復(fù)方地芬諾酯建立大鼠便秘模型及對(duì)腸道菌群的影響

1、www.CRTER.org李根林，等. 復(fù)方地芬諾酯建立大鼠便秘模型及對(duì)腸道菌群的影響復(fù)方地芬諾酯建立大鼠便秘模型及對(duì)腸道菌群的影響李根林，張顏語，李寒冰(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南省鄭州市 450046)引用本文：李根林，張顏語，李寒冰. 復(fù)方地芬諾酯建立大鼠便秘模型及對(duì)腸道菌群的影響J.中國組織工程研究，2016，20(49): 7404-7410.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.016 ORCID: 0000-0001-6943-2539(李寒冰)文章快速閱讀：便秘大鼠腸道菌群嚴(yán)重紊亂李根林，男，1963年生，河南省鄭州市人，漢族，碩士，教授，碩士生

2、導(dǎo)師，執(zhí)業(yè)藥師，執(zhí)業(yè)醫(yī)師，主要研究方向有中藥抗衰老研究、中醫(yī)藥用于骨傷病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究等。通訊作者：李寒冰，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，執(zhí)業(yè)藥師，河南省新藥審評(píng)專家，河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南省鄭州市 450046中圖分類號(hào):R318文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):2095-4344(2016)49-07404-07稿件接受：2016-10-13復(fù)方地芬諾酯便秘模型結(jié)腸常規(guī)病理觀察盲腸內(nèi)容物細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)進(jìn)行PCR-DGGE糞便中大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌變化，盲腸內(nèi)容物檢查體質(zhì)量、糞便粒量、糞便含水量、腸道內(nèi)容物所占百分比、腸道張力整體指標(biāo)腸道菌群綜合 分析便秘與腸道菌群變化之間的關(guān)聯(lián) 文

3、題釋義：便秘：是指排便困難或費(fèi)力、排便不暢、便次太少、糞便干結(jié)且量少。主要原因有習(xí)慣性忽略排便感覺、排便肌軟弱無力、肛門擴(kuò)約肌痙攣、腸蠕動(dòng)遲緩、腸痙攣、腸梗阻、缺少體力活動(dòng)等。急性便秘常由于腸梗阻、腸麻痹、急性腹膜炎、腦卒中、急性心肌梗死、肛周疼痛性疾病等引起；慢性便秘常由于慢性機(jī)械性腸梗阻或腸蠕動(dòng)功能失調(diào)所致，如腸腫瘤、腸粘連、腸易激綜合征等。便秘患者可表現(xiàn)為每周排便少于3次，或雖然每日排便多次，但排便相當(dāng)費(fèi)力，每次排便所費(fèi)時(shí)間相當(dāng)長，排出糞便干結(jié)如羊糞且數(shù)量少，排便后仍有糞便未排盡的感覺。地芬諾酯：是哌替啶的衍生物，代替阿片制劑。對(duì)腸道作用類似嗎啡，直接作用于腸平滑肌，通過抑制腸黏膜感受器

4、，消除局部黏膜的蠕動(dòng)反射而減弱蠕動(dòng)，同時(shí)可增加腸的節(jié)段性收縮，從而延長腸內(nèi)容物與腸黏膜的接觸，促進(jìn)腸內(nèi)水分的回吸收。摘要背景：既往研究中檢測(cè)便秘模型的指標(biāo)多為糞便粒數(shù)、腸道張力變化等整體指標(biāo)，很少涉及腸道菌群的變化。目的：以復(fù)方地芬諾酯建立便秘大鼠模型探索便秘對(duì)大鼠腸道張力、病理及微生態(tài)等方面的影響。方法：20只SPF級(jí)Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組和模型組，分別連續(xù)20 d灌胃10 mg/kg的復(fù)方地芬諾酯和蒸餾水。結(jié)果與結(jié)論：與空白組相比，給藥20 d，模型組大鼠回腸收縮頻率降低，24 h排便量減少，盲腸內(nèi)容物中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)存在變化，結(jié)腸結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞。結(jié)果表明，便秘大鼠腸道菌群嚴(yán)重紊亂。關(guān)

5、鍵詞：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；消化系統(tǒng)損傷與修復(fù)動(dòng)物模型；腸道菌群紊亂；便秘大鼠；復(fù)方地芬諾酯；腸道張力；大腸桿菌；雙歧桿菌；乳酸桿菌；國家自然科學(xué)基金主題詞：便秘；地芬諾酯；腸桿菌科；組織工程基金資助：國家自然基金面上項(xiàng)目(81473435)；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃(2013GGJS-092)；河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生苗圃計(jì)劃(MP2015-89)7405 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Effect of constipation induced by diphenoxylate on intestinal flora in a ratLi Gen-

6、lin, Zhang Yan-yu, Li Han-bing (Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China)AbstractBACKGROUND: In the previous studies, the overall index in constipation models, such as fecal output in 24 hours and intestinal tension are usually measured. However, the changes of i

7、ntestinal flora are rarely involved. OBJECTIVE: To explore the effect of constipation on intestinal tension, pathology and microecology in the rat models of diphenoxylate-induced constipation. METHODS: Twenty SPF Wistar rats were randomly divided into blank control and model groups, followed by give

8、n 10 mg/kg diphenoxylate and distilled water by gavage once daily for 20 days, respectively. RESULTS AND CONCLUSION: Twenty days later, compared with the blank control group, the frequency of ileum contraction was decreased, 24-hour stool decreased, the ratio of bacteria group in the cecum changed,

9、and structure of the colon was seriously damaged in the model group. These results suggest that constipation results in the intestinal flora disturbance remarkablely.Subject headings: Constipation; Diphenoxylate; Enterobacteriaceae; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation

10、of China, No. 81473435; the Fund for the Young Talent Teacher in High Educations of Henan Province, No. 2013GGJS-092; the Nursery Plan for the Postgraduate of Henan University of Chinese Medicine, No. MP2015-89Cite this article: Li GL, Zhang YY, Li HB. Effect of constipation induced by diphenoxylate

11、 on intestinal flora in a rat. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(49):7404-7410.Li Gen-lin, Master, Professor, Masters supervisor, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, ChinaCorresponding author: Li Han-bing, M.D., Associate professor, Masters supervisor, Hena

12、n University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China7409ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction便秘是一種臨床常見疾病，成因繁多，治療效果不佳。目前常采用由鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品組成的臨床常用緩瀉藥復(fù)方地芬諾酯建立便秘的動(dòng)物模型，該方法具有造模簡單、方法可靠、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，謝培等1復(fù)制的便秘模型周期長達(dá)45 d，亦有周期短、劑量大，而有動(dòng)物死亡現(xiàn)象，在指標(biāo)測(cè)定上多集中于糞便粒數(shù)、腸道張力變化等整體指標(biāo)1-2，很少涉及腸

13、道菌群的變化。目前，已知腸道菌群的失衡與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密不可分的關(guān)系，如腸易激綜合征、抑郁癥、肥胖等3-5。也有報(bào)道稱人群中不同原因形成的便秘會(huì)對(duì)腸道菌群產(chǎn)生復(fù)雜的影響，同時(shí)腸道菌群結(jié)構(gòu)的紊亂又會(huì)影響便秘的發(fā)展6-7。為了深入了解復(fù)方地芬諾酯造便秘模型的特點(diǎn)并探索造模后腸道菌群的變化特征，作者對(duì)復(fù)方地芬諾酯造便秘模型大鼠進(jìn)行研究，在測(cè)定24 h糞便粒數(shù)、腸道張力等指標(biāo)的基礎(chǔ)上，結(jié)合新鮮糞便的細(xì)菌傳統(tǒng)培養(yǎng)及盲腸內(nèi)容物革蘭氏染色來初步表征腸道菌群的桿球菌變化，并利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性凝膠梯度電泳對(duì)腸道菌基因組保守區(qū)域亦被認(rèn)為是“分子鐘”的16S rDNA進(jìn)行基因片段擴(kuò)增分析8，以期完善

14、復(fù)方地芬諾酯的造模方法并為該便秘模型與腸道菌群變化之間的關(guān)聯(lián)提供參考和依據(jù)。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計(jì) 隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2015年3至5月在河南中醫(yī)藥大學(xué)科研處科研實(shí)驗(yàn)中心完成。1.3 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)Wistar大鼠20只，鼠齡7周，雌雄各半，體質(zhì)量(180±20) g，購于山東省魯抗醫(yī)藥股份公司，許可證號(hào)：SCXK魯20130001；適應(yīng)性飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)科研處科研實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房5 d。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)物自由飲水和取食。主要試劑及儀器：復(fù)方地芬諾酯片(含鹽酸地芬諾酯2.5 mg，硫酸阿托

15、品0.025 mg，產(chǎn)品批號(hào)1406005)，購自常州康普藥業(yè)有限公司；四甲基乙二胺購自北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)816B026；雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)HB0396-1)和乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號(hào)HB0385-1)均購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；蛋白胨(產(chǎn)品編號(hào)01-001)和瓊脂粉(產(chǎn)品編號(hào)01-023)均購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，產(chǎn)品批號(hào)20151209，糞便基因組DNA快速提取試劑盒購自艾德萊，貨號(hào)DN23；Multiplex PCR Assay Kit Ver.2購自TaKaRa，貨號(hào)RR062A；高壓滅菌鍋LD

16、ZX-30KB購自上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-100生化培養(yǎng)箱購自中科生命科技股份有限公司；SW-CJ 超凈工作臺(tái)購自蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；IS-6800培清全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清有限科技公司；多功能 PCR儀購自賽默飛公司；瓊脂凝膠電泳儀、Dcode DGGE電泳儀均購自美國伯樂公司；全自動(dòng)脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)及全自動(dòng)切片機(jī)購自LEICA公司；全自動(dòng)顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購自成都泰盟軟件有限公司；超純水儀購自上海茸研儀器。1.4 方法1.4.1 便秘模型的制備 20只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組和模型組，各10只，每天上午9：00稱體質(zhì)量。模

17、型組每天灌胃復(fù)方地芬諾酯10 mg/kg，連續(xù)20 d；空白組給予相同體積的蒸餾水。1.4.2 常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)過程中，每天稱取大鼠體質(zhì)量，并計(jì)算大鼠體質(zhì)量的日變化量；體質(zhì)量日變化量=第N天體質(zhì)量-第(N-1)天體質(zhì)量。在實(shí)驗(yàn)給藥過程中，分別收集每只大鼠第0，7，14，20天的24 h糞便量。給藥20 d后，摘眼球取血后，直接處死大鼠，立即取大鼠胃噴門至直腸末端腸道，各截取一段1 cm左右長度的十二指腸和回腸，采用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)量腸道張力。剩余腸道稱質(zhì)量記為腸道總質(zhì)量，縱向切開用PBS清洗干凈腸壁，濾紙吸干水分后，再次稱取腸道凈質(zhì)量，二者差值為腸道內(nèi)容物總質(zhì)量，計(jì)算腸道內(nèi)

18、容物百分比。內(nèi)容物百分比=(腸道總質(zhì)量-腸道凈質(zhì)量)/腸道總質(zhì)量×100%1.4.3 腸道菌群指標(biāo)測(cè)定新鮮糞便細(xì)菌計(jì)數(shù)：分別于給藥后1，6，11，16，20 d，將大鼠置于干凈無菌的代謝籠內(nèi)，收集大鼠的新鮮糞便約0.1 g，于無菌無酶的試管中，進(jìn)行10倍梯度稀釋，篩選出1×10-7稀釋倍數(shù)的菌液，分別接種到大腸桿菌培養(yǎng)基、雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌培養(yǎng)基，37 恒溫培養(yǎng)，其中大腸桿菌培養(yǎng)24 h，雙歧桿菌、乳酸桿菌在自制厭氧罐內(nèi)培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行計(jì)數(shù)9。腸道菌群比例變化及種類分析：革蘭氏染色法測(cè)盲腸內(nèi)容物菌群比例變化10，并用糞便細(xì)菌基因提取試劑盒提取盲腸內(nèi)容物細(xì)菌總D

19、NA，以16S rRNA基因可變區(qū)V3區(qū)為靶標(biāo)11，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物序列為357F：5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'，下游引物序列為518r：5-ATT ACC GCG GCT GCTGG-3'(下劃線部分為40個(gè)GC堿基對(duì)，作為GC夾，為擴(kuò)增產(chǎn)物制造高溫解鏈區(qū))，擴(kuò)增體系為：2×Multiplex PCR Buffer(25 L)，模版DNA(1 L)、引物(10 mol/L，各1 L)、滅菌超純水補(bǔ)足50 L。PCR反

20、應(yīng)在Thermo PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增條件為：94 預(yù)變性3 min；95 變性30 s；55 退火30 s；72 延伸20 s；72 延伸7 min，并進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，終止于4 。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(110 V， 20 min)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性凝膠梯度電泳以分析腸道菌群種類變化，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察。1.4.4 病理觀察 給藥20 d后，立即迅速取大鼠近端結(jié)腸2 cm，剔除管壁周圍的脂肪組織，PBS洗，中性甲醛固定，蘇木精-伊紅染色12，100倍的視野內(nèi)使用Image pro-Plus6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)隱窩深度進(jìn)行測(cè)量定量分析。并采用結(jié)腸病理組織學(xué)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)

21、結(jié)腸病理切片進(jìn)行評(píng)價(jià)13。結(jié)腸病理組織學(xué)指數(shù)=炎癥細(xì)胞浸潤程度評(píng)分+杯狀細(xì)胞損壞評(píng)分情況+病變深度評(píng)分。其中評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1：表1 結(jié)腸病理組織學(xué)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria of the histopathological index of colon炎癥細(xì)胞浸潤程度杯狀細(xì)胞損壞情況病變深度得分無單核細(xì)胞浸潤無損壞無0 固有層局部或多個(gè)位點(diǎn)有巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤局部丟失僅限于黏膜層1 炎性浸潤在固有層呈連續(xù)分布，并蔓延至黏膜下層多個(gè)位點(diǎn)丟失，但仍有正常上皮黏膜層、黏膜下層2固有層、黏膜下層均有明顯浸潤，并在黏膜下層呈連續(xù)分布大量消失波及肌層3 全層均有單核細(xì)

22、胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞嚴(yán)重透壁浸潤全被損壞全層4 1.5 主要觀察指標(biāo) 常規(guī)指標(biāo)測(cè)定：測(cè)定大鼠體質(zhì)量及其體質(zhì)量日變化量、十二指腸及回腸腸道張力變化、腸道中內(nèi)容物所占整個(gè)腸道質(zhì)量的百分比變化、大鼠24 h排便量；腸道菌群相關(guān)指標(biāo)：采用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定糞便中大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌變化、采用革蘭氏染色法以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性凝膠梯度電泳法檢測(cè)大鼠盲腸內(nèi)容物中菌群的變化；采用蘇木精-伊紅染色檢測(cè)大鼠結(jié)腸病理變化。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，采用非參檢驗(yàn)方法對(duì)結(jié)腸病理組織學(xué)指數(shù)評(píng)分結(jié)果進(jìn)行比較，其余數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P < 0.

23、05為差異有顯著性意義，P < 0.01為差異有非常顯著性意義。2 結(jié)果 Results2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 所有大鼠均進(jìn)入結(jié)果分析，無脫失。2.2 體質(zhì)量及日變化量 與空白組相比，模型組大鼠體質(zhì)量及日變化量略有升高，但差異無顯著性意義(t0.05=0.344，P > 0.05；t0.05=1.178，P > 0.05；圖1)。2.3 十二指腸及回腸腸道張力 與空白組相比，造模結(jié)束時(shí)，模型組大鼠十二指腸腸道張力差異無顯著性意義(P > 0.05；圖2 A，B，表2)；而回腸腸道頻率顯著降低(t0.05=5.27，P < 0.01；圖2C，D，表2)，表明造模便

24、秘大鼠在小腸部位并未出現(xiàn)嚴(yán)重的病理表現(xiàn)，而回腸蠕動(dòng)的頻率降低，可能會(huì)導(dǎo)致食物在腸道內(nèi)滯留。表2 便秘對(duì)大鼠腸道張力相關(guān)指標(biāo)的影響 (±s，n=10)Table 2 Effect of constipation on the intestinal tension of rats表注：與空白組相比，aP < 0.05。項(xiàng)目空白組模型組十二指腸張力頻率(n/min)26.20±3.6827.67±4.69最大值(g)0.24±0.220.19±0.13最小值(g)-0.24±0.22-0.15±0.09平均值(g)-0.00

25、±0.01-0.00±0.01峰峰值(g)0.47±0.440.34±0.22面積(g×s)1.45±1.551.19±0.48回腸張力頻率(n/min)32.06±8.4522.98±4.37a最大值(g)1.63±0.981.62±1.10最小值(g)-1.48±0.71-1.46±1.06平均值(g)-0.02±0.01-0.03±0.02峰峰值(g)3.12±1.693.18±2.21面積(g×s)9.32&

26、#177;6.049.48±5.882.4 腸道內(nèi)容物百分比 給藥20 d后，與空白組相比，模型組大鼠腸道內(nèi)容物百分比有所增加，但差異無顯著性意義(t0.05=1.29，P > 0.05；圖3)。2.5 腸道菌群2.5.1 24 h糞便量以及新鮮糞便細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果 與空白組相比，給藥14，20 d后，模型組大鼠24 h排便量明顯減少(t0.05=2.203，P < 0.05；t0.05=5.428，P < 0.01；圖4A)；給藥6 d后，模型組腸道內(nèi)大腸桿菌、雙歧桿菌及乳酸桿菌含量無明顯變化(t0.05=0.118，P > 0.05；t0.05=0.417，P

27、 > 0.05；t0.05=1.492，P > 0.05)，給藥20 d后，模型組大鼠的新鮮糞便中大腸桿菌略有增多，但差異仍無顯著性意義(t0.05=0.647，P > 0.05，圖4B)，而雙歧桿菌增多(t0.05=3.159，P < 0.05；圖4C)，乳酸桿菌含量顯著降低(t0.05=7.149，P < 0.01；圖4D)。2.5.2 盲腸內(nèi)容物 采用革蘭氏染色方法檢測(cè)大鼠盲腸內(nèi)容物中細(xì)菌變化。與空白組相比，在給藥20 d后，模型便秘大鼠盲腸內(nèi)革蘭陽性/陰性細(xì)菌數(shù)量降低(t0.05=1.921，P < 0.05)，且桿菌/球菌比值下降(t0.05=2.

28、030，P < 0.05；圖5，表3)，表明盲腸內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂。表3 便秘對(duì)大鼠盲腸內(nèi)容物中菌類比例的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of constipation on the ratio of different bacteria species in the cecal contents of rats項(xiàng)目空白組模型組革蘭陽性菌(%)桿菌22.03±6.9014.35±4.67球菌24.52±6.426.43±11.37革蘭陰性菌(%)桿菌26.26±6.820.13±9.38球菌27.2

29、0±9.6639.08±10.96b革蘭陽性菌/革蘭陰性菌0.97±0.450.75±0.11a桿菌/球菌1.24±0.420.71±0.53a表注：與空白組相比，aP < 0.05，bP < 0.01。2.5.3 盲腸內(nèi)容物細(xì)菌變化 與空白組相比，模型組便秘大鼠盲腸內(nèi)容物中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)存在變化，便秘大鼠盲腸內(nèi)細(xì)菌總量明顯減少，部分菌屬增多，同時(shí)又有某些種屬的菌群丟失或者是菌群豐度至檢測(cè)到的最低限度(圖6)。2.6 結(jié)腸病理變化 與空白組相比，模型組大鼠結(jié)腸隱窩深度變淺(t0.05=6.185，P < 0.01)，結(jié)

30、腸結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，杯狀細(xì)胞大面積缺失，炎性浸潤在固有層呈連續(xù)分布，并蔓延至黏膜下層，結(jié)腸病理組織學(xué)指數(shù)明顯上升(P < 0.01；圖7，表4)。表4 便秘對(duì)大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)的影響 (±s，n=10)Table 4 Effect of constipation on the structure of colon in rats組別隱窩深度(m)結(jié)腸病理組織學(xué)指數(shù)空白組68.50±13.150.95±0.89模型組39.55±8.72a10.30±2.87a表注：與空白組相比，aP < 0.01。3 討論 Discussion復(fù)方地芬諾酯中所

31、含的鹽酸地芬諾酯口服吸收后，能夠抑制腸道蠕動(dòng)，使腸道分泌物減少，為臨床常用抗腹瀉藥。謝培等1研究表明30 mg/kg高劑量給予復(fù)方地芬諾酯，造模周期短，但死亡率高，而8 mg/kg低劑量體質(zhì)量日變化量(g)BA40036032028024020020151050-5-10-15圖1 便秘對(duì)大鼠體質(zhì)量及體質(zhì)量日變化量的影響Figure 1 Effects of constipation on the body weight and daily cumulative change in body weight of rats in each group圖注：圖中A為體質(zhì)量；B為體質(zhì)量日變化量。空白

32、組與模型組大鼠體質(zhì)量及日變化量接近?？瞻捉M模型組空白組模型組體質(zhì)量(g)1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 201 4 8 12 16 20CDAB給藥后時(shí)間(d)給藥后時(shí)間(d)0.150.100-0.10-0.15-50.100.050-0.05-0.10-0.10-0.1-0.2-0.3-0.5-0.6-0.20-0.2-0.4-0.6頻率：20次/min 最大值：0.77 g 最小值：-0.73 g 平均值：0.05 g頻率：33次/min 最大值：0.66 g 最小值：-0.69 g 平均值：

33、0.01 g頻率：32次/min 最大值：0.17 g 最小值：-0.15 g 平均值：0.01 g頻率：32次/min 最大值：0.17 g 最小值：-0.17 g 平均值：0.00 g圖2 便秘對(duì)大鼠十二指腸及回腸腸道張力的影響Figure 2 Effects of constipation on the intestinal tension in the duodenum and ileum of rats in each group圖注：圖中A，B為空白組和模型組大鼠十二指腸的腸道張力情況；C，D為空白組和模型組大鼠回腸的腸道張力情況。模型組大鼠回腸蠕動(dòng)的頻率降低。模型組空白組腸道內(nèi)容

34、物所占百分比(%)圖3 便秘對(duì)大鼠腸道內(nèi)容物百分比的影響Figure 3 Effect of constipation on the percentage of intestinal contents of rats in each group圖注：兩組大鼠腸道內(nèi)容物百分比接近?？瞻捉M模型組18017016015014013012020017515012510075501612840-4大鼠24 h排便量(g)乳酸桿菌菌落數(shù)(n)大腸桿菌菌落數(shù)(n)100806040200雙歧桿菌菌落數(shù)(n)空白組模型組1 6 11 16 201 6 11 16 200 7 14 201 6 11 16 20

35、空白組模型組給藥后時(shí)間(d)給藥后時(shí)間(d)給藥后時(shí)間(d)給藥后時(shí)間(d)圖4 便秘對(duì)大鼠24 h糞便量及糞便中大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌含量的影響Figure 4 Effects of constipation on the 24-hour volume of defecation, contents of E. coli, bacillus coli and Lactobacillus in feces of rats圖注：圖中A為24 h糞便量，B-D分別為0.1 g糞便培養(yǎng)獲得的大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌菌落數(shù)。與空白組相比，aP < 0.05，bP < 0.01。圖

36、5 便秘對(duì)大鼠盲腸內(nèi)容物的影響(革蘭氏染色，×1 000)Figure 5 Effect of constipation on the contents of the cecum in rats (Gram staining, x1 000)圖注：圖中A為空白組；B為模型組。在給藥20 d后，與空白組相比，模型組大鼠盲腸內(nèi)革蘭陽性/陰性細(xì)菌數(shù)量降低，且桿菌/球菌比值下降。AB6050403020100ADCBbba空白組模型組M M MCBABA圖6 盲腸內(nèi)容物細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性凝膠梯度電泳電泳結(jié)果Figure 6 PCR-denaturing grad

37、ient gel electrophoresis results of the V3 region of 16S rDNA gene in the cecum圖注：圖中A為細(xì)菌總DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；B為細(xì)菌總DNA的16S V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；C為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的梯度變性凝膠電泳結(jié)果。M：maker；：空白組；：模型組。圖7 便秘對(duì)大鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)的影響(蘇木精-伊紅染色，×100)Figure 7 Effect of constipation on the structure of colon in rats (hematoxylin-eosin stain

38、ing, x100)圖注：圖中A為空白組；B為模型組。與空白組相比，模型組大鼠結(jié)腸隱窩深度變淺，結(jié)腸結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重。則是造模周期長，無死亡率。作者對(duì)便秘大鼠形成過程中常規(guī)基礎(chǔ)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示復(fù)方地芬諾酯給藥處理過程中，便秘大鼠體質(zhì)量、體質(zhì)量日變化量增加，十二指腸的腸道張力無顯著差異，回腸腸道張力收縮頻率明顯降低，腸道內(nèi)容物百分比明顯增加，24 h糞便量減少，這些常規(guī)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)結(jié)果均符合便秘模型表現(xiàn)14，且造模過程中無大鼠死亡發(fā)生，因此作者采用10 mg/kg的復(fù)方地芬諾酯灌胃給藥復(fù)制便秘大鼠模型穩(wěn)定、快速、無死亡率。便秘是現(xiàn)代臨床發(fā)病率非常高的胃腸道功能性疾病，現(xiàn)代研究表明，除始動(dòng)發(fā)病因

39、素外，腸道菌群紊亂也與便秘的發(fā)生、發(fā)展有著密不可分的關(guān)聯(lián)。在人體腸道中定植約1×1014個(gè)微生物，生理狀態(tài)下這些細(xì)菌與機(jī)體胃腸道構(gòu)成人類胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)15，在成人腸道中細(xì)菌質(zhì)量約1.5 kg，編碼約300萬個(gè)基因，是人類基因組編碼基因數(shù)的150多倍，亦被稱作是人體的“第二基因組”16。腸道菌群的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物、代謝合成產(chǎn)物、細(xì)胞成分等對(duì)宿主的生理功能的正常發(fā)揮起著非常重要的作用，腸道菌群因此也被稱為“人體器官”17。根據(jù)腸道微生物對(duì)機(jī)體的作用，可以將腸道菌群分為三大類：生理性菌群，定植于深層黏膜上皮細(xì)胞表面，如類桿菌、雙歧桿菌等專性厭氧菌，屬于腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌群，能夠?yàn)樗拗魈峁┧锠I養(yǎng)

40、，調(diào)節(jié)宿主免疫；條件致病菌，如腸球菌、腸桿菌等，以兼性需氧菌為主，屬于非優(yōu)勢(shì)菌群，僅當(dāng)機(jī)體處于某些特定條件下對(duì)宿主有害，具有致病性；病原菌；大多為變形桿菌、假單胞菌等過路菌，微生態(tài)平衡時(shí)，過路菌長期定植的機(jī)會(huì)少、繁殖數(shù)量少，不會(huì)致病，但當(dāng)腸道內(nèi)外環(huán)境劇烈改變時(shí)，可導(dǎo)致人體發(fā)病18。因此，同時(shí)作者針對(duì)便秘大鼠糞便中以大腸桿菌為代表的條件致病菌，以雙歧桿菌、乳酸桿菌為代表的益生菌的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究。在實(shí)驗(yàn)前期(腹瀉期)，便秘大鼠的新鮮糞便大腸桿菌(革蘭陰性桿菌)、雙歧桿菌和乳酸桿菌明顯減少，說明在便秘發(fā)生前期，菌群結(jié)構(gòu)就已經(jīng)發(fā)生紊亂；在給藥20 d后，大腸桿菌和雙歧桿菌有增多趨勢(shì)，乳酸桿菌則是持續(xù)

41、顯著降低，說明便秘會(huì)加重腸道菌群結(jié)構(gòu)的紊亂。實(shí)驗(yàn)后期的大鼠盲腸內(nèi)革蘭陽性/陰性細(xì)菌、桿球菌比例明顯降低等情況一致表明便秘大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重的紊亂。這也與Zoppi等19采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究便秘的嬰兒腸道菌群結(jié)構(gòu)，得出便秘兒童糞便中梭菌屬、雙歧桿菌屬較健康兒童顯著升高的結(jié)論相一致。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性凝膠梯度電泳技術(shù)可以有效的隨著變性劑濃度以及核算分子空間結(jié)構(gòu)的差異來精確的分離大小相同或相近的核酸片段，特別適宜于分析樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬的動(dòng)態(tài)變化情況。作者采用聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)-變性凝膠梯度電泳方法檢測(cè)盲腸內(nèi)菌群16S rDNA的V3可變區(qū)變化情況，來全面的了解盲腸內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群的變化情況。16S r

42、DNA其分子內(nèi)存在的可變區(qū)，可以顯示出細(xì)菌屬及屬以上水平的特異性，適用于確定細(xì)菌的種屬及親緣關(guān)系8。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性凝膠梯度電泳結(jié)果顯示，便秘大鼠盲腸內(nèi)細(xì)菌總量明顯減少，部分菌屬增多，同時(shí)又有某些種屬的菌群丟失或者是菌群豐度減少至檢測(cè)到的最低限度。但是Zhu等18運(yùn)用新一代高通量焦磷酸測(cè)序法研究便秘兒童的糞便微生物組成，結(jié)果表明，與健康兒童相比，便秘兒童糞便中糞球菌屬、瘤胃球菌屬顯著增加，而普雷沃氏菌屬則顯著下降。這與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性凝膠梯度電泳結(jié)果趨勢(shì)相同，推測(cè)實(shí)驗(yàn)中條帶缺失的可能與普雷沃氏菌屬有關(guān)，而對(duì)于便秘大鼠條帶亮度增強(qiáng)的部位，推測(cè)與糞球菌屬、瘤胃球菌屬相關(guān)。另外，近端結(jié)腸病理

43、結(jié)果顯示，便秘大鼠結(jié)腸隱窩深度減小，有大量的炎癥反應(yīng)，杯狀細(xì)胞丟失。有研究表明腸道隱窩可以保護(hù)腸道干細(xì)胞，保證受損腸道細(xì)胞20；而杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白，構(gòu)成黏液屏障，為宿主體內(nèi)共生菌提供定植場(chǎng)所，防止致病微生物的定植，且分泌的粘液能夠潤滑腸道、促進(jìn)食物排空。近端結(jié)腸中杯狀細(xì)胞大量丟失，與便秘的發(fā)生有著密切的關(guān)系。有研究表明益生菌可以增強(qiáng)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道上皮屏障功能并促進(jìn)腸道生長，從而減輕結(jié)腸損傷的嚴(yán)重程度21，推測(cè)這應(yīng)與糞便中乳酸桿菌顯著減少有著密切的關(guān)系。越來越多的現(xiàn)代研究以及臨床應(yīng)用表明，腸道菌群參與諸疾病的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)灌胃給予的復(fù)方地芬諾酯通過影響大鼠腸道功能以及腸道菌群的變化，而導(dǎo)致便

44、秘；便秘則在后期加重了腸道功能的損傷以及菌群結(jié)構(gòu)紊亂。該研究結(jié)果對(duì)于探究便秘與腸道菌群紊亂二者之間的作用機(jī)制提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為指導(dǎo)臨床合理治療便秘提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。作者貢獻(xiàn)：李寒冰進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)實(shí)施，資料收集為張顏語，李根林審校。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問題：實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為：DWLL201402037。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對(duì)研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始

45、圖片、數(shù)據(jù)(包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻(xiàn) References1 謝培,周永學(xué).大鼠功能性便秘模型建立方法的研究J.陜西中醫(yī),2014,35(3):377-379.2 趙兵,唐學(xué)貴,吳至久,等.復(fù)方地芬諾酯建立便秘模型與AQP8的相關(guān)性研究J.中醫(yī)臨床研究,2015(18): 107-110.3 Jeffery IB, O'Toole PW, Öhman L, et al. An irritable bowel syndrome subtype defined

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