畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化子的篩選

1、畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化子的篩選菌體的準(zhǔn)備：1. 挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30C、250-300r/min培養(yǎng)過(guò)夜；2. 取100-500卩1（ 1:100）的培養(yǎng)物接種至含有50ml新鮮培養(yǎng)基的200mL三角搖瓶中，2830C、250-300r/min 培養(yǎng)過(guò)夜（約 20h），至 OD600 達(dá)到 1.31.5 ;3. 將細(xì)胞培養(yǎng)物于 4C, 1500g離心5min，用50ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；4. 按步驟3離心，用25ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸5. 按步驟3離心，用2-5ml, 1M的冰預(yù)冷山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；6. 按步

2、驟3離心，用160卩的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約 為 240 ul;備注：可將其分裝為80卩I一份的包裝-70冷凍起來(lái)，2周之內(nèi)使用，但會(huì)影響其轉(zhuǎn)化效率。 比如常見的pPIC9K的載體轉(zhuǎn)GS115一般先用MD平板初篩，然后長(zhǎng)出的克隆子可以挑到不 同濃度的含G418抗性的YPD平板上篩選高拷貝。對(duì)正確篩選出的單菌落接 YPD小瓶搖活后， 轉(zhuǎn)大瓶BMGY搖瓶發(fā)酵。一般對(duì)于甲醇誘導(dǎo)菌株，搖瓶一天左右后開始補(bǔ)加甲醇，就類似 BMMY的功能了。KM71比GS115生長(zhǎng)的要慢。畢赤酵母都應(yīng)該是白色菌落的對(duì)于LOX家族蛋白的表達(dá)，可嘗試在酵母培養(yǎng)基中加入Cu2+離子，提高表達(dá)量和

3、蛋白活性？菌種保存：挑單克隆到Y(jié)PD中培養(yǎng)18-24h,然后取菌液以1:1加入30%菌甘油，-80 oC ul/管凍存（一般用10ug以上質(zhì)粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70%乙醇洗一遍，約20ul ddH2O 重溶。轉(zhuǎn)化效率一般大于 100個(gè)克隆每ugDNA。建議你不要用膠回收 kit，回收的DNA可能 還有鹽，導(dǎo)致電擊時(shí)放電時(shí)間很短。乙醇沉淀主要步驟如下：1） 酶切體系（80ul）中2倍體積的無(wú)水乙醇加 1/10體積的PH5.2 NaAC,混勻2）-20 C 20分鐘沉淀3）13200rpm , 20min，離心后棄上清4）75%乙醇300ul輕輕洗，同上離心 5min，棄上清5）

4、37度烘箱至無(wú)乙醇?xì)馕叮ɑ蚴怯?搖床的出風(fēng)口吹出的暖風(fēng)吹）。6）20ul ddH2O 重溶）電擊轉(zhuǎn)化：8. 將520卩的線性化DNA溶解在510卩l(xiāng) T溶液中，與80卩的上述步驟6所得的菌 體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中；9. 將電轉(zhuǎn)化杯冰浴 5min ；10. 根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀提供的資料，參考其他文獻(xiàn)及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等 參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進(jìn)行電擊；11. 電擊完畢后，馬上加入1ml 1M的冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5ml的EP管中；（置于30度搖床低速培養(yǎng)1h，再涂板）12. 將菌體懸液涂布于 MD平板上，每200600 涂布一塊平板；13. 將平板

5、置于30 C倒置培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)（3-4天）。推薦：電壓1.5kV ;電容25卩F ;電阻200 Q。電擊時(shí)間為 410msec。Pichia酵母表達(dá)直接PCR鑒定重組子的方法1. 平板上的菌落長(zhǎng)到肉眼可見時(shí)（約 12 小時(shí)）；2. 取1ml酵母懸液4000rmp離心，pbs重懸，煮沸5mins ,放到冰上5mins,直接就可以用做 pcr 的模板了3. 將除了模板之外的其它PCR反應(yīng)液的組分準(zhǔn)備好，并分裝。3. 用滅菌的牙簽挑取菌落，在PCRt中涮一下，PCR擴(kuò)增，利用5'0X 1和3AOX 1引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行 PCR復(fù)篩，同時(shí)檢測(cè)基因插入（如果重組質(zhì)粒以單交 換的方式整合到

6、Pichia pastoris 基因組，則會(huì)擴(kuò)增到兩條帶，一條為2.2kb（KM71 為 3.6kb）宿主茵AOXI基因，另一條為包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信號(hào)肽序列的片段。）Each 50 laliquot of compete nt Pichia cells with 3 卩 gli nearized plasmid DNA will yield 50 colonies on selective medium.Muts 表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)As a general rule when inducing expression， never allow cultures

7、to be more than 10-30% of your total flask volume.1. 挑選一單菌落，置于裝有50ml MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，于28-30 °C /250-300 rpm 培養(yǎng)至 OD600 = 2-6 （16-18 h）；2. 室溫下15003000g離心5min，收集菌體，用 1/5到1/10原培養(yǎng)體積的 MM, BMM或 BMMY 重懸菌體（約 2.55ml ）；3. 將步驟 2 所得的菌液置于 100ml 的搖瓶中， 用雙層紗布或粗棉布封口， 放置于 28-30 ° C/250-300 rpm 的搖床上繼

8、續(xù)生長(zhǎng)；4. 每24h向培養(yǎng)基中添加100 %甲醇至終濃度為 0.51.0%;5. 按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品， 取樣量為 1ml ，置于 1.5ml EP 管中， 最大轉(zhuǎn)速離心 23min ， 分別收集上清和菌體， 分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。 時(shí)間點(diǎn)一般取： 0 、24、 48、 72、 96 和 120h；6. 對(duì)分泌表達(dá)，分離樣品的上清液；對(duì)胞內(nèi)表達(dá)，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測(cè)樣品用液 氮或干冰速凍后，于 -80 ° C 保存?zhèn)溆茫?. 可以用 SDS-PAG、E Western-Blot 及活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與鑒定重組蛋白的表達(dá)。Mut+表型重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)1. 挑

9、選一單菌落，置于裝有 25ml MGY、BMG或BMGY培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于28-30 ° C/250-300 rpm 培養(yǎng)至 OD600 = 2-6 （16-18 h）；2. 室溫下15003000g離心5min，收集菌體，用MM、BMM或BMMY重懸菌體，使OD600 =1 .0左右（約 100200ml）；3. 將步驟 2 所得的菌液置于 1L 的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300 rpm 的搖床上繼續(xù)生長(zhǎng)；4. 每24h向培養(yǎng)基中添加 100%甲醇至終濃度為0.51.0%;5. 按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品，取樣量為 1ml，置于

10、1.5ml EP管中，最大轉(zhuǎn)速離心 23min ,分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。時(shí)間點(diǎn)一般?。?、 6、12、 24、 36、 48、 60、 72、 84 和 96h;6. 對(duì)分泌表達(dá)，分離樣品的上清液;對(duì)胞內(nèi)表達(dá)，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測(cè)樣品用液氮或干冰速凍后，于-80° C保存?zhèn)溆茫?. 可以用 SDS-PAG、E Western-Blot 及活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與鑒定重組蛋白的表達(dá)。BMGY和BMMY勺換液方式有2種：1） 一種是離心換液，即在生長(zhǎng)培養(yǎng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)移到滅菌大離心管中，4000rpm 室溫離心 5 分鐘后，用BMMY洗下菌體，再轉(zhuǎn)移到搖瓶，

11、整個(gè)過(guò)程均用滅菌移液管操作。2） 另一種是靜止換液，即在生長(zhǎng)培養(yǎng)結(jié)束后，將搖瓶在無(wú)菌室靜止4小時(shí)后，直接在酒精 燈旁傾倒培養(yǎng)液，再加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，此種方法勺缺點(diǎn)有少量生長(zhǎng)培養(yǎng)基殘留。是離心換液或者靜止換液， 到底那個(gè)好，只有根據(jù)自己勺實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)考量。 如果只是從防治 污染勺角度來(lái)說(shuō)，靜止換液也好一些，因?yàn)椴僮鳟吘股僖恍?，速度也快。用新開啟勺分析純甲醇，一直放在無(wú)菌室里面，每次直接用滅菌 TIP 吸取加入搖瓶就可以了。 也有人試過(guò)用膜過(guò)濾，結(jié)果膜都溶解了。菌體是在BMMY中培養(yǎng)的，可以不用 BMMY做對(duì)照，在600nm處測(cè)OD直，培養(yǎng)基和 PBS光吸 收都很低，PBS更方便。麥芽浸提液培養(yǎng)酵母（

12、不換液，補(bǔ)料），生長(zhǎng)階段結(jié)束后，密度可達(dá)到10-12 ，誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，密度可達(dá)到 18左右。如果用1體積的BMGY在生長(zhǎng)階段結(jié)束后，換液時(shí)，加入 1/10-1/2體積的BMMY進(jìn)行誘導(dǎo) 培養(yǎng)（即濃縮培養(yǎng)），細(xì)胞密度也可達(dá)到 20 以上。通常，真正的高密度發(fā)酵只有在發(fā)酵罐里才能實(shí)現(xiàn)，OD600可達(dá)到40-60及以上。搖瓶很難達(dá)到那樣的密度，不過(guò)可以采取濃縮培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)高密度。搖瓶不能像發(fā)酵罐那樣保證通氣量，但可以通過(guò)裝量來(lái)暫時(shí)替代這個(gè)指標(biāo)。Mut +/Mut s 的篩選用Sacl, Sal I or Stu I線性化插入HIS4位點(diǎn)的載體轉(zhuǎn)化 GS155后，多數(shù)轉(zhuǎn)化子應(yīng)為Mut+,但也有 H

13、is+ Muts的轉(zhuǎn)化子存在(見Invitrogen protocol p36 ), Not I or Bgl II 線性化插入 AOX I位點(diǎn)的載體轉(zhuǎn)化 GS155后，用MD/MM平板可區(qū)分 Mut+/Mut s。Use the plates containing the His+ transformants and screen for the Mut+ and MutS phenotype as described below.1. Using a sterile toothpick, pick one colony and streak or patch one His+ transf

14、ormant in a regular pattern on both an MM plate and an MD plate, making sure to patch the MM plate first.2. Use a new toothpick for each transformant and continue until 100 transformants have been patched (2-3 plates).3. To differentiate Mut+ from MutS, make one patch for each of the controls (GS115

15、/His+ MutSAlbumin and GS115/His+ Mut+-gal)3o nto the MD and MM plates.4. Incubate the plates at 30 C for 2 d°ays.5. After 2 days or longer at 30 C, score°the plates. Mut+ transformants will grow well on bothMD and MM plates. MutS transformants will grow well on MD plates, but show little o

16、r no growth on the MM plates.We recommend purifying your His+ transformants to ensure isolation of a pure clonal isolates.You may do this before or after testing for the Mut phenotype.Replica-Plating Procedure This procedure gives a lower rate of misclassifications, but it increases the overall Mut+

17、/MutS screening procedure by 2 days. You will need equipment to replica-plate.1. Using sterile toothpicks, patch 100 His+ transformant on MD plates (2-3 plates). For controls, make one patch from each of the strai ns GS115/His+ MutS Albumin and G S115/His+ Mut+ -gal onto the MD plates.2. Incubate th

18、e plates at 28-30 C for 2 d°ays.3. After 2 days, replica-plate the patches from the MD plates onto fresh MM and MD plates to screen for MutS transformants.4. Incubate the replica plates at 28-30 C for 2 days°.5. After 2 days at 28-30 C, sco°re the replica plates. Look for patches that

19、 grow normally on the MD replica plates but show little or no growth on the MM replica plates. Including His+ Mut+ and His+ MutS control patches on each plate will provide examples of Mut+ and MutS phenotypes.Screening by Functional AssaySome researchers have used a functional assay to directly scre

20、en for high expressing Pichia recombinant clones without first screening for MutS or Mut+ phenotypes. If you elect to screen directly for high-expressing recombinants, be sure to also check the Mut phenotype. This will help you optimize expression of your recombinant clone.畢赤酵母基因組提取方法 接種重組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子于5m

21、l YPD+k抗生素培養(yǎng)基，GS115菌于YPD培養(yǎng)基作對(duì)照，30C，培養(yǎng)1618小時(shí)。室溫下， 1500 g 離心 5-10min 收集菌體 100 ul TE( pH 7.0)重懸，加入 300 ul EDTA( pH 8.0), 0.07M Tris HCl, 3 ul g -巰基乙醇， 1ul Lyticase , 37 C水浴 30 min。10000g離心510min，取沉淀，加 90ul TE重懸。 200ul 飽和酚， 200ul 氯仿，混勻，離心 30s ，取上層水相。加入兩倍體積無(wú)水乙醇以及1/10體積的NaAC, -20C放置30min ;10000g離心20min，棄上

22、清；75%乙醇漂洗沉淀一次； 干燥后，加入15卩l(xiāng)的TE或H20溶解，-20C備用。重組菌株傳代次數(shù)太多, 確實(shí)可能存在菌株退化的現(xiàn)象。 所以一定要保存好最原始的重組菌 株,每次從中劃板,挑單克隆表達(dá),盡量減少菌株傳代次數(shù)。 不行的話再用相同的方法重新 轉(zhuǎn)化篩選高表達(dá)菌株。Pichia 菌落 PCR 破壁方法 (史飛)：30 ul 培養(yǎng)液, 0.2% SDSVotex 15 sec離心 1min取上清,稀釋 5-10 倍用于PCR模板GS115的鑒定方法 接種GS115于5ml YPD液體培養(yǎng)基，30C, 200rpm振蕩過(guò)夜，涂布 YPD平板，30C培養(yǎng)48小時(shí)，用 YNB基本培養(yǎng)基和含 H

23、is的補(bǔ)充培養(yǎng)基作點(diǎn)種分離純化，挑選在補(bǔ)充培養(yǎng)基生 上生長(zhǎng)而在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的單菌落劃YPD平板，4 C保存。GS115的his4基因突變了，不能在組胺酸缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，一般的YPD培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，什么都有了，而YNB卻只含基本氮源，GS115應(yīng)該在上面不長(zhǎng)，就是從YPD上挑菌落，在YNB和補(bǔ)充了 HIS的平板 上對(duì)應(yīng)的點(diǎn)一下，在 HIS上長(zhǎng)而YNB上不長(zhǎng)的是 GS115,這樣能挑到純的，以防突變畢赤酵母表達(dá)常用溶液及緩沖液的配制10*YNB （含有硫酸銨、無(wú)氨基酸的13.4%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基）4 C保存。34g 酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基（無(wú)硫酸銨） +100g 硫酸銨，溶于 1000ml

24、 水中，過(guò)濾除菌，或134gYNB固體溶于1L蒸餾水，過(guò)慮除菌 or 115 C 15-20 min滅菌。注意畢赤酵母在高濃度 YNB 下生長(zhǎng)更好，所用 YNB 的量是釀酒酵母中的兩倍。500*B （0.02%生物素 Biotin ） 20mg 的生物素溶于 100ml 水中，水浴加熱溶解，溫度不能 高于50度。過(guò)濾除菌。4C保存 保存期為1年。D生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitamin H。在畢赤酵母代謝過(guò)程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養(yǎng)基中一般可以不單獨(dú)添加，因?yàn)閅NB 中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度發(fā)酵還是必須要添加的。MD、 MM 屬于基礎(chǔ)培養(yǎng)基

25、，沒有哪種成分會(huì)含有微量生長(zhǎng)因子（如生物素） ，所以肯定要加的。100*H （0.4%Histidine 組氨酸）4 C保存 保存期為1年。400mg的L組氨酸溶于100ml水 中，（加熱至50C以促進(jìn)溶解），過(guò)濾除菌。10*D （20%Dextrose葡萄糖）保存期為1年。200g葡萄糖溶于 1000ml水中，115 C滅菌15-20min 或過(guò)濾除菌。10*M （ 5%Methanol 甲醇）保存期為 2 個(gè)月。將 5ml 的甲醇與 95ml 水混勻，過(guò)濾除菌。10*GY（10%Glycerol 甘油）保存期為 1 年以上。將 100ml 甘油和 900ml 水混勻后，高壓 滅菌或過(guò)濾除菌

26、。100*AA （0.5% of each Ami no Acid ,各種氨基酸）4 C保存 保存期為1年。分別將500mg的 L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L境氨酸和L-異亮氨酸溶于100ml水中，過(guò)濾除菌。1M 磷酸鉀溶液（potassium phosphate buffer , pH6.0）,將 1mol/L 的 K2HPO 4 溶液 132ml 與1mol/L的KH2PO4溶液868ml混勻，其pH為6.0,如需調(diào)節(jié)pH,則使用磷酸和氫氧化 鉀調(diào)節(jié) pH。1M 山梨醇畢赤酵母表達(dá)的培養(yǎng)基配制2.1 LB ( Luria Bertani )培養(yǎng)基Tryptonl Yeast Ext

27、ract 0.5 NaCll PH 7.0制作平板時(shí)加入 2%瓊脂粉。121 C高壓滅菌20min。可于室溫保存。2.2 LLB（ Low Salt LB ）培養(yǎng)基：Tryptonl %Yeast Extract 0.5 %NaCl 0.5 %PH 7.0制作平板時(shí)加入 2%瓊脂粉。121 C高壓滅菌20mi n。可于室溫保存數(shù)月。2.3 YPD 完全培養(yǎng)基（又稱 YEPD ）（ Yeast Extract Peptone Dextrose Medium ，酵母浸出粉 / 胰蛋白胨 /右旋葡萄糖培養(yǎng)基）Yeast extract1%10g/LTrypton2%20g/Ldextrose （D

28、glucose）2%20g/L+agar2%20g/L液體 YPD 培養(yǎng)基可常溫保存；瓊脂 YPD平板在4 C可保存幾個(gè)月。YPD 或 YEPD：Yeast Extract Peptone Dextrose Medium（1L） ，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基， 加入瓊脂的又叫酵母膏胨葡萄糖（YPD瓊脂培養(yǎng)基.YPD培養(yǎng)基配制方法：1. 溶解10gYeast Extract（酵母膏）,20gPeptone（蛋白胨）于900ml水中，如制平板加 20g瓊脂粉2. 高壓 121 度 20min3. 加入100ml 20% （10X,共20g）的Dextrose （glucose）（葡萄糖）,（葡糖

29、糖溶液滅菌后加入 ）注：葡萄糖， yeast extract ,peptone 溶液混合后在高溫下可能會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基 成分變化，所以要分別滅菌后再混合。葡萄糖可以過(guò)濾除菌，也可以115C 15-20min滅菌。YPD培養(yǎng)基用途：用于酵母菌的培養(yǎng)，及供藥品和生物制品含王漿和蜂蜜的合劑酵母菌數(shù)測(cè) 定。YPEG除了用3%乙醇和3%甘油代替葡萄糖作為碳源外，其他成分同YPD;YPDZ是在YPD的基礎(chǔ)上加上ZEOCIN抗生素;YPDA是在YPD的基礎(chǔ)上加0.003%的腺嘌呤硫酸鹽。2.4 MD 與 MDH 選擇培養(yǎng)基Minimal Dextrose Medium + （ Histidine

30、）最小葡萄糖培養(yǎng)基 +（ 0.004 %組氨酸）（含有： -51.34%YNB； 4X10-5% 生物素； 2%葡萄糖）1. 滅菌800ml的ddwater，冷卻到60 C左右，加入2ml 的 500*B ，100ml 的 10*YNB100ml的10*D 母液，4 C保存2. 如配制 MDH，可在上述的 MD中加入10ml的100*H即可，4 C保存；3. 如配制平板，可無(wú)菌水的滅菌前，加入15g的瓊脂。4 C可保存數(shù)月。2.5 MM 和 MMH 培養(yǎng)基-5Minimal Methanol Medium +（Histidine ）（含有： 1.34%YNB； 4X10-5% 生物素； 0.5

31、%甲醇）1. 滅菌800ml的ddwater，冷卻到60 C左右，加入2ml 的 500*B ,100ml 的 10*YNB100ml 的 10*M , 4 C保存2. 如配制 MMH，可在上述的 MM中加入10ml的100*H即可，4 C保存；3. 如配制平板，可無(wú)菌水的滅菌前，加入15g的瓊脂。4 C可保存數(shù)月。MM or MD是篩選 mutS和mut+表型的。2.6 BMG和BMM 培養(yǎng)基Buffered Minimal Glycerol , Buffered Minimal Methanol(含有 100mM potassium phosphate pH_5» .6.0, 1

32、.34%YNB; 4X10 % 生物素 1% glycerol or 0.5% methanol)1. 滅菌700ml的ddwater，冷卻到室溫，加入2ml 的 500*B，100ml 的 10*YNB100 ml 的 1M potassium phosphate buffer100ml 的 10*GY, 4 C保存2. 如配制MMH ,可在上述的 BMG中用100ml的10*M取代100ml的10*GY即可，4 C 保存，可保存2個(gè)月。2.7 BMGY 和 BMMYBuffered Glycerol complex Medium, Buffered Metha nol complex Me

33、dium ( 含有 1% yeast extract, 2% peptone, 100mM potassium phosphate pH 6.0, 1.34%YNB ; 4X10_ % 生物素 1% glycerol or 0.5% metha nol)1. 溶解 10g 的 yeast extract (1%), 20g peptone (2%)在 700ml 的 ddwater，滅菌2. 冷卻到室溫，加入2ml 的 500*B ,100ml 的 10*YNB100 ml 的 1M potassium phosphate buffer100ml 的 10*GY, 4 C保存3. 如配制BMM

34、Y，可在上述的 BMGY中用100ml的10*M 取代100ml的10*GY即可，4 C 保存，可保存2個(gè)月。YPD最基本的培養(yǎng)用；BMGY:誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)用；BMMY:誘導(dǎo)表達(dá)用；MD :電轉(zhuǎn)化后篩選his+用。YEPD是不能代替BMGY的，因?yàn)橛衅咸烟?，這樣殘留的葡萄糖會(huì)影響下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。 不過(guò)有一種方法是可行的，就是用YPG培養(yǎng)基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比，甘油殘余會(huì)抑制甲醇利用。BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、生物素。配制 BMMY時(shí)也沒必要用 5%過(guò)濾除 菌的甲醇，在滅菌后使用前加100%甲醇至你要的濃度。Y

35、ou will need either BMGY/BMMY (buffered complex glycerol or methanol medium), BMG/BMM (buffered mi ni mal glycerol or metha nol medium) or MGY/MM (mi ni mal glycerol or mi ni mal metha nol medium) for expressio n. BMG, BMM, BMGY , and BMMY are usually used for the expressi on of secreted prote ins,

36、particularly if pH is importa nt for the activity of your prote in.Unlike MGY and MM, they are all buffered media. Because these media are buffered with phosphate buffer, a wide range of pH values may be used to optimize production of your protein. BMGY/BMMY contain yeast extract and peptone which m

37、ay help stabilize secreted proteins and prevent or decrease proteolysis of secreted proteins. Inclusion of yeast extract and peptone act as a "mixed feed" allowing better growth and biomass accumulation.2.8 YPDS培養(yǎng)基(Yeast Extract Peptone Dextrose sorbitol Medium 酵母浸出粉 / 胰蛋白胨 / 右 旋葡萄糖培養(yǎng)基 /山梨

38、醇)：山梨醇 :穩(wěn)定的滲透壓， 在電擊過(guò)程中保護(hù)宿主細(xì)胞 , 改變細(xì)胞膜 的通透性yeast extract1%peptone2%dextrose (glucose)2%sorbitol1 M+agar2%不管是液體YPDS培養(yǎng)基，還是YPDS + G418培養(yǎng)基，必須存放4C條件下，有效期12周。2.9 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培養(yǎng)基）（34%YNB 1% 甘油；4*10-5% 生物素）。將 800ml 滅菌水、100ml的10*YNB母液 2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混勻即可，4 C 保存，保存期為 2 個(gè)月。2.10 MGYH

39、Minimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培養(yǎng)基 + 0.004% 組氨酸） 在 1000ml 的 MGY 培養(yǎng)基中加入10ml的100*H母液混勻，4 C保存，保存期為 2個(gè)月。2.11 RDB 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基 （酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化用 ）Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培養(yǎng)基） （含有： 1mol/L 的山梨醇； 2%葡萄 糖；1.34%YNB; 4*10-5% 生物素；0.005%AA 氨基酸）1. 將 186g 的山梨醇定容至 700ml ，高壓滅菌；2. 冷卻后于45 C水浴；3. 將 100ml 的 10*D 、

40、 100ml 的 10*YNB； 2ml 的 500*B； 10ml 的 100*AA 等母液和 88ml 無(wú)菌水混勻，預(yù)熱至 45C后，與步驟2的山梨醇溶液混合。4 C保存。2.12 RDH Regeneration Dextrose Medium + Histidine （ 酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化用 ） （葡萄糖再生 培養(yǎng)基+ 0.004%組氨酸） 在RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入 10ml的100*H母液，同 時(shí)無(wú)菌水的體積減少至 78ml即可，其余配制方法與 RD相同。4 C保存。2.9 RDB及RDH平板的制備（酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化用）1. 將186g的山梨醇和15-20g瓊脂粉定容至700

41、ml，高壓滅菌；冷卻后于 60C水浴；2. 參照 RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟 4,將100ml的10*D、100ml的10*YNB ； 2ml的500*B ； 10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H 母液）和 88（78 ） ml無(wú)菌水混勻，預(yù)熱至45 C后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；3. 迅速制備平板。4 C可保存數(shù)月。2.13 RD 及 RDH 的 TOP 瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被）（酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化用 ）1將186g的山梨醇和7.510g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60C水浴；2. 參照 RD/RDH 液體培養(yǎng)基配制的步驟 4，將 100ml

42、的 10*D、100ml 的 10*YNB ； 2ml 的 500*B； 10ml 的 100*AA 等母液、（ 1 0m l 的 100*H 母液）和 88 （78）ml 無(wú)菌水混勻，預(yù) 熱至45C后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；3將該TOP瓊脂置于45C水浴冷卻、保溫，備用。Pichia yeast culture detailsThe growth temperature of Pichia pastoris is 28-30 C for liquid cultures, plates, and slants. Growth above 32 C°during inducti

43、on can be detrimental to protein expression and can even lead to cell death. Other importa nt facts: Doubli ng time of log phase Mut+ or MutSPichia in YPD is 2 hours? Mut+ and MutS strains do not differ in growth rates unless grown on methanol? Doubling time of log phase Mut+ Pichia in methanol medi

44、um (MM) is 4-6 hours? Doubling time of log phase MutS Pichia in MM is 18 hours? One OD600 = 5 x 107 cells/mlNote: Growth characteristics may vary depending on the recombinant strain.To store cells for weeks to months, use YPD medium or YPD agar slants (see page 55).? Streak for single colonies of GS

45、115, KM71, or a His+ transformant on YPD.? Transfer one colony to a YPD stab and grow for 2 days at 30 C. °? The cells can be stored on YPD for several weeks at +4 C. °To store cells for months to years, store frozen at -80 C.°? Culture a single colony of GS115, KM71, or a His+ transf

46、ormant overnight in YPD.? Harvest the cells and suspend in YPD containing 15% glycerol at a final OD600 of 50-1009(approximately 2.5-5.0 x 10 cells/ml).? Cells are frozen in liquid nitrogen or a dry ice/ethanol bath and then stored at -80 C. After long-term storage at +4 C or -80 C°,°we re

47、commend checking the His+ transformants for correct genotype and viability. Streak on MM, MD or MGY plates before using again.TCA沉淀方法；培養(yǎng)基上清直接電泳跑出來(lái)的條帶經(jīng)常很難看，可以 TCA 沉淀濃縮后跑電泳。表達(dá)上清很 少有直接考染能看得到條帶的， 1ml 表達(dá)上清濃縮到 20ul 直接電泳。一般表達(dá)量大于 1mg/ml 可以看到明顯條帶，但重復(fù)性不好。具體步驟：0. make 100% （M/V）TCA:454 ml H2O/Kg TCA, maintain

48、in dark bottle at 4 oC, Be careful, use gloves!1. 菌液 10000g, 離心 5 分鐘，收集表達(dá)上清。2. 取 500-1000ul 上清于 EP管中，加入 1/9 體積的 100%TCA （Trichloroacetic acid）,顛倒 10 次 混勻。3. 樣品置于冰浴中大于0.5 小時(shí)，過(guò)夜效果更好。4.15000g,離心10 20分鐘，可見有棕黑色沉淀，倒掉上清，將EP管倒扣在吸水紙上輕輕控幾下，除去殘余在管口的液體。5.將EP管倒置于吸水紙長(zhǎng)，37度烘箱10 20分鐘，待管底無(wú)明顯液體殘留，如果管壁還 殘留有液體，可以吸水紙吸掉?？?/p>

49、以改成室溫或用電吹風(fēng)，關(guān)鍵是除去管底和管壁殘余液 體。6.15000g，離心10-20分鐘，用20ul槍頭盡量吸去管底殘余的液體，此步驟要快，不然沉淀 容易散開，降低蛋白回收率，一般最多幾 ul 或者沒有，注意不要吸到沉淀。7.EP管倒置于吸水紙長(zhǎng)，37度烘箱5分鐘，確認(rèn)管壁和管底沒有液體殘留。8加入20- 50ul Loading buffer，95度加熱10nim , 般沉淀會(huì)自動(dòng)溶解，如果不溶，用手指 輕彈管壁或用 20ul 槍頭輕輕吸打，注意整個(gè)操作盡量不要碰到管壁，因?yàn)楣鼙诳赡苷从袣堄郥CA如果藍(lán)色的Loading buffer不變成黃色，說(shuō)明殘余TCA吸棄了干凈，如果變黃，一般不影

50、響電泳。此方法連丙酮洗這一步都省 了，而且不影響電泳效果。或者第 5 步和第 6 步改為丙酮洗 :5加入200ul冰冷的丙酮，用手指輕彈EP管，洗去管底和管壁殘余的TCA。6.15000g,離心10-20分鐘 倒掉上清，將 EP管倒扣在吸水紙上輕輕控幾下，除去殘余在管 口的液體。For PAGE-SDS, resuspe nd samples in a mi nimal volume of sample buffer. (The prese nee of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidificatio

51、n of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtai n the normal blue sample buffer colour.)樣品是酵母細(xì)胞超聲后離心獲得的上清，用 Loading buffer 溶解蛋白沉淀，始終不能溶解， 而且加熱超過(guò)10分鐘以后也依舊不溶解，很可能是TCA沒有除干凈。Typtone做TCA沉淀效果不好，沉淀很多，顏色是綠的，不好溶， Peptone 沉淀是黑色的，比較少，一般用丙酮 洗一 步后很好溶。胞內(nèi)蛋白：反復(fù)凍融多次，然后 15000 rpm 離心 4 度即可EL

52、ISA protoco；l 原位雙膜法快速檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)株用BMMY培養(yǎng)基一般表達(dá)1-2天收集表達(dá)上清，稀釋一定比例鋪板做ELISA檢測(cè)1. 取5- 10ul BMMY表達(dá)上清用 0.05M NaHCO3稀釋到100ul鋪ELISA板, 37度或室溫振蕩大于1小時(shí)。注意一定要做一個(gè)GS115空菌株表達(dá)上清作為陰性對(duì)照，最好還找一個(gè)帶有histag 的蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。2. TPBS洗板3次，方法：倒掉鋪板液，倒置于毛巾上輕輕拍打幾次，加TPBS至滿，重復(fù)。3. 加封閉液(TPBS加1%脫脂奶粉)350ml/孔，室溫下放置40分鐘1小時(shí)，TPBS洗 3次。4. 加封閉液稀釋的 histag 一抗100ul/孔，ELISA板于室溫振蕩0.5 1小時(shí)，TPBS洗 3次。很 多公司都有 histag 的單抗， 個(gè)人覺得 Qiagen 和 Pharmacia 單抗較好， Invitrogen 和 Labvision 的一般般，一般 1： 1000- 5000 稀釋，不同公司的抗體效價(jià)不同。5. 加封閉液稀釋的 HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗 10