右心室肥大時(shí)心肌間質(zhì)膠原改建及其前膠原基因的表達(dá)

1、右心室肥大時(shí)心肌間質(zhì)膠原改建及其前膠原基因的表達(dá) 【摘要】目的了解法樂(lè)四聯(lián)癥肥大右室心肌間質(zhì)、型膠原的改建及與前膠原基因mRNA表達(dá)的關(guān)系，為防治心肌間質(zhì)膠原改建提供新的依據(jù)和途徑。方法用生化方法定量分析了22例法樂(lè)四聯(lián)癥患者和8例非心血管及膠原系統(tǒng)疾病尸檢者的右室心肌間質(zhì)中的膠原含量和、型膠原比值，以及用斑點(diǎn)雜交法測(cè)定法樂(lè)四聯(lián)癥患者右室心肌間質(zhì)、型前膠原基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果法樂(lè)四聯(lián)癥組心肌間質(zhì)膠原含量為（14.85±2.48）g/mg總蛋白，較對(duì)照組(7.55±1.89) g/mg總蛋白明顯增多（P0.05）；其/型膠原比值為5.10±1.84，較對(duì)照組2.

2、27±0.58顯著增高（P0.05）；法樂(lè)四聯(lián)癥組右室心肌間質(zhì)膠原含量與、型前膠原基因表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)系數(shù)分別為0.80（P0.001）、-0.277（P0.10）。右室心肌間質(zhì)膠原/型比值與/ 型前膠原基因表達(dá)強(qiáng)度比值呈正相關(guān)，r=0.47（P0.05）。結(jié)論提示法樂(lè)四聯(lián)癥肥大右室心肌間質(zhì)存在以膠原含量增多和/型比值增高為特點(diǎn)的膠原改建，且主要與型前膠原基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)有關(guān)。 Remodeling of myocardial interstitial collagen and procollagen gene expression 1 / 14【Abstract】Object

3、iveTo investigate the characteristics and procollagen gene expression of myocardial interstitial collagen of right ventricle in tetralogy of Fallot (TOF).MethodsSamples of the infundibular septum from 22 patients with TOF and 8 patients without cardiovascular disease and collagen system disease as c

4、ontrol were studied. Collagen was determined by biochemical methods, Pro (I) mRNA, Pro (III) mRNA levels were determined by dot blot hybridization.ResultsThe hydroxyproline concentration and the ratio of type / collagen in the right ventricle with TOF were significantly higher than those in controls

5、 14.85±2.48 (±s) g/mg total protein vs 7.55±1. 89 g/mg total protein, respectively, P0.05; 5.10±1.84 vs 2.27±0.58, P0.05, respectively. The correlation between the hydroxyproline concentration with the level of Pro ()mRNA, Pro () mRNA were 0.80 (P0.001) and -0.277 (P0.10), r

6、espectively. The correlation between the ratio of type I/III collagen and the ratio of type / procollagen mRNA was positive (r=0.47, P0.05).ConclusionIncreased collagen and the ratio of type / collagen are the characteristics in collagen remodeling of the hypertrophic right ventricle in TOF. Enhance

7、d type procollagen gene expression may be the cause of the increased collagen synthesis. 【Key words】tetralogy of Fallotmyocardiumcollagenfibrosis 左室心肌間質(zhì)纖維化已日漸引起人們的重視，心肌間質(zhì)纖維化是心力衰竭(心衰)進(jìn)展中的有害因素之一1。右室肥大是否和左室肥大一樣面臨同樣的問(wèn)題? Bishop等2對(duì)動(dòng)物右室肥大模型的研究結(jié)果表明：早期間質(zhì)膠原不一定增加，后期則有明顯增加，/型膠原比值亦升高，其原因是由于膠原基因mRNA的水平上調(diào)。對(duì)于人類，Sch

8、wartz等3報(bào)道嬰兒時(shí)期法樂(lè)四聯(lián)癥的右室膠原面積百分比與正常對(duì)照組相差無(wú)異，而李新民等4觀察到法樂(lè)四聯(lián)癥患者右室心肌間質(zhì)有纖維化，但缺乏定量研究。鑒于此，筆者著重研究法樂(lè)四聯(lián)癥患者右室肥大時(shí)心肌間質(zhì)纖維化的主要組成部分即膠原的改建和前膠原基因mRNA的表達(dá)，為進(jìn)一步研究心肌間質(zhì)膠原改建的防治提供依據(jù)和新的途徑。 資料與方法 1.病例：術(shù)前和術(shù)中確診并行法樂(lè)四聯(lián)癥根治術(shù)的患者共22例，年齡 1.529歲，平均（8.7±6.4）歲；同期非心血管病及膠原系統(tǒng)疾病死亡者為對(duì)照組共8例，平均年齡（6.4±5.7）歲，兩組間年齡差異無(wú)顯著性(P0.05)。 2.膠原分析：法樂(lè)四聯(lián)癥組

9、和對(duì)照組切取右室流出道心肌組織塊，剪去心內(nèi)膜，預(yù)冷 PBS沖洗后液氮速凍，貯存于-70。用TRIzol試劑盒一步法提取總蛋白，用改良?jí)A水解法測(cè)定羥脯氨酸（標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化所東風(fēng)生化技術(shù)公司），按Lowry法測(cè)定總蛋白濃度，然后參照Tanaka和Honda的方法提取膠原，經(jīng)SDS-PAGE電泳并以對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)、型膠原蛋白（Sigma產(chǎn)品）區(qū)帶的積分值進(jìn)行膠原/型比值分析。 3.探針:(1)含型前膠原1鏈cDN A探針簡(jiǎn)稱 pro 1()探針的PUC 18重組質(zhì)粒由美國(guó)康涅狄格大學(xué)健康中心兒科的U. Rowe和B.E Kream惠贈(zèng)，經(jīng)轉(zhuǎn)化、抽提、酶切、純化，得到1.3kb pro

10、 1() 探針；（2）pro 1()探針為 4.5 kb cDNA(由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病研究所劉秉慈老師提供)；（3）內(nèi)對(duì)照選用雞的磷酸-3-甘油醛脫氫酶（GAPDH）探針，片段大小為0.6 kb（由湖南醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所江寧博士提供）。 4.心肌組織總RNA的提取和雜交：用TRIzol試劑盒一步法提取心肌組織總的RNA，以放射性同位素32P為標(biāo)記物，隨機(jī)引物試劑盒標(biāo)記探針，各點(diǎn)上樣量為20 g,用斑點(diǎn)雜交法檢測(cè) mRNA，將膜上各點(diǎn)pro 1()、pro 1()的灰度面積積分除以同一膜上GAPDH的灰度面積積分即為各型mRNA的表達(dá)強(qiáng)度。 5.數(shù)據(jù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以

11、±s表示，組間比較采用方差分析，t檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)， 法樂(lè)四聯(lián)癥組膠原含量與前膠原基因表達(dá)的關(guān)系采用直線相關(guān)分析。 結(jié)果 1.法樂(lè)四聯(lián)癥組心肌間質(zhì)膠原含量（以羥脯氨酸含量代表）平均（14.85±2.48） g/mg總蛋白，較對(duì)照組平均(7.55±1.89) g/mg總蛋白明顯增多，P0.05； 法樂(lè)四聯(lián)癥/型膠原比值5.10±1.84，較對(duì)照組2.27±0.58顯著增高，P0.05。 2.法樂(lè)四聯(lián)癥組右室心肌間質(zhì)膠原含量與型膠原基因表達(dá)強(qiáng)度相關(guān)性分析顯示，兩者呈正相關(guān)， r=0.80，P0.001；與型膠原基因表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)分析顯示，其相關(guān)系數(shù)為-

12、0.277， P0.10，差異無(wú)顯著性。右室心肌間質(zhì)膠原/型比值與/ 型膠原基因表達(dá)強(qiáng)度比值的相關(guān)分析顯示，兩者呈正相關(guān)(r=0.47，P0.05)。 討論 心肌組織包括心肌細(xì)胞和間質(zhì)，間質(zhì)約占心肌組織體積的25%，由細(xì)胞和基質(zhì)組成，其中含有內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等5。膠原為間質(zhì)基質(zhì)的主要成分，由型和型膠原構(gòu)成，其中80%以上為型，型僅占11%左右，此外還有少量型及型膠原等6。 Eghbail 等7用原位雜交法在離體心臟細(xì)胞上檢測(cè)、型膠原mRNA，發(fā)現(xiàn)只在成纖維細(xì)胞上表達(dá)，而心肌細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)?，F(xiàn)一般認(rèn)為，心成纖維細(xì)胞合成分泌心肌間質(zhì)膠原，一些文獻(xiàn)報(bào)道在動(dòng)物的右室肥大模型中觀察到右

13、室肥大時(shí)其心肌間質(zhì)膠原有一動(dòng)態(tài)改建過(guò)程：早期間質(zhì)膠原不一定增加，后期則有明顯增加，/型膠原比值亦升高， 其原因是由于成纖維細(xì)胞膠原基因mRNA的水平上調(diào)2。 Schwartz則在研究主動(dòng)脈閉鎖嬰兒（58個(gè)月）的右室心肌間質(zhì)膠原并與法樂(lè)四聯(lián)癥（1天9個(gè)月）、主動(dòng)脈閉鎖（14天）及正常嬰兒（19個(gè)月）相比較，發(fā)現(xiàn)前者較后三者的右室心肌間質(zhì)膠原明顯增加， 而后三者間無(wú)明顯差異；認(rèn)為：嬰兒早期單純壓力負(fù)荷過(guò)重并不引起心肌間質(zhì)膠原的堆積，隨后并有容量負(fù)荷過(guò)重，冠脈缺血、RAA系統(tǒng)激活及膠原基因mRNA上調(diào)，才導(dǎo)致心肌間質(zhì)膠原增生。本研究進(jìn)一步證實(shí)了法樂(lè)四聯(lián)癥組膠原含量較對(duì)照組明顯增多，且觀察到膠原含量增

14、加時(shí)/型膠原比值升高， 表明是以型膠原增多為主。、型膠原基因表達(dá)的改變亦與之平行，說(shuō)明是由于型前膠原基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，合成分泌型膠原增多，導(dǎo)致了膠原的異常堆積，產(chǎn)生了心肌間質(zhì)纖維化。 心肌間質(zhì)纖維化與心臟的僵硬度異常有關(guān)， 逆轉(zhuǎn)心肌間質(zhì)纖維化能使肥大心室的異常僵硬度正?；?。如何來(lái)逆轉(zhuǎn)法樂(lè)四聯(lián)癥業(yè)已存在的右室心肌間質(zhì)纖維化，改善右室的僵硬度，進(jìn)一步提高根治術(shù)后患者的生存質(zhì)量，尚待進(jìn)一步研究。 參考文獻(xiàn) 1Robert V， Van Thiem N， Cheav SL, et al. Increased cardiac types I and III collagen mRNAs in

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