核酸提取常見試劑的作用原理8頁

1、異硫氰酸胍強用力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu)的破壞消失而迅速與核酸分離。胍鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑，在通常使用的蛋白質(zhì)變性劑中作用最強的是異硫氰酸胍，它們可以使多數(shù)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成一隨機的卷曲狀態(tài)。含有強力的陰離子和陽離子基團，它們可以形成較強的氫鍵。在還原劑存在的情況下，異硫氰酸胍可以斷裂氫鍵，而去垢劑，如SDS存在的情況下，可以破壞疏水作用。鹽酸胍、尿素鹽酸胍是一個核酸酶的強抑制劑，它并不是一種足夠強的變性劑，可以允許完整的RNA從富含RNase的組織中提取出來。4-8M可斷裂氫鍵，有兩種可能機制：1變性蛋白和鹽酸胍、尿素優(yōu)先結(jié)合，形成變性蛋白

2、-變性劑復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物被除去，從而引起N-D反應(yīng)平衡向右移動，隨著變性劑濃度增加，天然狀態(tài)的蛋白不斷轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合物，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)完全變性；2鹽酸胍、尿素對氨基酸的增溶作用，能形成氫鍵，當(dāng)濃度高時，能破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu)，結(jié)果鹽酸胍、尿素就稱為非極性殘基的較好溶劑，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水殘基伸展和溶解性加強，鹽酸胍、尿素引起的變性往往是不可逆的。高濃度尿素使蛋白質(zhì)變性并抑制Rnase活性十二烷基肌氨酸鈉 使蛋白質(zhì)解體 變性巰基試劑1防止蛋白質(zhì)或酶等（如輔酶A）分子中SH基團氧化成二硫鍵，2在某些酶反應(yīng)過程中維持體系的還原環(huán)境。DTT，DDTE、巰基乙醇應(yīng)用最廣，谷胱甘肽也常應(yīng)用，由于他是生物體內(nèi)的還原

3、劑，同時氧化后能被谷胱甘肽還原酶原位釋放。DNA提取中，常使用巰基乙醇，維持緩沖液的還原環(huán)境，防止多酚類氧化，由于具有一定的毒性，濃度不應(yīng)高于2%。巰基乙醇-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵（肽和蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘基中的鍵）。1 還原蛋白質(zhì)二硫鍵，使Rna酶變性2 抑制酚類氧化，若氧化，核酸會變成灰黑色，苯酚的氧化產(chǎn)物苯醌等氧化物引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián)3 保護蛋白質(zhì)的巰基 蛋白質(zhì)提取中需要巰基乙醇還原二硫鍵，使RNA酶失活化學(xué)變性劑SDS、尿素、鹽酸胍能破壞疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華力使蛋白質(zhì)變性但不影響肽鍵和二硫鍵，不能使蛋白質(zhì)徹底變性加上還原

4、劑巰基乙醇或DTT，能還原二硫鍵，使RNA徹底變性DTT二硫蘇糖醇刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。而且DTT比巰基乙醇的濃度低7倍時，兩者效果相近，但DTT價格略高一些。由于容易被空氣氧化，因此DTT的穩(wěn)定性較差；但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命。由于質(zhì)子化的硫的親核性較低，隨著pH值的降低，DTT的有效還原性也隨之降低；DTT或含有DTT的溶液不能進行高壓處理。抑制Rnase活性TCEP 三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽半胱氨酸Trizol苯酚、異硫氰酸胍、8羥基喹啉、-巰基乙醇等。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到

5、釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8羥基喹啉、異硫氰酸胍、-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。液氮組織破碎，裂解細胞SDS十二烷基硫酸鈉 陰離子去垢劑，高溫（55-65）裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，形成SDS/蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合物，釋放核酸，提高鹽（KAc或NaAc）濃度并降低溫

6、度（冰?。?，使SDS/蛋白質(zhì)/復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}酸形式，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀更加完全、離心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNA操作簡單，溫和，可提取到高分子量的DNA，但產(chǎn)物多糖類雜質(zhì)較多陽離子強表面活性劑，通常與蛋白酶K和抗氧化劑、螯合劑一起使用可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離溶解膜類蛋白SDS 能裂解細胞。使細胞中的蛋白質(zhì)和核酸之間常借著靜電引力或配位鍵結(jié)合，陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵，使染色體離析，蛋白變性，釋放核酸。（1）SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)的疏水部位;（2）SDS可引起蛋白質(zhì)

7、構(gòu)象改變（3）SDS是一種良好的解離劑，可使蛋白質(zhì)溶解，變性（4）形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，并使復(fù)合物帶負電質(zhì)粒方面：在1的SDS溶液中慢慢加入5 N的 NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是 KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉 （sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的納離子形成了不溶性的PDS，

8、而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDS共沉淀了CTABCTAB：十六烷基三甲基溴乙胺，低溫時易沉淀陽離子去污劑一種在高鹽下能和核酸結(jié)合形成可溶、穩(wěn)定的復(fù)合物，低鹽濃度下可沉淀的表面活性劑是一種陽離子去污劑, 低離子強度（0.1-0.5M NaCl），沉淀核酸與酸性多聚糖，而蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液中。在高離子強度的溶液中(>0.7m

9、ol/L NaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。CTAB可從大量產(chǎn)生黏多糖的植物及某些革蘭氏陰性菌制備純化的DNA，這種去污劑加入調(diào)節(jié)至高離子強度的細菌和細胞裂解液中（0.7M NaCl），經(jīng)過連續(xù)的酚/氯仿抽提，去除CTAB/黏多糖/ 蛋白質(zhì)復(fù)合體，異丙醇/無水乙醇沉淀上清即可將DNA分離出來CTAB還有提高DNA互補鏈復(fù)性速率及穩(wěn)定已形成的DNA雙螺旋的作用CTAB法的主要特點是用用較廣 CTAB溶液在低于15度會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料時，必須預(yù)熱，且離心溫度不低于

10、15度EDTA酶抑制劑，螯合二價金屬，抑制金屬依賴性的酶螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制細胞中DNase的活性，該酶可降解DNAEDTA是去垢劑，結(jié)合離子用，而它結(jié)合的部分離子是能夠誘發(fā)或者促進RNA酶活性的，比如Ca2+。EDTA是一種二價離子熬合劑,能熬合Mg2+和Ca2+等二價陽離子,而多種RNA酶的活性是需要依賴二價陽離子的,所以EDTA能通過熬合二價陽離子來抑制RNA酶的活性堿性條件下才能夠溶解，要和NaOH粉末混合后，再加水，然后用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH。0.01M，DNase酶基本失活。BSA酶抑制劑，使一些降解酶的活性的表面變性精胺或其他多胺酶抑制劑，降低核酸酶的影響氰化物酶抑

11、制劑，降低重金屬氧化酶的影響PVP減少酚類、醌類、單寧類物質(zhì)的影響，抗氧化作用，絡(luò)合多酚和萜類物質(zhì)，防止多酚類褐變而氧化，去除多糖和色素，色素是PCR強抑制劑，必須去除樣品液氮研磨及提取緩沖液中加入PVP或PVPP等能絡(luò)合多酚和萜類物質(zhì)，離心或氯仿抽提出去，有效防止多酚氧化成醌類，避免溶液變褐色而具有抗氧化能力提取液中加入適量的PVP或PVPP能提高DNA的純度，用量根據(jù)雜質(zhì)而定（1-6%），PVP同時能去除多糖，因此將PVP和巰基乙醇配合使用并調(diào)整用量，能有效防止多酚污染PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖

12、結(jié)合，有效去除多糖。Triton-x100Triton X100之類的去垢劑有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，所以在280nm有很強的吸收。蛋白酶K蛋白酶K：切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。蛋白酶K 在較廣的pH范圍內(nèi)均有活性（pH 4-12.5） 溫度范圍37-60度 鹽濃度3M GuHCl 或4M尿素中均有活性 在一些去污劑：Tween20(5%)、Triton X-100 (1%)和SDS(1%)條件下也有活性。蛋白酶K消化裂解法適用于所有標本的消化處理，尤以DNA樣品為佳.如組 織細胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、

13、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌 物、尿，糞便等.蛋白酶K的一般工作濃度是50100g/ml蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質(zhì),滅活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸，有人使用蛋白酶替代DEPC處理水的，但有些人說效果不好。蛋白酶 K，威力巨大的廣譜蛋白酶，95C 加熱10 分鐘，則完全失活。數(shù)年前首次使用它替代 DEPC 處理 RNA 抽提用的離心管和槍頭，效果不錯；后來又用于處理 RNase-Free的水，效果也是一級棒。從此就再也不用 DEPC 了。配制 RNA 裂解試劑時，直接用滅菌的雙蒸水配制，最后，加入蛋

14、白酶 K 至終濃度 1ug/ml。輕輕混勻，室溫放置 15 分鐘后即可。槍頭及離心管去除 RNase：先將槍頭及離心管清洗干凈后，移入預(yù)先混好的含 1ug/ml 蛋白酶 K 的雙蒸水，徹底浸入。室溫放置 30 分鐘后，連水一起高壓滅菌。棄水后，烘干即可。RNase-Free 水的獲得：直接在滅菌的雙蒸餾水中加入蛋白酶 K 至終濃度 1ug/ml。輕輕混勻，室溫放置 15 分鐘后，滅菌處理即可。該蛋白質(zhì)的殘留對后續(xù)實驗沒有可見的影響。無蛋白質(zhì)殘留的RNase-Free 水的獲得：這比較麻煩。直接在滅菌的雙蒸餾水中加入蛋白酶 K 至終濃度 1ug/ml。輕輕混勻后，倒入專用的蒸餾器中。放置 15

15、分鐘后，加熱蒸餾，流出的就是無蛋白質(zhì)殘留的RNase-Free 水。要提醒的是，該專用蒸餾器頭幾次流出來的水，只能當(dāng)普通蒸餾水用，因為通道中難確保 RNase-Free 的環(huán)境；另外，一定要主要密閉性，否則，流出的水又被污染了。DNA裂解液的作用是破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，抑制細胞中Dnase的活性，而蛋白酶k的作用是將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來！溶菌酶溶壁酶DnaseRnase多糖水解酶：水解多糖飽和酚酚是一種有機溶劑,預(yù)先要用STE 緩沖液飽和,因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸

16、鏈交聯(lián)：故在制備酚飽和液時要加入82羥基喹嚀,以防止酚氧化。苯酚非極性分子 水為極性分子使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1. 有效變性蛋白質(zhì)；2. 抑制了DNase的降解作用。能有效使蛋白質(zhì)變性而出去，酚形成的有機相破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性，從而蛋白質(zhì)不會分布在水相中，避免核酸污染缺點：1. 能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。酚變性大，但與水相有一定程度的互溶，大約10-15%

17、的水溶在酚相中，使核酸損失酚（Phenol）對蛋白質(zhì)的變性作用遠大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），應(yīng)此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔(dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進行。

18、至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。氯仿非極性分子 水為極性分子去除脂肪,使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）氯仿變性不如酚好，但與水不混溶，不會帶走DNA因此混合使用最佳，經(jīng)酚第一次抽提的水相有殘留的酚，由于酚和氯仿互溶，可用氯仿第二次帶走酚，也可在第二次抽提中混合使用，比例為1：1苯酚/氯仿苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)非極性分子 水為極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c他們混合時，蛋白質(zhì)分子見的水分子被擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性，經(jīng)離心，變性蛋白密度比對大，而與水

19、相分離，苯酚/氯仿比重大，保留在最下層苯酚氯仿 使蛋白質(zhì)變性 量要足夠，因為苯酚去除蛋白是有一定的飽和度的，超過飽和度，裂解體系中蛋白質(zhì)不能被一次性去除，必須多次抽提。離心后分三層，下層有機層中有一些脂溶性的雜質(zhì)，中間層白色絮狀沉淀是蛋白，上清液中即含有核酸； 變性后的蛋白質(zhì)從水相中析出，位于苯酚中或苯酚與水相之間。異戊醇抽提DNA，為混合均勻，容易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用，加入異戊醇降低分子表面張力，一般采用氯仿：異戊醇=24：1或酚：氯仿：異戊醇=25：24：1（不必先配置，臨用前加入即可）減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從

20、而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解于液相沉淀DNA時總會加入高濃度的鹽,加鹽的目的是破壞能使蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定的兩個因素,使蛋白和DNA分離并沉淀下來.而此時鹽的陽離子會與DNA結(jié)合形成DNA-陽離子鹽溶于溶液中,再用無水乙醇可以將DNA-陽離子鹽沉淀下來提取DNA時先加0.14mol/L氯化鈉，因為在這種濃度的氯化鈉溶液中，DNA的溶解度最低，而蛋白質(zhì)的溶解度增加，這樣通過過濾能將DNA分離開，以除去蛋白質(zhì)。再加入95%的酒精能使DNA沉淀，因為在這個濃度下DNA溶解度最低。如

21、果直接加酒精不先加氯化鈉，DNA和蛋白質(zhì)都能被酒精所沉淀，就無法將DNA和蛋白質(zhì)分離開。所以必須先加氯化鈉后加酒精，順序不能顛倒。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。這樣可以是DNA沉淀出來在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多

22、的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進行洗滌或重沉淀。檸檬酸鈉它可以控制反應(yīng)體系的離子強度，同時還有一定的緩沖作用，保證體系PH的相對穩(wěn)定狀態(tài)，總之檸檬酸鈉在這里的作用類似于食物中的防腐劑。DEPC焦碳酸二乙酯，它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。與肝素何用效果增強。在Tris中不穩(wěn)定，很快會分解為二氧化碳和乙醇。強烈但不徹底的RNA酶抑制劑 0.1%濃度Tris-HCl緩沖體系，使pH變化不會太大異丙醇加入異丙醇之后立即出現(xiàn)絮狀沉淀，我一直以為這是正確的，看了帖子才知道是蛋白質(zhì)污染，異丙醇的沉淀效果要比無水乙醇的沉淀效果要好，但是異丙醇沉淀有一

23、個弊端就是會沉淀下來好多的鹽和蛋白質(zhì)這樣會影響下一步的操作，一般我加異丙醇是等體積的效果還可以。70%乙醇70%乙醇洗滌DNA沉淀(因為在70%乙醇里DNA是不溶的,而鹽離子卻可溶),用無水乙醇則達不到這個目的!乙醇對于蛋白質(zhì)、核酸的沉淀效應(yīng)隨分子量加大而增大，小分子的核酸和蛋白質(zhì)碎片是可以溶于75%乙醇的。漂洗DNA，是為了去除殘余的鹽類，去除過量SDS和酚等雜物，因為SDS在70%的乙醇中保持溶解狀態(tài)，不與DNA共沉淀，從而通過棄上清液去除這種去污劑,避免對以后PCR反應(yīng)的影響。DEPC（焦碳酸二乙酯）:常用RNA酶抑制劑，與RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性,強烈但不徹底的RNA酶抑制劑甲酰胺用高濃度甲酰胺替代苯酚從細胞裂解物的蛋白酶K消化物中分離抽提DNA，