URP立項(xiàng)申請(qǐng)書---中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院

1、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生“ URP立項(xiàng)申請(qǐng)書項(xiàng)目名稱 黃瓜嫩果皮黃色基因CsYg的克隆及表達(dá)分析申請(qǐng)人 劉興旺工作單位 園藝學(xué)院聯(lián)系電話填表日期2018年12月26日中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教務(wù)處制項(xiàng)目名稱黃瓜嫩果皮黃色基因 CsYg的克隆及表達(dá)分析項(xiàng)目起止時(shí)間2018 年 12 月-2019 年 12 月項(xiàng)目申請(qǐng)人情況姓名劉興旺性別男出生日期1983.05最后學(xué)歷 與學(xué)位博士專業(yè)技術(shù) 職務(wù)副教授從事專業(yè)蔬菜學(xué)一、項(xiàng)目7概況（1）項(xiàng)目的背景情況；項(xiàng)目研究的意義黃瓜是世界上四大蔬菜之一，世界總栽培面積僅次于番茄（ Li et al., 2009 ）。中國是世 界上黃瓜生產(chǎn)面積最大、產(chǎn)量最高的國家。據(jù) FAO統(tǒng)計(jì)，

2、2013年全世界的黃瓜總生產(chǎn)面 積是211萬公頃，其中僅中國就達(dá)116萬公頃，占全世界的 54.97% o全世界黃瓜總產(chǎn)量是7131萬噸，中國達(dá)到5436萬噸，占到全世界的 76.23%。黃瓜以其獨(dú)特的風(fēng)味，脆嫩的質(zhì) 地，深受世界各地消費(fèi)者的喜愛，在人民生活中占有重要的地位（劉春香，2003）。黃瓜在我國蔬菜生產(chǎn)中起著重要作用，其新品種的選育在我國日益受到重視，在 十五”期間，黃瓜育種第一次被列入國家86須目。隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)水平的飛躍，黃瓜生產(chǎn)逐步向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，人們對(duì)黃瓜品種的要求越來越高。其中品種的品質(zhì)改善是蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的 一個(gè)重要課題，也是國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)體系十三五期間的重點(diǎn)研究課題。因此

3、，解決黃瓜卜質(zhì)的改善有利于滿足人民對(duì)黃瓜品質(zhì)的需求，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。外觀品質(zhì)屬于黃瓜品質(zhì)的范疇。如皮色及其均一性、瓜長、果刺、果瘤、果皮光澤度 等（Yang et al., 2014）。由于消費(fèi)習(xí)慣的不同，世界上不同地區(qū)的人們對(duì)黃瓜果果皮顏色綠、 黃以及及色彩的均一的喜好不同。例如，在歐美國家絕大多數(shù)的鮮食黃瓜要求黃綠/翠綠、皮光亮、皮色均一、光滑無刺等。但我國的消費(fèi)者更鐘情于果皮顏色翠綠或深綠、表面 卜有稠密、凸起的果瘤的華北類型黃瓜。果實(shí)是黃瓜的產(chǎn)品部分，而嫩果果皮顏色作為果 "外觀品質(zhì)重要的性狀，直接影響著黃瓜果實(shí)商品銷售狀況。研究黃瓜嫩果皮顏色性狀的 、傳規(guī)律及分子調(diào)控機(jī)

4、制，對(duì)選育符合市場需求的黃瓜品種具有重要的理論意義。此外， 卜嫩果果皮顏色的研究還有利于豐富色素合成機(jī)理的理論發(fā)展。因此，嫩果皮顏色是黃瓜 卜觀品質(zhì)的關(guān)鍵性狀之一，而關(guān)鍵基因的克隆和鑒定是分子遺傳改良的基礎(chǔ)。（2）項(xiàng)目實(shí)施的必要性：國內(nèi)外的研究進(jìn)展國內(nèi)外學(xué)者已利用不同的遺傳背景及不同環(huán)境條件黃瓜嫩果皮顏色進(jìn)行了遺傳規(guī)律和 定位研究。早在1938年Cochran就報(bào)道了綠色果皮（dg）顯性于白色果皮（w）。Younger 認(rèn)為嫩果黃綠色果皮性狀由yg控制，黃綠色相對(duì)于深綠色為隱，yg對(duì)淺綠色基因具有上位作用。Lawrence和Todd認(rèn)為黃瓜嫩果皮顏色中黃綠色yg”隱性于深綠色，上位于淡綠色。S

5、trong和Tkachenko分別報(bào)道皮色暗綠色或有光澤由D基因控制，暗綠色為顯性；皮色一致或有斑駁由u基因控制，斑駁為顯性。孫小鐳等對(duì)4個(gè)黃瓜嫩果皮不同品種的葉綠素含量進(jìn)行遺傳分析，使用主基因+多基因聯(lián)合分析方法，認(rèn)為黃瓜嫩果皮葉綠素含量是受2對(duì)加性一顯性主基因+加性一顯性多基因（E-2模型）控制曲此推斷黃瓜嫩果皮色有兩對(duì)主基 因控制。李亞利等以綠皮黃瓜 WD3和白皮黃瓜B-2-2為父母本雜交獲得的 F2代為材料， 檢測到2個(gè)與黃瓜果皮綠色連鎖的SRAP標(biāo)記ME9EM1-309和ME8EM14-425 ,遺傳距離分別為6cM和8.3cM。張鳳青等以2個(gè)高代自交系0349-5 （果皮光澤，綠熟

6、時(shí)果皮純綠， 無瘤）、0345-2 （果皮無光澤，綠熟時(shí)果皮雜色， 有瘤）及其所繁殖的Fl代、F2代為試材，獲得了 2個(gè)AFLP標(biāo)記V7T3A363和V7T5A181 , V7T3A363與果色及果皮光澤性狀的遺傳 距離分別為 36.36cM和34.09cM , V7T5A181與果色及果皮光澤性狀的遺傳距離分別為 13.64cM和9.09 cMo孫曉丹等利用 AFLP技術(shù)鑒定出2個(gè)與黃瓜果白皮顏色連鎖的標(biāo)記 E43M61和E34M59 ,連鎖距離為 5.2cM和5.6cM。董邵云等運(yùn)用 SSR分子標(biāo)記對(duì)白色果 皮性狀進(jìn)行了基因定位研究，將白色果皮基因（w）定位于黃瓜 3號(hào)染色體上，側(cè)翼標(biāo)記為

7、SSR23141與SSR23517,遺傳距離分別為 1.9cM和4.9cM。迄今為止，黃瓜嫩果皮顏色yg的精細(xì)定位及標(biāo)記的開發(fā)研究尚未見報(bào)道。以Roche454、Illumina Solexa和最近LifeScience的Torrent技術(shù)平臺(tái)為代表的下一代 測序技術(shù)（Next-generation sequencing,NGS）的快速發(fā)展使得高通量測序和基因型分析成為 可能。近年來，利用新一代測序技術(shù)進(jìn)行全基因或部分基因組重測序的方法可以在品種（系）間發(fā)現(xiàn)數(shù)以萬計(jì)的 SNP和Indel變異（Jander,et al., 2002）。目前，在擬南芥、水稻、玉米、 大豆、黃瓜等已經(jīng)完成基因組測序

8、的作（植） 物中應(yīng)用NGS技術(shù)進(jìn)行研究進(jìn)化和基因組功 能方面起了推動(dòng)作用。NGS技術(shù)猶如上世紀(jì)末 PCR技術(shù)所起的作用一樣正在使生物學(xué)發(fā)生 過革命性變化，它被認(rèn)為是研究作物基因組、轉(zhuǎn)錄組、調(diào)控組、蛋白組、代謝組等各個(gè)水 平生物學(xué)問題的優(yōu)先方法（Varshney, R.et al., 2009; Morr物,P. et al., 2011; Qi et al., 2013 ）。由于NGS可以通過高通量獲得的基因組序列變異信息，同時(shí)，通過全基因組大樣本重測序?qū)χ参镏匾N質(zhì)資源進(jìn)行全基因組的基因型鑒定，并與關(guān)注的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組 關(guān)聯(lián)分析（GWAS）,找出與關(guān)注表型相關(guān)的SNP位點(diǎn)，定位（質(zhì)）數(shù)

9、量性狀基因。與（質(zhì)）數(shù)量性狀相關(guān)基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記，后續(xù)可用于分子標(biāo)記輔助育種，助力育種進(jìn)程。具有重大的科研價(jià)值和產(chǎn)業(yè)價(jià)值。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)115個(gè)黃瓜品系進(jìn)行了深度重測序，并構(gòu)建了包含360多萬個(gè)位點(diǎn)的全基因組遺傳變異圖譜并發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致西雙版納黃瓜果肉橙色的基因突變。這一發(fā)現(xiàn)不僅為培育營養(yǎng)價(jià)值更高的黃瓜品種提供了 分子育種工具，也為通過變異組快速挖掘重要性狀基因提供了新思路（ Qi et al., 2013 ）。盡管當(dāng)前研究在黃瓜開發(fā)并發(fā)掘了 一些嫩果果皮顏色性狀緊密連鎖的標(biāo)記，但是育種中的應(yīng)用還未見報(bào)道。因此，本研究利用之前GWAS定位于6號(hào)染色體末端獲得的區(qū)段及及通

10、過精細(xì)定位獲得了候選基因CsYg。課題將從候選基因克隆和表達(dá)分析等層面進(jìn)行集中深入地研究，為CsYg的功能研究奠定基礎(chǔ)。二、實(shí)施計(jì)劃及方案（明確各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力的具體思路及考核辦法）（一）文獻(xiàn)查找與閱讀項(xiàng)目參加者首先閱讀本課題組近年來發(fā)表的相關(guān)文章，同時(shí)學(xué)會(huì)引用關(guān)鍵詞以及相關(guān)技術(shù)搜索到相關(guān)文獻(xiàn)并進(jìn)行文獻(xiàn)閱讀，分析文章的思路并根據(jù)項(xiàng)目撰寫試驗(yàn)方案?？己宿k法：學(xué)生根據(jù)項(xiàng)目研究目的自擬一份實(shí)驗(yàn)方案及技術(shù)路線交給指導(dǎo)教師，由老師考核評(píng)分。（二）實(shí)施計(jì)劃1. CsYg基因的CDS （基因編碼區(qū)）全長的克?。?017.5-2017.6）以“ 9930” cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)Cs

11、Yg基因進(jìn)行全長的擴(kuò)增。該環(huán)節(jié)對(duì)學(xué)生進(jìn)行微觀 RNA及DNA知識(shí)的具象培養(yǎng)；以克隆全程的電泳照片及測序結(jié)果 為考核依據(jù)。2. CsYg基因的在黃瓜各部位的熒光定量表達(dá)分析（2017.6-2017.9）取黃瓜的根、莖、葉、雌花、雄花、卷須及花后8天果實(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行CsYg基因的表達(dá)分析。該環(huán)節(jié)對(duì)具體基因的表達(dá)模式進(jìn)行創(chuàng)新性探究，分析部位表達(dá)差異的本質(zhì)；以表達(dá)結(jié)果的示意圖及熒光收據(jù)收集為考核指標(biāo)。3. CsYg基因在黃瓜果皮的原位雜交分析(2017.9-2018.3)取花前2天，花當(dāng)天的子房及花后 8天的果皮，利用設(shè)計(jì)好的探進(jìn)，對(duì) CsYg進(jìn)彳T mRNA 上雜交，進(jìn)行可視化的觀察

12、。該環(huán)節(jié)對(duì)學(xué)生的動(dòng)手及對(duì)mRNA的表達(dá)方式、累及、表達(dá)部位及微觀概念的具象化起重要卜用，以原位雜交的結(jié)果圖進(jìn)行考察。(二)實(shí)施方案1 .RNA 提?。豪?SV Total RNA Isolation system 試劑盒(Promega, USA)提取黃瓜各部 位的總RNA,以葉片為例，其主要步驟為：(1)在滅菌的離心管中加入175科的RNA裂解緩沖液(RLA,提前加好BME );(2)將黃瓜葉片加液氮磨碎，取30mg磨碎的葉片迅速加入裂解緩沖液中，徹底顛倒均勻；(3)加入350科lRNA稀釋緩沖液(RDA ,藍(lán)色)，顛倒3-4次混勻，12000g離心10min；轉(zhuǎn)移上清液(澄清裂解液，約有

13、 500口)到一個(gè)新的離心管中；(4)力口 200科l95%勺乙醇到上清液中，用移液器吸打3-4次混勻；(5)將混合物轉(zhuǎn)移到 Spin Wash Assembly中，12000g離心1min,棄洗脫液；(6)力口 600科lRNA洗液(RWA ,提前加好乙醇)12000g離心1min ,棄洗脫液；(7)按需混合制備 DNase incubation mix(至少要在第4步驟之后再配制，現(xiàn)配現(xiàn)用 )。(8)力口 50lDNase混合到Spin Wash Assembly的膜上，保證混合液接觸并完全覆蓋到膜上，20-25 C室溫下溫育 15min；(9)加200科的DNase終止液(DSA,提前加

14、乙醇)，離心1min,可不用棄收集管中的洗脫液；(10)加600科的RNA洗液(RWA),離心1min,棄洗脫液；(11)加 250 科的 RNA 洗液(RWA),離心 2min,將 Spin Basket 加入洗脫管(Elution Tube) 中；(12)加100科的無核酸酶的水到 Spin Basket的膜上，要完全覆蓋，離心 1min,洗脫RNA 到洗脫管中，-70 C保存； (13)總RNA質(zhì)量及濃度的測定參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 的方法，用濃度為1.2%的非變性瓊脂糖凝膠電泳， 檢測總RNA 的完整性。用紫外分光光度劑測定 RNA再260nm, 280nm的吸收值，確定 RNA的純度

15、卜口濃度。2 .CDNA的合成：(1)將已滅菌0.5mlPCR專用離心管置于冰浴上備用。 目的RNA模板置于冰浴融化， 吸取所 需體積后及時(shí)冷凍保存。 如目的RNA模板需要稀釋，要用預(yù)冷的Nuclease-free water稀釋， 卜將稀釋后的模板置于冰浴。(2)RNA和反轉(zhuǎn)錄引物的混合及變性，將如下成分混合，65c溫育 5min： RNA 2冏 (3)迅速冰浴，短暫離心后加以下成分，混勻 37c孵育2min : 5x第一鏈合成緩沖液10 口Olligo(dT) 2.5 科 l;dNTP(10mM) 2.5l;NucfHasewater 23總網(wǎng)積30科I0.1M DDT 5臼1 RNase

16、 OUT 核酸酶才制齊2.5(4)cDNA 鏈合成：力口入 2.5 l MMLV Reverse Transcriptase (Promega, USA)混勻，37 c孵育 50min;(5)反轉(zhuǎn)錄酶滅火：70c孵育15min終止反應(yīng)。滅活后的反應(yīng)液可冷凍保存(-20C)；(6)cDNA質(zhì)量的檢測：用 beta-actin引物為內(nèi)參做 PCR,檢測擴(kuò)增質(zhì)量。3 CsYg基因的克隆(1)在黃瓜基因數(shù)據(jù)庫()中進(jìn)行基因ID的輸入。根據(jù) ORF的cDNA末端設(shè)計(jì)引物。(2)cDNA第一條鏈可直接進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。分裝PCR反應(yīng)混合液于已滅菌的 0.5mlPCR專用離心管，然后于每個(gè)管子加入含有cDN

17、A的RT反應(yīng)液至終體系為 50 n在0.2ml的PCR管中加入如下成分:Takala LA 酶 0.5 *2xGC 25口, dNTP2c l,cDNA2 / l,Primer S 2A2pl,ddhbO 16.5 內(nèi) 1 總體積 50 只(3)將上述試劑混勻后進(jìn)行 PCR反應(yīng)，各反應(yīng)管置于預(yù)熱至 94c的PCR循環(huán)儀進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件進(jìn)行初步探索。大致條件為： 95c預(yù)變性5min； 95c變性30s；(未知)退 火45s, 72c延伸3min, 35個(gè)循環(huán)；72c末端延伸10min。(4)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果分析。取 5lPCRT物，加已點(diǎn)在紙上的 6x上樣緩沖液，反復(fù)吸打混 勻進(jìn)

18、行EB染色的瓊脂糖凝膠電泳，100V左右，電泳20-30分鐘，紫外燈下觀察 DNA條 k結(jié)果進(jìn)行掃描保存。4 .PCR產(chǎn)物的膠純化與回收：(1)按照產(chǎn)物大小計(jì)算合適的凝膠濃度，加熱瓊脂糖融于TAE緩沖液中；(2)待冷卻后加入微量 EB染色，倒膠，放置 30min至凝膠完全凝結(jié)；(3)將樣品混合loading buffer與marker一起點(diǎn)樣，在 80V,100mA的條件下電泳 30min ;(4)在Alpha凝膠成像儀上觀察條帶，在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠。(5)稱量膠塊重量，以1mg=11計(jì)算膠塊體積；(6)按照凝膠回收試劑盒的說明回收目的條帶5 .目的片段與測序載體的連接：

19、(1)將載體在冰上融化，把裝有載體的離心管短暫離心，以免液體掛在管壁上；(2)按照下面的內(nèi)容在無菌的離心管中加入成分：目的PCR片段X l, pGM-T載體1pJ10xT4 DNA Ligation buffer 1, T4DNA Ligase( 3U/ 科 l) 1 無菌去離子水補(bǔ)充到 10 口(3)輕輕彈動(dòng)離心管使混合物混合，短暫離心。使用 10x T4 DNA Ligation buffer時(shí)，將混合 反應(yīng)液置于16 C 8小時(shí)或者常溫2-3小時(shí)。6 .重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選、陽性克隆鑒定及測序：轉(zhuǎn)化平板的制備：向鋪好的含有相應(yīng)抗生素的固定瓊脂平板表面加入33口的IPTG(24mg/

20、ml)、40科的X-gal(20 mg/ml),使用無菌的彎頭玻璃棒將其均勻的涂開，避光置于37c放置5分鐘，使溶解的X-gal的二甲基甲酰胺盡量發(fā)揮干凈。卜組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：(1)離心使連接反應(yīng)內(nèi)容物匯集到管底，取5 d連接產(chǎn)物加到置于冰上的50-100科農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH&中，連接產(chǎn)物的加入量不得超過感受態(tài)的1/10輕彈混勻，禁止劇烈振蕩或者吹打，冰浴30min;(2)將離心管置于42c水浴激熱120s,取出管后立即置于冰浴中放置2-3min;(3)將離心管總加入 250-500科l 37預(yù)熱的LB (不含抗生素)培養(yǎng)基，150rpm、37c振蕩培養(yǎng)45min ,使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)

21、記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇；(4)將離心管中的菌液混勻，吸取200科加到含氨節(jié)的LB固定培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻卜輕輕的將細(xì)胞均勻涂開，涂抹時(shí)避免反復(fù)來回涂布。室溫放置待平板表面干燥后，倒置平板，37c培養(yǎng)12-16小叱(5)次日觀察結(jié)果，在含有抗生素的瓊脂平板上有菌落生長者即為轉(zhuǎn)化細(xì)菌，未轉(zhuǎn)化細(xì)菌卜菌落生長，比較對(duì)照平皿，轉(zhuǎn)化平皿中有白色菌落生長，說明轉(zhuǎn)化成功。卜白斑篩選、調(diào)斑、進(jìn)行檢測：(1)用滅菌白色搶頭挑取平板上的白色菌落接種1-5mlLB(含有終濃度50-100科g/ml的氨茉青霉素)培養(yǎng)基，37 C搖床振蕩培養(yǎng)過夜。(2)在制備的PCR混合液終加搖好的菌液 1科在沸水上溫育10min。

22、將樣品冷卻至室溫，離心數(shù)秒，然后于管中加入Taq酶0.25四(3)PCR 程序：95 c預(yù)變性 5min； 95 c變性30s；(未知)退火 45s, 72 c延伸3min, 35 個(gè)循環(huán)；72 c末端延伸10min。(4)取5plPCFT物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，將擴(kuò)增出正確長度的菌液送樣品測 序。7 .熒光定量PCR:(1)天根熒光定量 PCR 20科體系為:Mix 9科l,Primer S和Primer A 各0.2科l,DNA 2科1, ddH2O8.6 閔(2)PCR程序：95c預(yù)變性2min； 95c變性15s；(未知)退火 30s, 68c延伸30s, 40個(gè) 循環(huán)；72

23、 c末端延伸10min。(3)溶解曲線溫度 95C, 15s； 60C, 1min； 95 C , 30s； 60 C , 15s。本試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。其中黃瓜 beta-actin為內(nèi)參基因，利用 2-人相對(duì)定量分析方 法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量8 .原位雜交：首先探針的制作，在黃瓜原位雜交技術(shù)中，一般用地高辛標(biāo)記的 RNA探針。在目的基因序列上選取一段長度為 200-500bp的特異片片段，以其作為模板設(shè)計(jì)引物并在引物上下由游 分別加上SP6和T7聚合酶結(jié)合序列及保護(hù)堿基。以黃瓜 cDNA為模板，利用特異引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，并在體外進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、純化、水解、清洗等過程合成地高辛標(biāo)記的

24、探針，最 后在尼龍膜上進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，來檢測探針的質(zhì)量。同時(shí)可根據(jù)染色的深淺程度來判斷探針 的濃度并初步確定在正式雜交時(shí)探針?biāo)♂尩谋稊?shù)。此外，分別用 SP6和T7RNA聚合酶 來合成正義和反義探針，其中，正義探針來作為對(duì)照。取黃瓜花當(dāng)天的幼果作為樣品進(jìn)行固定和石蠟包埋。在雜交之前進(jìn)行切片和烤片。在切片時(shí)要注意厚度一般在 8-12um之間，切下片子之后要放置于 37 c的DEPC水中進(jìn)行展開， 后撈取出充分展平的石蠟片放在載玻片上，用吸水紙吸取多余的水分置于37c的烤片機(jī)上放置12-36個(gè)小時(shí)。用烤好的片子進(jìn)行雜交。首先對(duì)準(zhǔn)備好的片子進(jìn)行脫蠟、復(fù)水、蛋白酶處理、組織再固 定、乙酸酎處理、洗滌和脫

25、水等處理，然后根據(jù)斑點(diǎn)雜交的結(jié)果來稀釋探針，配備好雜交 液后小心到處理好的片子上，蓋上蓋玻片，密封后置于50c烘箱中過夜雜交。12小時(shí)后，將夾雜好的片子進(jìn)行洗滌、封閉和抗體處理、再洗滌后再密封、避光的條件下進(jìn)行顯色反 應(yīng)。1-3天后用TE緩沖液洗片并置于顯微鏡下觀測記錄。最后用封片劑封片，以便長期保 存。三、項(xiàng)目實(shí)施的基礎(chǔ)和條件1工作基礎(chǔ)：利用本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)測序的 60于份骨干材料，通過大約100多個(gè)高質(zhì)量的SNP進(jìn)行了黃瓜黃皮基因的關(guān)聯(lián)分析，初步將黃瓜嫩果相關(guān)基因CsYg鎖定在3號(hào)染色的末端（圖1A和1B）。同時(shí)以黃瓜嫩果黃皮性狀的純材料6101-5和其相對(duì)的野生型 6101-4構(gòu)建近等基因的

26、F2群體材料（圖2A-2C）研究了其遺傳規(guī)律（表 1）。結(jié)合GWAS分析結(jié)果和QTL定位精細(xì)結(jié) 果（圖3）,將候選基因限定在 3號(hào)染色的SNP131 （39637440）和SNP168 （）標(biāo)記之間的 63.8kb的區(qū)間內(nèi)。在這個(gè)區(qū)間內(nèi)共有17個(gè)基因，只有 CsYg發(fā)生了非同義氨基酸的突變。因此我們首先將其作為 CsYg的候選基因。圖1黃瓜嫩果皮黃色基因的 GWAS分析結(jié)果圖2黃瓜內(nèi)果皮黃色基因材料的表征通過 GWAS得P高段記圖析的較區(qū)標(biāo)鎖分出值的的連11 a15 816 510 4394929910 33953198C1.139637440 1397012402 5- 3972573332397403923975O3W39 76888739773W3圖3黃瓜嫩果黃皮性狀基因F2群體精細(xì)定位表1黃瓜嫩果黃皮性狀的遺傳規(guī)律調(diào)查表Population - Season (vear)*Total .N