分光光度技術(shù)2

1、第二章第二章 分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)v分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)(分光光度法分光光度法)主要是指利用物質(zhì)特有的光譜來鑒定物質(zhì)性質(zhì)及含量的技術(shù)，其理論依據(jù)是Lambert和Beer定律。v 分光光度法是比色法的發(fā)展分光光度法是比色法的發(fā)展: 比色法只限于在可見光區(qū)，分光光度法則可以擴展到紫外光區(qū)和紅外光區(qū)。比色法用的單色光是來自濾光片，譜帶寬度從40120nm，精度不高，分光光度法則要求近于真正單色光，其光譜帶寬最大不超過35nm，在紫外區(qū)可到1nm以下，來自棱鏡或光柵，具有較高的精度。分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)基本原理基本原理 分光光度計分光光度計 基本結(jié)構(gòu)簡介基本結(jié)構(gòu)簡

2、介 分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用 分光光度法的誤差分光光度法的誤差 分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)基本原理基本原理v一、光的基本知識一、光的基本知識v光是由光量子組成的，具有二重性，即不連續(xù)的微粒性和連續(xù)的波動性。波長和頻率是光的波動性的特征，可用下式表示： 式中為波長，具有相同的振動相位的相鄰兩點間的距離叫波長。為頻率，即每秒鐘振動次數(shù)。為光速等于299770千米秒。v光屬于電磁波。v自然界中存在各種不同波長的電磁波，分光光度法所使用的光譜范圍在200nm-10（1= 1, 000nm ）之間。其中200nm400nm為紫外光區(qū)，400nm760nm為可見光區(qū)，760nm10,00

3、0nm為紅外光區(qū)。自然界的電磁波譜自然界的電磁波譜v射線(-ray)它是放射性物質(zhì)發(fā)出的電磁波,波長在210-10m以下。是一種能量很大的光子流。在醫(yī)療上用射線作為“手術(shù)刀”來切除腫瘤,叫做刀,有很好的治療效果。vX射線(X-ray)它是由X射線管產(chǎn)生的電磁波，波長在10-1510-7m，X射線對不同密度的物質(zhì)有不同的穿透力。在醫(yī)學(xué)上常用作醫(yī)療檢查。在飛機場安全檢查中，也常用X射線對行李進行透視查驗。自然界的電磁波譜v紫外線(ultravioletray)當光電流通過兩電極間的電離氣體時，會產(chǎn)生紫外線。其波長在410-8410-7m。太陽光中含有紫外線。v紫外線能激發(fā)熒光，日光燈就是管內(nèi)紫外線

4、激發(fā)涂在燈管內(nèi)壁上的熒光粉而發(fā)出的近似日光光譜的照明燈。v紫外線也常用在醫(yī)學(xué)上殺菌和防偽技術(shù)上。自然界的電磁波譜v可見光(visiblelight)它是能引起人的視覺感覺的電磁波，其波長范圍是0.410-60.810-6m。太陽能發(fā)出可見光?？梢姽馐怯刹煌壤钠呱?紅、橙、黃、綠、藍、靛、紫)所混合組成。v紅外線(infraredray)通常情況下由灼熱物體發(fā)出的電磁波，其波長范圍是0.810-6110-3m。它們會導(dǎo)致物體溫度的升高。紅外電磁波在特定的紅外敏感膠片上能形成熱成像。自然界的電磁波譜v微波(microwave)常用于雷達設(shè)備上的波長很短的無線電波，其波長范圍在110-31m。

5、由于微波的定向性好，常用發(fā)射、反射波的時間來測算目標的位置。微波爐是一種用微波的熱效應(yīng)來烹調(diào)食品的裝置。v無線電波(radiowave)它是在電磁場的作用下無線電天線中自由電子發(fā)生振蕩而產(chǎn)生的電磁波。波長范圍在0.7510-31104m。分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)基本原理基本原理v朗伯比爾（朗伯比爾（Lambert-Beer）定律）定律v吸光度與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比.vAlgTKLCvA吸光度，又稱光密度“O.D”。vT透光度， TI / I。， I。-為照射到吸收池上的光強，I-為透過吸收池的光強。vk摩爾吸光系數(shù)（Lmol1cm1）。vL樣品光程（cm），通常使用1.0cm 的

6、吸收池，L=1cm。vC-樣品濃度（mol/L）。v由上式可以看出：吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“k”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)基本原理基本原理v吸光系數(shù)K取決于入射光的波長，溶液的性質(zhì)和溫度等，而與光的強度、溶液的濃度及液層的厚度無關(guān)。在一定波長下，它是物質(zhì)的特性常數(shù)。v不同物質(zhì)可能有相同的最大吸收波長，但其吸光系數(shù)不一定相同。K值愈大，說明該物質(zhì)溶液對光吸收愈強烈，則比色測定的靈敏度愈高。分光光度技術(shù)分光光度技術(shù)基本原理基本原理v吸光度“A”有一個重要性質(zhì)是其具有加和性：vAk1L1C1k2L2C2k3L3C3v即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長下吸光度的

7、算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。分光光度計分光光度計基本結(jié)構(gòu)簡介基本結(jié)構(gòu)簡介 vv分光光度計基本結(jié)構(gòu)簡介分光光度計基本結(jié)構(gòu)簡介v能從含有各種波長的混合光中將每一單色光分離出來并能從含有各種波長的混合光中將每一單色光分離出來并測量其強度的儀器稱為分光光度計。測量其強度的儀器稱為分光光度計。v分光光度計因使用的波長范圍不同而分為紫外光區(qū)、可分光光度計因使用的波長范圍不同而分為紫外光區(qū)、可見光區(qū)、紅外光區(qū)以及萬用（全波段）分光光度計等。無論見光區(qū)、紅外光區(qū)以及萬用（全波段）分光光度計等。無論哪一類分光光度計都由下列五部分組成，即光源、單色器、哪一類分光光度計都由下列五部分組成，即光源

8、、單色器、狹縫、樣品池，檢測器系統(tǒng)。狹縫、樣品池，檢測器系統(tǒng)。 基本結(jié)構(gòu)簡介基本結(jié)構(gòu)簡介-光源光源 v光源光源v要求能提供所需波長范圍的連續(xù)光譜，穩(wěn)定而有足夠的強度。常用要求能提供所需波長范圍的連續(xù)光譜，穩(wěn)定而有足夠的強度。常用的有白熾燈（鎢燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），的有白熾燈（鎢燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等多種。金屬弧燈（各種汞燈）等多種。v鎢燈和鹵鎢燈鎢燈和鹵鎢燈發(fā)射發(fā)射3203202000nm2000nm連續(xù)光譜，最適宜工作范圍為連續(xù)光譜，最適宜工作范圍為3603601000nm1000nm，穩(wěn)定性好，用作可見光分光光度

9、計的光源。，穩(wěn)定性好，用作可見光分光光度計的光源。v氫燈和氘燈氫燈和氘燈能發(fā)射能發(fā)射150150400nm400nm的紫外結(jié)，可用作紫外光區(qū)分光光度計的的紫外結(jié)，可用作紫外光區(qū)分光光度計的光源。光源。v汞燈汞燈發(fā)射的不是連續(xù)光譜，發(fā)射的不是連續(xù)光譜， 能量絕大部分集中在能量絕大部分集中在253.6nm253.6nm波長外，一般波長外，一般作作波長校正波長校正用。用。v鎢燈在出現(xiàn)燈管發(fā)黑時應(yīng)及更換，如換用的燈型號不同，還需要調(diào)節(jié)燈鎢燈在出現(xiàn)燈管發(fā)黑時應(yīng)及更換，如換用的燈型號不同，還需要調(diào)節(jié)燈座的位置的焦距。氫粘及氘燈的燈管或窗口是石英的，且有固定的發(fā)射座的位置的焦距。氫粘及氘燈的燈管或窗口是石英

10、的，且有固定的發(fā)射方向，安裝時必須仔細校正接觸燈管時應(yīng)戴手套以防留下污跡。方向，安裝時必須仔細校正接觸燈管時應(yīng)戴手套以防留下污跡?；窘Y(jié)構(gòu)簡介基本結(jié)構(gòu)簡介 -單色器v分光系統(tǒng)（單色器）分光系統(tǒng)（單色器）v單色器是指能從混合光波中分解出來所需單一波長光的裝置，由棱鏡或光柵構(gòu)成。v用玻璃制成的棱鏡色散力強，但只能在可見光區(qū)工作，石英棱鏡工作波用玻璃制成的棱鏡色散力強，但只能在可見光區(qū)工作，石英棱鏡工作波長范圍為長范圍為185-4000nm185-4000nm，在紫外區(qū)有較好的分辯力而且也適用于可見光，在紫外區(qū)有較好的分辯力而且也適用于可見光區(qū)和近紅外區(qū)。區(qū)和近紅外區(qū)。v 棱鏡的特點是波長越短，色散

11、程度越好，越向長波一側(cè)越差。所以用棱鏡的特點是波長越短，色散程度越好，越向長波一側(cè)越差。所以用棱鏡的分光光度計，其波長刻度在紫外區(qū)可達到棱鏡的分光光度計，其波長刻度在紫外區(qū)可達到0.2nm0.2nm，而在長波段只，而在長波段只能達到能達到5nm5nm。v有的分光光系統(tǒng)是衍射光柵，即在石英或玻璃的表面上刻劃許多平行線，有的分光光系統(tǒng)是衍射光柵，即在石英或玻璃的表面上刻劃許多平行線，刻線處不透光，于是通過光的干涉和衍射現(xiàn)象，較長的光波偏折的角度刻線處不透光，于是通過光的干涉和衍射現(xiàn)象，較長的光波偏折的角度大，較短的光波偏折的角度小，因而形成光譜。大，較短的光波偏折的角度小，因而形成光譜?；窘Y(jié)構(gòu)簡

12、介基本結(jié)構(gòu)簡介-狹縫、樣品池狹縫、樣品池v狹縫狹縫v狹縫是指由一對隔板在光通路上形成的縫隙，用來調(diào)節(jié)入射單色光狹縫是指由一對隔板在光通路上形成的縫隙，用來調(diào)節(jié)入射單色光的純度和強度，也直接影響分辯力。的純度和強度，也直接影響分辯力。狹縫可在狹縫可在02mm寬度內(nèi)調(diào)節(jié)，由寬度內(nèi)調(diào)節(jié)，由于棱鏡色散力隨波長不同而變化，較先進的分光光度計的狹縫寬度可隨于棱鏡色散力隨波長不同而變化，較先進的分光光度計的狹縫寬度可隨波長一起調(diào)節(jié)。波長一起調(diào)節(jié)。v比色杯比色杯v比爭杯也叫樣品池，吸收器或比色皿，用來盛溶液，各個杯子壁厚比爭杯也叫樣品池，吸收器或比色皿，用來盛溶液，各個杯子壁厚度等規(guī)格應(yīng)盡可能完全相等，否則將

13、產(chǎn)生測定誤差。玻璃比色杯只適用度等規(guī)格應(yīng)盡可能完全相等，否則將產(chǎn)生測定誤差。玻璃比色杯只適用于可見光區(qū)，在紫外區(qū)測定時要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的于可見光區(qū)，在紫外區(qū)測定時要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光學(xué)面，用后要及時洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃光學(xué)面，用后要及時洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過酸中浸泡不要超過15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。 基本結(jié)構(gòu)簡介基本結(jié)構(gòu)簡介-檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)v有許多金屬能在光的照射下產(chǎn)生電流，光愈強電流愈大，有許多金屬能在光的照射下產(chǎn)生電流，光愈強電

14、流愈大，此即此即光電效應(yīng)。光電效應(yīng)。v因光照射而產(chǎn)生的電流叫做光電流。因光照射而產(chǎn)生的電流叫做光電流。v受光器有兩種，一是光電池，二是光電管。光電池的組成種受光器有兩種，一是光電池，二是光電管。光電池的組成種類繁多，最常見的是硒光電池。光電池受光照射產(chǎn)生的電流類繁多，最常見的是硒光電池。光電池受光照射產(chǎn)生的電流頗大，可直接用微電流計量出。但是，當連續(xù)照射一段時間頗大，可直接用微電流計量出。但是，當連續(xù)照射一段時間會產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象而使光電流下降，要在暗中放置一些時候才會產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象而使光電流下降，要在暗中放置一些時候才能恢復(fù)。因此使用時能恢復(fù)。因此使用時不宜長期照射不宜長期照射，隨用隨關(guān)，以防止光

15、電，隨用隨關(guān)，以防止光電池因疲勞而產(chǎn)生誤差。池因疲勞而產(chǎn)生誤差。v基本結(jié)構(gòu)簡介基本結(jié)構(gòu)簡介-檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)v光電管裝有一個陰極和一個陽極，陰極是用對光敏感的金屬光電管裝有一個陰極和一個陽極，陰極是用對光敏感的金屬（多為堿土金屬的氧化物）做成，當光射到陰極且達到一定（多為堿土金屬的氧化物）做成，當光射到陰極且達到一定能量時，金屬原子中電子發(fā)射出來。光愈強，光波的振幅愈能量時，金屬原子中電子發(fā)射出來。光愈強，光波的振幅愈大，電子放出愈多。電子是帶負電的，被吸引到陽極上而產(chǎn)大，電子放出愈多。電子是帶負電的，被吸引到陽極上而產(chǎn)生電流。光電管產(chǎn)生電流很小，需要放大。生電流。光電管產(chǎn)生電流很小，需要放大

16、。v分光光度計中常用分光光度計中常用電子倍增光電管電子倍增光電管，在光照射下所產(chǎn)生的電，在光照射下所產(chǎn)生的電流比其他光電管要大得多，這就提高了測定的靈敏度。流比其他光電管要大得多，這就提高了測定的靈敏度?；窘Y(jié)構(gòu)簡介基本結(jié)構(gòu)簡介-檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)v檢測器產(chǎn)生的光電流以某種方式轉(zhuǎn)變成模擬的或數(shù)檢測器產(chǎn)生的光電流以某種方式轉(zhuǎn)變成模擬的或數(shù)字的結(jié)果，模擬輸出裝置包括電流表、電壓表、記字的結(jié)果，模擬輸出裝置包括電流表、電壓表、記錄器、示波器及與計算機聯(lián)用等，數(shù)字輸出則通過錄器、示波器及與計算機聯(lián)用等，數(shù)字輸出則通過模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換裝置如數(shù)字式電壓表等。模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換裝置如數(shù)字式電壓表等。721型可見分光光度

17、計v工作波長：340-1000nm721系列可見分光光度計v工作波長：340-1000nm721系列可見分光光度計（掃描型）v配置：簡，操作軟件、定量分析、時間掃描，可選配打印機、計算機 751型紫外可見分光光度計v工作波長：200-1000nm755PC型紫外可見分光光度計v標配：操作軟件、定量分析、時間掃描、光譜掃描，可選配打印機、計算機 UNICO-2102紫外可見分光光度計v工作波長：200-1000nm分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用v測定溶液中物質(zhì)的含量測定溶液中物質(zhì)的含量v單一物質(zhì)的定量分析單一物質(zhì)的定量分析v先測出其吸收光譜曲線，找出最大吸收波長。先測出其吸收光譜曲

18、線，找出最大吸收波長。v含量測定時所用波長通常要選擇被測物質(zhì)的含量測定時所用波長通常要選擇被測物質(zhì)的最大吸收波長，最大吸收波長，這樣做有兩個好處：這樣做有兩個好處：靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；v可以避免其它物質(zhì)的干擾。可以避免其它物質(zhì)的干擾。v可見或紫外分光光度法都可用于測定溶液中物質(zhì)的含量。測定標準溶液可見或紫外分光光度法都可用于測定溶液中物質(zhì)的含量。測定標準溶液（濃度已知的溶液）和未知液（濃度待測定的溶液）的吸光度，進行比較，由（濃度已知的溶液）和未知液（濃度待測定的溶液）的吸光度，進行比較，由于所用吸收池

19、的厚度是一樣的。也可以先測出不同濃度的標準液的吸光度，繪于所用吸收池的厚度是一樣的。也可以先測出不同濃度的標準液的吸光度，繪制標準曲線，在選定的濃度范圍內(nèi)標準曲線應(yīng)該是一條直線，然后測定出未知制標準曲線，在選定的濃度范圍內(nèi)標準曲線應(yīng)該是一條直線，然后測定出未知液的吸光度，即可從標準曲線上查到其相對應(yīng)的濃度。液的吸光度，即可從標準曲線上查到其相對應(yīng)的濃度。v分光光度計的應(yīng)用-定量分析v混合樣品的定量分析v吸收光譜不重疊的混合物定量方法 -互不干擾 分別測定v吸收光譜重疊的混合物定量方法v采用化學(xué)計量學(xué)方法可以克服光譜定量分析中出現(xiàn)的多重共線性、光譜重疊和組分的相互干擾等問題, 并且不需分離可直接

20、同時測定混合體系的各組分。因此發(fā)展了如主成分回歸( PCR) 、小波包變換、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)( ANN) 以及遺傳算法等多種線性或非線性的多元校準方法, 波長選擇是光譜分析中各種多元校準方法的關(guān)鍵步驟。分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用v定性鑒定v用紫外光譜鑒定化合物用紫外光譜鑒定化合物v使用分光光度計可以繪制使用分光光度計可以繪制吸收光譜曲線。吸收光譜曲線。方法是用各種方法是用各種波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對每一種單色光的吸光度，然后以波長為橫座標，以吸光度為每一種單色光的吸光度，然后以波長為橫座標，以吸光度為

21、縱座標繪制吸光度縱座標繪制吸光度波長曲線，此曲線即吸收光譜曲線波長曲線，此曲線即吸收光譜曲線。v各種物質(zhì)有它自己一定的吸收光譜曲線，因此用吸收光譜曲線圖可以進行物質(zhì)種類的鑒定。分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用v一定物質(zhì)在不同濃度時，其吸收光譜曲線中，峰值的大小不同，但形狀相似，即吸收高峰和低峰的波長是一定不變的。v當一種未知物質(zhì)的吸收光譜曲線和某一已知物質(zhì)的吸收光譜曲線一樣時，則很可能它們是同一物質(zhì)。v紫外線吸收是由不飽和的結(jié)構(gòu)造成的，含有雙鍵的化合物表現(xiàn)出吸收峰。紫外吸收光譜比較簡單，同一種物質(zhì)的紫外吸收光譜應(yīng)完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結(jié)構(gòu)不一定相同。v除了特殊情況外

22、，單獨依靠紫外吸收光譜決定一個未知物結(jié)構(gòu)，必須與其它方法配合。分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用v結(jié)構(gòu)分析v作為結(jié)構(gòu)分析，紫外吸收光譜遠不及紅外吸收光譜重要可靠，因為紫外吸收光譜曲線的特征性不及紅外光譜曲線，紅外光譜曲線屬指紋型，而大多數(shù)有機化合物在紫外光區(qū)無吸收。v利用紫外吸收光譜可鑒定化合物中具有共軛系統(tǒng)和芳環(huán)結(jié)構(gòu)。分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用分光光度技術(shù)的基本應(yīng)用v在生化分析領(lǐng)域主要用于氨基酸含量的測定、蛋白質(zhì)含量的測定、核酸的測定、酶活力測定、生物大分子的鑒定和酶催化反應(yīng)動力學(xué)的研究等。分光光度計的誤差v濃度過高或過低的樣品，易引起檢測器標尺上的讀數(shù)誤差。從理論上推算，相對誤差最小

23、的部分在透光度為36.8%處（或吸光度為0.4343處），故通常認為測定值在吸光度0.20-0.80范圍內(nèi)（透光度為20%65%）誤差最小，超出此范圍，相對誤差均會增大。分光光度計的誤差v影響分光光度計精確度的主要原因還有光譜純度。一般應(yīng)保持光譜帶寬度在10nm以下，如果測定樣品中有很狹窄的吸收峰，就必須有更小的光譜寬度，所以分光光度計均有可調(diào)的狹縫。在實際應(yīng)用中，用較大的狹縫雖然可提高重現(xiàn)性，但加大光譜寬度反而減低了準確度。v原則為：在保證測定的情況下，應(yīng)用較低的狹縫分光光度計的誤差v散射光也是引起誤差的重要因素。散射光指一切未經(jīng)過測定溶液吸收，而又落到檢測器上引起干擾的光，如室內(nèi)自然光，也

24、包括能透過比色皿的非測定需要的其它波長的光。v v散射光干擾對高濃度測定特別有害，能使吸光度降低，標準曲線的高濃部分向下彎曲。v 使用原則：分光光度計宜安裝在光線較暗的室內(nèi)。熒光分析法v光致發(fā)光光致發(fā)光：物質(zhì)受到光照射時，除：物質(zhì)受到光照射時，除吸收吸收某種波長的光之外還會某種波長的光之外還會發(fā)射發(fā)射出比原來所吸收的波長更長的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。出比原來所吸收的波長更長的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。v熒光熒光：物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從：物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)能級返回基態(tài)時發(fā)射出的光。時發(fā)射出的光。v我們通常所說的熒光，是指物質(zhì)在

25、吸收紫外光后發(fā)出的波長較長的紫外熒我們通常所說的熒光，是指物質(zhì)在吸收紫外光后發(fā)出的波長較長的紫外熒光或可見熒光，以及吸收波長較短的可見光后發(fā)出波長較長的可見熒光。光或可見熒光，以及吸收波長較短的可見光后發(fā)出波長較長的可見熒光。除了紫外熒光和可見熒光，還有紅外熒光、除了紫外熒光和可見熒光，還有紅外熒光、X射線熒光等射線熒光等 v熒光分析法熒光分析法：根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度進行物質(zhì)：根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度進行物質(zhì)鑒定鑒定和和含量測定含量測定的方法。的方法。v特點：特點：v1 1）靈敏度高）靈敏度高v2 2）選擇性好）選擇性好v3 3）方法簡單快速，用樣量少）方法簡單快速，用樣量少v

26、4 4）應(yīng)用受限）應(yīng)用受限熒光分析法的基本原理一、分子熒光一、分子熒光 （一）分子熒光的產(chǎn)生（一）分子熒光的產(chǎn)生 （二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 二、熒光與分子結(jié)構(gòu)二、熒光與分子結(jié)構(gòu) 三、影響熒光強度的外部因素三、影響熒光強度的外部因素 一、分子熒光一、分子熒光v（一）分子熒光的產(chǎn)生（一）分子熒光的產(chǎn)生v1、分子的電子能級與激發(fā)過程、分子的電子能級與激發(fā)過程 基態(tài)基態(tài)+ +hv激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)v光譜中電子能級可分為二組：光譜中電子能級可分為二組：v1 1）電子）電子自旋配對自旋配對的（電子自旋方向的（電子自旋方向相反相反，電子的凈，電子的凈自旋自旋S=0S=0，譜線多

27、重性，譜線多重性M=2S+1=1M=2S+1=1）稱為單重態(tài)或單線）稱為單重態(tài)或單線態(tài)，以態(tài)，以S S表示。表示。v2 2）電子）電子自旋非配對自旋非配對的（電子自旋方向的（電子自旋方向相同相同，其凈自，其凈自旋旋S=1S=1，譜線多重性，譜線多重性M=3M=3）稱為三重態(tài)或三線態(tài)，以）稱為三重態(tài)或三線態(tài)，以T T表示。表示。 v激發(fā)單重態(tài)與相應(yīng)的三重態(tài)的區(qū)別在于電子激發(fā)單重態(tài)與相應(yīng)的三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向自旋方向不同及三重態(tài)的不同及三重態(tài)的能級能級稍低一些。稍低一些。v三重態(tài)壽命較長。三重態(tài)壽命較長。v2、熒光的產(chǎn)生、熒光的產(chǎn)生基態(tài)基態(tài)光輻射光輻射激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)基態(tài)基態(tài)釋放能量釋放能量v

28、振動弛豫振動弛豫（vibrational relexationvibrational relexation） 處于激發(fā)態(tài)各振動能級的分子通過與溶劑分子的碰撞，處于激發(fā)態(tài)各振動能級的分子通過與溶劑分子的碰撞，能量傳遞給溶劑分子，電子返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振能量傳遞給溶劑分子，電子返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級。動能級。 特點特點：無輻射無輻射躍遷；只能在躍遷；只能在同一電子能級內(nèi)同一電子能級內(nèi)進行；時間進行；時間約為約為1010-12-12s s；使大多數(shù)電子激發(fā)態(tài)處于其最低振動能級上。；使大多數(shù)電子激發(fā)態(tài)處于其最低振動能級上。v內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（internal convers

29、ioninternal conversion）：內(nèi)轉(zhuǎn)換）：內(nèi)轉(zhuǎn)換 兩個電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致其振動能級有兩個電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致其振動能級有重疊時，受激分子常由高電子能級以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電重疊時，受激分子常由高電子能級以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級的過程。子能級的過程。 特點特點：無輻射無輻射躍遷；兩個電子激發(fā)態(tài)具有躍遷；兩個電子激發(fā)態(tài)具有相同的多重性相同的多重性（都是單重態(tài)或都是三重態(tài)，如（都是單重態(tài)或都是三重態(tài)，如S S2 2* *SS1 1* *，T T2 2* *TT1 1* *）。）。處于激發(fā)單重態(tài)的分子通過振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換，均可返回到處于激發(fā)單重態(tài)的分子通過

30、振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換，均可返回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。 v熒光發(fā)射熒光發(fā)射 處于第一激發(fā)單重態(tài)最低振動能級的電子以輻射形式發(fā)處于第一激發(fā)單重態(tài)最低振動能級的電子以輻射形式發(fā)射光量子而返回至基態(tài)的任一振動能級上，發(fā)射的光量子射光量子而返回至基態(tài)的任一振動能級上，發(fā)射的光量子稱為熒光。稱為熒光。 特點特點： 1 1）發(fā)射光量子發(fā)射光量子，且熒光波長總是長于激發(fā)光波長；，且熒光波長總是長于激發(fā)光波長； 2 2）時間約為）時間約為1010-9-9-10-10-7-7s s； 3 3）熒光譜線有時呈現(xiàn)幾個非常）熒光譜線有時呈現(xiàn)幾個非常接近的峰接近的峰（電子返回到（電子返回

31、到基態(tài)不能振動能級，能級差不同，吸收波長不同）；基態(tài)不能振動能級，能級差不同，吸收波長不同）； 4 4）處于基態(tài)不同能級的電子會通過振動弛豫返回到基）處于基態(tài)不同能級的電子會通過振動弛豫返回到基態(tài)最低振動能級。態(tài)最低振動能級。v（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜v激發(fā)光譜激發(fā)光譜（excitation spectrumexcitation spectrum）：）：不同激發(fā)波長不同激發(fā)波長的輻射引起物質(zhì)發(fā)射的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光某一波長熒光的相對效率。的相對效率。 繪制：固定發(fā)射波長，熒光強度（繪制：固定發(fā)射波長，熒光強度（F F）對激發(fā)波）對激發(fā)波長（長（ex

32、ex）的關(guān)系曲線，其形狀與吸收光譜相似。）的關(guān)系曲線，其形狀與吸收光譜相似。v熒光光譜熒光光譜（fluorescence spectrumfluorescence spectrum）：在所發(fā)射的）：在所發(fā)射的熒光中各種波長熒光中各種波長組分的相對強度。組分的相對強度。 繪制：固定激發(fā)光波長和強度，熒光強度（繪制：固定激發(fā)光波長和強度，熒光強度（F F）對發(fā)射波長（對發(fā)射波長（emem）的關(guān)系曲線。）的關(guān)系曲線。熒光分析法通常采用熒光分析法通常采用exexmaxmax與與ememmaxmax。200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜

33、磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜v（二）有機化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（二）有機化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系v能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)同時具備兩個條件：能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)同時具備兩個條件： 1 1）有強的）有強的紫外紫外- -可見吸收可見吸收 2 2）有一定的）有一定的熒光效率熒光效率 長共軛長共軛分子分子較強紫外吸收較強紫外吸收 剛性平面剛性平面結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu)分子較高熒光效率較高熒光效率v1 1、長共軛結(jié)構(gòu)長共軛結(jié)構(gòu) 具有具有* *躍遷躍遷 大多數(shù)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有大多數(shù)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)芳香環(huán)或雜環(huán)，電子共軛電子共軛程度越大，熒光強度越大，熒光

34、波長也長移。程度越大，熒光強度越大，熒光波長也長移。v2 2、分子的剛性分子的剛性- -共平面性共平面性 分子剛性分子剛性- -共平面性越強，熒光效率越大，熒光波長越長。共平面性越強，熒光效率越大，熒光波長越長。v3 3、取代基取代基 1 1）給電子取代基給電子取代基，如，如-NH-NH2 2、-OH-OH、-OCH-OCH3 3、-NHR-NHR、-NR-NR2 2、-CN-CN等，能增加分子的等，能增加分子的電子共軛程度，常使熒光效率提高，熒光電子共軛程度，常使熒光效率提高，熒光波長長移。波長長移。 2 2）吸電子取代基吸電子取代基，如，如-COOH-COOH、-NO-NO2 2、-C=O

35、-C=O、-NO-NO、-SH-SH、- -NHCOCHNHCOCH3 3、-F-F、-Cl-Cl、-Br-Br、-I-I等，減弱分子的等，減弱分子的電子共軛程度，電子共軛程度，使熒光減弱甚至熄滅。使熒光減弱甚至熄滅。 3 3）取代基對）取代基對電子共軛體系電子共軛體系作用較小作用較小，如，如-R-R、-SO-SO3 3H H、 -NH-NH3 3+ +等，對熒光影響也不明顯。等，對熒光影響也不明顯。熒光探針分子的幾個基本要求熒光探針分子的幾個基本要求 v（1）能產(chǎn)生穩(wěn)定的，較強的熒光。v（2）探針與被研究分子的某一微區(qū)必須有特異性的 結(jié)合，而且結(jié)合得比較牢固。v（3）探針的熒光必須對環(huán)境條件

36、較敏感。v（4）結(jié)合的探針不應(yīng)影響被研究的大分子的結(jié)構(gòu)和特性。v（三）熒光試劑（三）熒光試劑 弱弱/ /無熒光物質(zhì)無熒光物質(zhì)+ +熒光試劑熒光試劑強熒光產(chǎn)物強熒光產(chǎn)物v1 1、熒光胺（、熒光胺（fluorescaminefluorescamine）：）：v特點特點：與脂肪族和芳香族：與脂肪族和芳香族伯胺伯胺形成高度熒光衍生物。形成高度熒光衍生物。 熒光胺及其水解產(chǎn)物均不顯熒光。熒光胺及其水解產(chǎn)物均不顯熒光。v熒光條件熒光條件：exex=275/390nm=275/390nm，emem=480nm=480nm。 v2 2、鄰苯二甲醛（、鄰苯二甲醛（OPAOPA）：）：v特點特點：在：在2-2-巰

37、基乙醇存在下，巰基乙醇存在下，pH9-10pH9-10的緩沖溶液中的緩沖溶液中能與能與伯胺伯胺類、特別是半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸類、特別是半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的外的-氨基酸氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。生成靈敏的熒光產(chǎn)物。v熒光條件熒光條件：ex=340nmex=340nm，em=455nmem=455nm。v例：測定磺胺類藥物例：測定磺胺類藥物v3 3、1-1-二甲氨基二甲氨基-5-5-氯化磺酰萘（氯化磺酰萘（Dansyl-ClDansyl-Cl，DANS-ClDANS-Cl，丹酰氯）：，丹酰氯）： 與與伯、仲胺伯、仲胺及及酚基酚基的生物堿反應(yīng)生成熒光物質(zhì)。的生物堿反應(yīng)生成熒光物質(zhì)。v

38、丹酰肼（丹酰肼（Dansyl-NHNH2Dansyl-NHNH2）：）： 與可的松等的與可的松等的羰基羰基縮合，產(chǎn)生強烈熒光?？s合，產(chǎn)生強烈熒光。v熒光條件熒光條件：exex=365nm=365nm，emem=500nm=500nm。含胺基藥物的測定含胺基藥物的測定雌激素的測定雌激素的測定v4 4、測定無機離子的熒光試劑、測定無機離子的熒光試劑v無機離子無機離子+ +有機化合物有機化合物配合物配合物直接測定熒光強度直接測定熒光強度三、影響熒光強度的外部因素三、影響熒光強度的外部因素v1 1、溫度溫度：溫度：溫度熒光效率熒光效率，熒光強度，熒光強度 原因：溫度升高，分子運動速度加快，分子間碰撞幾

39、率原因：溫度升高，分子運動速度加快，分子間碰撞幾率增加，使無輻射躍遷增加，從而降低了熒光效率。增加，使無輻射躍遷增加，從而降低了熒光效率。v2 2、溶劑溶劑： 1 1）溶劑）溶劑極性極性：極性：極性熒光波長熒光波長，熒光強度，熒光強度 原因：極性溶劑中，原因：極性溶劑中，* *躍遷能量差躍遷能量差EE小，使紫外小，使紫外吸收波長和熒光波長均長移；躍遷幾率增加，使熒光強度增吸收波長和熒光波長均長移；躍遷幾率增加，使熒光強度增強。強。 2 2）溶劑）溶劑粘度粘度：粘度：粘度熒光強度熒光強度 原因：溶劑粘度低，分子間碰撞機會增加，使無輻射躍原因：溶劑粘度低，分子間碰撞機會增加，使無輻射躍遷增加，使熒

40、光減弱。遷增加，使熒光減弱。 溫度溫度溶劑粘度溶劑粘度熒光強度熒光強度 v3 3、酸度酸度： 熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿本身是弱酸或弱堿時，溶液的酸度對其熒光強時，溶液的酸度對其熒光強度有較大影響，因為在不同酸度中分子和離子間的平衡改變，度有較大影響，因為在不同酸度中分子和離子間的平衡改變，因此熒光強度也有差異。因此熒光強度也有差異。v如苯胺：在如苯胺：在pH7-12pH7-12溶液中主要以分子形式存在，發(fā)生藍色熒溶液中主要以分子形式存在，發(fā)生藍色熒光；光；pH2pH13pH13的溶液中均以離子形式存在，不發(fā)射熒光。的溶液中均以離子形式存在，不發(fā)射熒光。 v4 4、熒光熄滅劑熒光熄滅劑：

41、熒光熄滅熒光熄滅：熒光猝滅，指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引：熒光猝滅，指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象。起熒光強度降低的現(xiàn)象。熒光熄滅劑熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝：引起熒光熄滅的物質(zhì)，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物?；衔铩⒅氐衔?、羰基和羧基化合物。v作用機制作用機制： 1 1）熒光物質(zhì)分子和熄滅劑分子碰撞而損失能量；）熒光物質(zhì)分子和熄滅劑分子碰撞而損失能量； 2 2）熒光物質(zhì)分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的配位化合物；）熒光物質(zhì)分子與熄滅劑分

42、子作用生成了本身不發(fā)光的配位化合物； 3 3）溶解氧的存在，使熒光物質(zhì)氧化，或是由于氧分子的順磁性，促進體系）溶解氧的存在，使熒光物質(zhì)氧化，或是由于氧分子的順磁性，促進體系間跨越，激發(fā)單重態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三重態(tài)；間跨越，激發(fā)單重態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三重態(tài)； 4 4）濃度較大（超過）濃度較大（超過1g/L1g/L）時，發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。）時，發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。熒光熄滅法熒光熄滅法（fluorescence quenching methodfluorescence quenching method）：熒光物質(zhì)在加入某種熄滅）：熒光物質(zhì)在加入某種熄滅劑后，劑后，熒光強度的減弱和熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系

43、熒光強度的減弱和熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系，利用這一性質(zhì)測，利用這一性質(zhì)測定熒光熄滅劑的含量的方法。定熒光熄滅劑的含量的方法。熒光定量分析方法 一、熒光強度與物質(zhì)濃度的關(guān)系一、熒光強度與物質(zhì)濃度的關(guān)系v溶液的熒光強度溶液的熒光強度v在樣品濃度較低時，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。但到了一定濃在樣品濃度較低時，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。但到了一定濃度以后，就不再存在這種正比關(guān)系。在較濃的溶液中，熒光強度并不隨度以后，就不再存在這種正比關(guān)系。在較濃的溶液中，熒光強度并不隨溶液濃度呈正比增長。因此，必須找出與熒光強度呈線性的濃度范圍。溶液濃度呈正比增長。因此，必須找出與熒光強度呈線性的濃度范

44、圍。v v熒光物質(zhì)濃度過大時，常常發(fā)生猝滅現(xiàn)象。這樣就使熒光強度反而大大熒光物質(zhì)濃度過大時，常常發(fā)生猝滅現(xiàn)象。這樣就使熒光強度反而大大低于接近飽和時的熒光強度。對濃度猝滅產(chǎn)生的原因，最簡單的解釋是：低于接近飽和時的熒光強度。對濃度猝滅產(chǎn)生的原因，最簡單的解釋是：激發(fā)態(tài)分子在發(fā)出熒光之前就和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而自猝滅。激發(fā)態(tài)分子在發(fā)出熒光之前就和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而自猝滅。 v濃度過高，還可能形成樣品分子的二聚體或多聚體，因而降低熒光強度。濃度過高，還可能形成樣品分子的二聚體或多聚體，因而降低熒光強度。 條件：極稀溶液條件：極稀溶液 二、定量分析方法二、定量分析方法v1 1、校正曲線

45、法：、校正曲線法： 以熒光強度為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標。以熒光強度為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標。v2 2、比例法：、比例法： 在線性范圍內(nèi)，測定標樣和試樣熒光強度，對比。在線性范圍內(nèi)，測定標樣和試樣熒光強度，對比。v3 3、聯(lián)立方程式法：、聯(lián)立方程式法： 用于多組分混合物的熒光分析。用于多組分混合物的熒光分析。 熒光分光光度計和熒光分析新技術(shù) 一、熒光分光光度計一、熒光分光光度計v濾光片熒光計濾光片熒光計：激發(fā)濾光片激發(fā)濾光片讓激發(fā)光通過；讓激發(fā)光通過；發(fā)射發(fā)射濾光片濾光片常用截止濾光片，截去所有的激發(fā)光和散常用截止濾光片，截去所有的激發(fā)光和散射光，只允許試樣的熒光通過，不能測定光

46、譜，射光，只允許試樣的熒光通過，不能測定光譜，只用于定量分析只用于定量分析。v濾光片濾光片- -單色器熒光計單色器熒光計：將發(fā)射濾光片用光柵代替，：將發(fā)射濾光片用光柵代替，不能測定激發(fā)光譜，可不能測定激發(fā)光譜，可測定熒光光譜測定熒光光譜。v熒光分光光度計熒光分光光度計：兩個濾光片都用：兩個濾光片都用光柵光柵取代，可取代，可繪制繪制激發(fā)光譜和熒光光譜激發(fā)光譜和熒光光譜。v1 1、熒光分光光度計的主要部件：、熒光分光光度計的主要部件： 激發(fā)光源：氙燈、高壓汞燈、激光激發(fā)光源：氙燈、高壓汞燈、激光 激發(fā)單色器（樣品池前）：光柵或濾光片激發(fā)單色器（樣品池前）：光柵或濾光片 發(fā)射單色器（樣品池后）：光柵

47、或濾光片發(fā)射單色器（樣品池后）：光柵或濾光片 樣品池：石英樣品池：石英 檢測系統(tǒng)：光電倍增管檢測系統(tǒng)：光電倍增管v2 2、儀器的校正、儀器的校正v（1 1）靈敏度校正：）靈敏度校正： 用被檢測出的最低信號來表示，或用某一對照用被檢測出的最低信號來表示，或用某一對照品的稀溶液在一定激發(fā)波長光的照射下，能發(fā)射出品的稀溶液在一定激發(fā)波長光的照射下，能發(fā)射出最低信噪比時的熒光強度的最低濃度表示。最低信噪比時的熒光強度的最低濃度表示。v（2 2）波長校正：）波長校正： 用汞燈的標準譜線對單色器波長刻度校正。用汞燈的標準譜線對單色器波長刻度校正。v（3 3）激發(fā)光譜和熒光光譜的校正）激發(fā)光譜和熒光光譜的校

48、正 二、熒光分析新技術(shù)簡介二、熒光分析新技術(shù)簡介v1 1、激光熒光分析、激光熒光分析 光源：光源：激光激光，單色性極好，強度更大。，單色性極好，強度更大。 優(yōu)點：提高了熒光分析法的靈敏度和選擇性。優(yōu)點：提高了熒光分析法的靈敏度和選擇性。v2 2、時間分辨熒光分析：、時間分辨熒光分析： 利用不同物質(zhì)的利用不同物質(zhì)的熒光壽命熒光壽命不同，在激發(fā)和檢測不同，在激發(fā)和檢測之間延緩的時間不同，以實現(xiàn)分別檢測的目的。之間延緩的時間不同，以實現(xiàn)分別檢測的目的。 光源：脈沖激光。光源：脈沖激光。 應(yīng)用：多用于臨床檢驗，如乙肝病毒的檢測，應(yīng)用：多用于臨床檢驗，如乙肝病毒的檢測，甲狀腺功能檢測等。甲狀腺功能檢測等

49、。測定水中痕量釷的熒光時間分辨圖測定水中痕量釷的熒光時間分辨圖利用時間分辨熒光法消除鋁、鋯等的干擾利用時間分辨熒光法消除鋁、鋯等的干擾從圖中可見，在從圖中可見，在12s12s內(nèi)測定熒光信號，可基本消除鋁、鋯的影響。內(nèi)測定熒光信號，可基本消除鋁、鋯的影響。 v3 3、同步熒光分析、同步熒光分析（synchronous fluorometrysynchronous fluorometry） 原理原理：在熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜中選擇：在熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜中選擇一適宜的波長差值一適宜的波長差值（通常選用（通常選用exexmaxmax與與ememmaxmax之之差），同時掃描發(fā)射波長和激發(fā)波長，得到同步熒光差），同時掃描發(fā)射波長和激發(fā)波長，得到同步熒光光譜。若光譜。若值相當于或大于斯托克斯位移，就能獲值相當于或大于斯托克斯位移，就能獲得尖而窄的同步熒光峰。得尖而窄的同步熒光峰。熒光物質(zhì)濃度與同步熒光峰熒光物質(zhì)濃度與同步熒光峰峰高呈線性關(guān)系峰高呈線性關(guān)系，可用于定量分析?？捎糜诙糠治觥?優(yōu)點優(yōu)點：譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率。：譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率。 同步光譜同步光譜v4 4、膠束增敏熒光分析、膠束增敏熒光分析 膠束溶液膠束溶液即濃度在臨界濃度以上的表面活性即濃度在臨界濃度以上