或造成嚴重后果。使用時避免散入周圍環(huán)境中。24) NaCl (Sigma, cat. no. S3014)25) KCl (Sigma, cat. no. P9541)26) MgSO4 (Sigma, cat. no. M2643)27) Ca (NO3)2 (Sigma, cat. no. C1396)28) HEPES (Sigma, cat. no. H3375)29) H2O2 (Sigma, cat. no. 31

63、642)30) KOH (Sigma, cat. no. P1767)31) Tween20 (Sigma, cat. no. P-1379)32) Proteinase K (Roche Diagnostics, cat. no. 1092766) ，母液濃度為10 mg/ml，使用PBT溶解，分裝成100 l每份，存于-20°C。使用終濃度為10 g/ml.33) Formamide high purity grade (Carlo Erba, cat. no. 452286)34) Serdolit MB-3 (Serva, 40721)35) Citric acid

64、 trisodium salt (Sigma cat. no. C3674)36) Citric acid monohydrate (Sigma, cat. no. C1909)37) Heparin sodium salt (Sigma, cat. no. H-3393)38)  tRNA from wheat germ Type V, lyophilized powder  (Sigma, R7876)39) Phenol solution Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 (Sigma, P4682)40) Chl

65、oroform (Carlo erba, cat. no. 438603)41) Sodium acetate (Merck, cat. no. 0095096B)42) Ethanol absolute (Technisolv, cat. no. PROL83813-360)43) Sheep serum ( Interchim SA, cat. no. 013-000-121). 使用無菌水配制，分裝成小管，保存于-20°C44) Albumin from bovine serum, further purified Fraction V, 99% pure

66、(BSA) (Sigma, A3059)45) Sheep anti Digoxigenin-AP Fab fragments (Roche Diagnostic, cat. no. 1093274)46) HCl (Sigma, cat. no. H1758)47) MgCl2 (Sigma, cat. no. 63068)48) Nitro Blue Tetrazolium (NBT, Sigma, N6639). 將50 mg的Nitro Blue Tetrazolium溶于0.7 ml N, N-dimethylformamide 和0.3 ml無菌水中，

67、保存于-20°C。49) 5-bromo 4-chloro 3-indolyl phosphate (BCIP, Sigma, B-8503). 將50 mg的5-Bromo 4-Chloro 3-Indolyl Phosphate 溶于1 ml 的無水N, N-dimethylformamide，保存于-20°C.50) N, N-Dimethylformamide anhydrous, 99.8% (Aldrich, cat. no. 227056)51) Na2HPO4, 12H2O (Fluka, 71650)52) NaH2PO4 (Merck, cat

68、. no. 1,06346,1000)53) Glycerol 99% (Sigma, G6279)溶液配方1)    10 x PBS pH5.5 stock solution: 將10.8 g Na2HPO4, 65 g NaH2PO4, 80 g NaCl, 2 g KCl 溶于IL水中，調(diào)節(jié)PH至5.5，滅菌備用。2)    PBT: 1 x PBS, 0.1% Tween20 (vol/vol)3)    Stop solution: 1 x PBS pH5.5,

69、1mM EDTA, 0.1% Tween 20 (vol/vol)4)    20x SSC stock solution: 將NaCl 175.3 g, Citric acid trisodium salt 88.2 g溶于IL水中，滅菌備用。5)    Blocking buffer: 1 x PBT, 2% sheep serum (vol/vol), 2mg/ml BSA.6)    0.3 x Danieau medium: 17 mM NaCl, 2 mM KCl

70、, 0.12 mM MgSO4, 1.8 mM Ca(NO 3 ) 2 , 1.5 mM HEPES, pH 7.67)    Alkaline Tris buffer: 100 mM Tris HCl pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 208)    1 x TBE: 將12.1 g Trizma? base, 0.75 g EDTA and 7.6 g Boric Acid溶于IL水中。9) &#

71、160;  EDTA 0.5M pH 8.0: 將186.1 g EDTA-Na鹽溶于800 ml水中，加入大約15 g NaOH 固體調(diào)節(jié)PH至8.0，定容到1L。10) Pronase preparation: 將1 g of Protease溶于100 ml 0.3 x Danieau buffer，37°C水浴2小時充分溶解，分裝成5 ml每管，保存于- 20°C。11) 4% (wt/vol) paraformaldehyde in 1 x PBS: 將4 g paraformaldehyde

72、溶于1x PBS，加熱直至所有粉末溶解，冷卻到室溫?？杀４嬗谑覝叵拢褂?周左右。PFA容易降解，不宜反復加熱，使用過程中會因甲醛的形成而呈酸性。12) 20% Tween20: 將200 ml Tween20溶于800 ml無菌水中，充分溶解后，可避光保存于室溫下。13) RNAse free tRNA: 將tRNA配制成50 mg/ml，使用酚/氯仿抽提以去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)。14) Hybridization Mix (HM): 50% 去離子 Formamide, 5 x SSC, 0.1% Tween20, 50 g/ml Heparin, 500 g/ml RNAse Free tRNA，使用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 至6.0