《細(xì)胞破碎技術(shù)》ppt課件

1、孫萬儒孫萬儒中國科學(xué)院微生物研討所中國科學(xué)院微生物研討所 細(xì)胞破碎是了解細(xì)胞組成和構(gòu)造細(xì)胞破碎是了解細(xì)胞組成和構(gòu)造, ,獲得細(xì)胞獲得細(xì)胞內(nèi)含物的必要手段。內(nèi)含物的必要手段。 胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性差胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性差, ,條件不適條件不適極易失活。特別是微生物細(xì)胞非常微小極易失活。特別是微生物細(xì)胞非常微小, ,細(xì)細(xì)胞壁構(gòu)造比較嚴(yán)密胞壁構(gòu)造比較嚴(yán)密, ,普通方法不易將細(xì)胞突普通方法不易將細(xì)胞突破破, ,有些技術(shù)雖然可以有些技術(shù)雖然可以, ,但條件嚴(yán)苛但條件嚴(yán)苛, ,胞內(nèi)生胞內(nèi)生物活性物質(zhì)在此條件下很易失活物活性物質(zhì)在此條件下很易失活, ,限制了一限制了一些技術(shù)的運(yùn)用。些技術(shù)的運(yùn)用。

2、 在一定程度上細(xì)胞破碎仍是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化在一定程度上細(xì)胞破碎仍是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)。關(guān)鍵技術(shù)。 細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法 物理法物理法 化學(xué)法化學(xué)法 浸透浸透 超聲超聲 高壓高壓 球磨球磨 研磨研磨 堿處堿處 酶法酶法 有機(jī)有機(jī) 外表外表 休克休克 波法波法 釋放釋放 法法 法法 理法理法 溶劑溶劑 活性活性 法法 法法 法法 劑法劑法 微生物細(xì)胞外膜使細(xì)胞具有剛性的外形微生物細(xì)胞外膜使細(xì)胞具有剛性的外形, ,由胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁組成由胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁組成, ,其構(gòu)造影響著細(xì)胞破其構(gòu)造影響著細(xì)胞破碎。碎。 胞質(zhì)膜堅(jiān)持著細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)濃度梯度胞質(zhì)膜堅(jiān)持著細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)濃度梯度, ,主要由蛋白質(zhì)和脂

3、類組成。沒有細(xì)胞壁時主要由蛋白質(zhì)和脂類組成。沒有細(xì)胞壁時, ,膜膜對浸透休克敏感對浸透休克敏感, ,對其它破碎方法影響較小。對其它破碎方法影響較小。 細(xì)胞壁是破碎的主要妨礙細(xì)胞壁是破碎的主要妨礙, ,其組成和構(gòu)造其組成和構(gòu)造對細(xì)胞破碎有重要影響。細(xì)胞壁的組成和構(gòu)對細(xì)胞破碎有重要影響。細(xì)胞壁的組成和構(gòu)造與遺傳和環(huán)境要素有關(guān)造與遺傳和環(huán)境要素有關(guān), ,但在微生物的種屬但在微生物的種屬中也存在總構(gòu)造上的類似性。中也存在總構(gòu)造上的類似性。 細(xì)菌細(xì)胞壁的組成細(xì)菌細(xì)胞壁的組成 1964年年Salton初次利用機(jī)械破碎法破碎細(xì)初次利用機(jī)械破碎法破碎細(xì)菌細(xì)胞，對細(xì)菌細(xì)胞壁組成、構(gòu)造和功能進(jìn)菌細(xì)胞，對細(xì)菌細(xì)胞壁

4、組成、構(gòu)造和功能進(jìn)展研討。對格蘭氏陽性菌和格蘭氏陰性菌的展研討。對格蘭氏陽性菌和格蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁構(gòu)造有了較為全面認(rèn)識。細(xì)胞壁構(gòu)造有了較為全面認(rèn)識。 除了菌質(zhì)和一些除了菌質(zhì)和一些L-型和嗜鹽菌以外，幾型和嗜鹽菌以外，幾乎一切的細(xì)菌的壁的較鞏固部分都是由短肽乎一切的細(xì)菌的壁的較鞏固部分都是由短肽交聯(lián)的糖原鏈，即粘肽構(gòu)成，圍繞著細(xì)胞構(gòu)交聯(lián)的糖原鏈，即粘肽構(gòu)成，圍繞著細(xì)胞構(gòu)成延續(xù)的網(wǎng)狀構(gòu)造，使細(xì)胞具有一定的外形成延續(xù)的網(wǎng)狀構(gòu)造，使細(xì)胞具有一定的外形和強(qiáng)度。和強(qiáng)度。 細(xì)菌粘肽構(gòu)造表示圖 N-乙酰基胞壁酸(M)和N-乙?；咸烟前?G)交替構(gòu)成糖原束, 由 M 引出的縱點(diǎn)代表四肽單元的氨基酸殘基，橫點(diǎn)

5、代表肽交聯(lián)橋 不同物種的不同物種的N-乙?；谒嵩谄鋫?cè)鏈基團(tuán)乙?；谒嵩谄鋫?cè)鏈基團(tuán)上的取代有變化。但對糖原鏈的三維構(gòu)造沒有上的取代有變化。但對糖原鏈的三維構(gòu)造沒有明顯影響。明顯影響。N-乙酰基胞壁酸殘基的乳酸基與肽乙?；谒釟埢娜樗峄c肽鏈結(jié)合，將糖原鏈結(jié)合起來構(gòu)成網(wǎng)狀構(gòu)造。鏈結(jié)合，將糖原鏈結(jié)合起來構(gòu)成網(wǎng)狀構(gòu)造。 至少至少N-乙?；谒釟埢娜轷；糠挚梢阴；谒釟埢娜轷；糠挚蔀樗碾膯卧〈噜彽奶窃溣呻臉蚪宦?lián)。為四肽單元取代，相鄰的糖原鏈由肽橋交聯(lián)。大腸桿菌大約有大腸桿菌大約有50%的四肽單元未交聯(lián)，其它的四肽單元未交聯(lián)，其它的僅作為二聚體交聯(lián)。在嗜酸乳酸菌中，大約的僅作

6、為二聚體交聯(lián)。在嗜酸乳酸菌中，大約有有90%的四肽單元交聯(lián)，約的四肽單元交聯(lián)，約30%的四肽單元作的四肽單元作為三聚體交聯(lián)。為三聚體交聯(lián)。 雖然幾乎一切的細(xì)菌都含有根本的粘肽網(wǎng)雖然幾乎一切的細(xì)菌都含有根本的粘肽網(wǎng)構(gòu)造，但格蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的壁構(gòu)造有明構(gòu)造，但格蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的壁構(gòu)造有明顯不同。格蘭氏陽性菌的壁相當(dāng)厚，約顯不同。格蘭氏陽性菌的壁相當(dāng)厚，約15-50 15-50 nmnm，含有，含有40-90%40-90%的由根底多糖和磷壁酸質(zhì)組成的由根底多糖和磷壁酸質(zhì)組成的粘肽，一些種屬的細(xì)胞外表有規(guī)律地陳列著的粘肽，一些種屬的細(xì)胞外表有規(guī)律地陳列著蛋白質(zhì)亞基。蛋白質(zhì)亞基。 格蘭氏陰性菌細(xì)

7、胞壁由薄的粘肽層格蘭氏陰性菌細(xì)胞壁由薄的粘肽層(1.5-2.0nm)(1.5-2.0nm)和在電子顯微照片上看好像胞質(zhì)膜和在電子顯微照片上看好像胞質(zhì)膜一樣的外膜組成，粘肽層上還共價(jià)結(jié)合有脂蛋一樣的外膜組成，粘肽層上還共價(jià)結(jié)合有脂蛋白，一些種屬在外膜上另外還有一層規(guī)律陳列白，一些種屬在外膜上另外還有一層規(guī)律陳列的蛋白質(zhì)亞基。的蛋白質(zhì)亞基。 酵母細(xì)胞壁構(gòu)造更難加以闡明?？偟臉?gòu)造要酵母細(xì)胞壁構(gòu)造更難加以闡明?？偟臉?gòu)造要比格蘭氏陽性菌的厚些。面包酵母細(xì)胞壁大約為比格蘭氏陽性菌的厚些。面包酵母細(xì)胞壁大約為70nm70nm，且隨培育時間的添加細(xì)胞壁加厚。，且隨培育時間的添加細(xì)胞壁加厚。 酵母細(xì)胞壁含有大量

8、葡聚糖，甘露聚糖和酵母細(xì)胞壁含有大量葡聚糖，甘露聚糖和蛋白質(zhì)，但不清楚以怎樣的方式結(jié)合構(gòu)成根本構(gòu)蛋白質(zhì)，但不清楚以怎樣的方式結(jié)合構(gòu)成根本構(gòu)造。在葡聚糖鏈上有造。在葡聚糖鏈上有(1,3)(1,3)和和(1,6)(1,6)鍵結(jié)合的鍵結(jié)合的分支鏈構(gòu)造。酵母細(xì)胞壁的甘露聚糖主要是由分支鏈構(gòu)造。酵母細(xì)胞壁的甘露聚糖主要是由(1,2)(1,2)糖苷鍵和少量的糖苷鍵和少量的(1,3)(1,3)糖苷鍵結(jié)合的甘糖苷鍵結(jié)合的甘露糖組成，另外，也有經(jīng)過露糖組成，另外，也有經(jīng)過(1,6)(1,6)糖苷鍵結(jié)合糖苷鍵結(jié)合的甘露寡糖側(cè)鏈，在甘露糖殘基上有時也有磷酸的甘露寡糖側(cè)鏈，在甘露糖殘基上有時也有磷酸二酯鍵。在酵母細(xì)胞

9、壁上發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)主要是與二酯鍵。在酵母細(xì)胞壁上發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)主要是與甘露糖復(fù)合，多數(shù)是酶，而不是構(gòu)造組分。甘露糖復(fù)合，多數(shù)是酶，而不是構(gòu)造組分。 格蘭氏陽性(a)和陰性(b)細(xì)菌的細(xì)胞壁的橫斷面圖 CM代表胞質(zhì)膜; CW為細(xì)胞壁構(gòu)造; SU為有規(guī)律陳列的亞基; PG為粘肽層; OM為格蘭氏陰性菌的外膜；類型不同，亞基能夠存在也能夠不存在。 酵母細(xì)胞壁構(gòu)造表示圖酵母細(xì)胞壁構(gòu)造表示圖 外層甘露聚糖外層甘露聚糖(M)經(jīng)過經(jīng)過磷酸二酯鍵與蛋白磷酸二酯鍵與蛋白(P)結(jié)結(jié)合，內(nèi)部蛋白含有交聯(lián)合，內(nèi)部蛋白含有交聯(lián)的糖原的糖原(G) 大多數(shù)真菌的細(xì)胞壁是由多糖和少量的大多數(shù)真菌的細(xì)胞壁是由多糖和少量的蛋白質(zhì)及脂

10、類組成，但組成變化很大，只需蛋白質(zhì)及脂類組成，但組成變化很大，只需個別的真菌細(xì)胞壁作了較詳細(xì)研討。正如細(xì)個別的真菌細(xì)胞壁作了較詳細(xì)研討。正如細(xì)菌和酵母一樣，多糖是構(gòu)成細(xì)胞外形和耐受菌和酵母一樣，多糖是構(gòu)成細(xì)胞外形和耐受破碎的主要構(gòu)造物。破碎的主要構(gòu)造物。 真菌細(xì)胞壁組成和構(gòu)造的多樣性，不能真菌細(xì)胞壁組成和構(gòu)造的多樣性，不能將一個種屬的結(jié)果推行到另一個種屬上。從將一個種屬的結(jié)果推行到另一個種屬上。從影響細(xì)胞破碎的角度看，有其共同點(diǎn)，就是影響細(xì)胞破碎的角度看，有其共同點(diǎn)，就是菌絲體生長過程中細(xì)胞壁的變化對細(xì)胞破碎菌絲體生長過程中細(xì)胞壁的變化對細(xì)胞破碎的影響。的影響。 細(xì)胞壁組分與真菌分類細(xì)胞壁組分

11、與真菌分類 關(guān)鍵多糖 分類組 纖維素，糖原 集胞(粘)菌綱(Acrasiomycetes) 纖維素，-葡聚糖 卵菌目(Oomycetes),水霉目(Saprolegnicales) 霜霉目(Peronosporales),水節(jié)霉目(Leptomitales) 纖維素，殼多糖， 卵菌目(Oomycetes),水節(jié)霉目(Leptomitales) -葡聚糖 纖維素，殼多糖 絲壺菌目(Hyphochytridiomycetes) 去乙?；鶜ざ嗵牵?接合菌目(Zygomycetes) 殼多糖 殼多糖，-葡聚糖 壺菌目(Chytridiomycetes), 子囊菌目(Ascomycetes),除了半子囊

12、菌亞綱 (Hemiascomycetidae), 擔(dān)子菌綱Basidiomycetes)除 了擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae) 甘露糖,-葡聚糖 半子囊菌綱(Hemiascomycetidae) 甘露糖,殼多糖 紅酵母科(Rhodotorulaceae)粗糙脈孢菌的細(xì)胞壁構(gòu)造表示圖粗糙脈孢菌的細(xì)胞壁構(gòu)造表示圖 層次組成：層次組成：(a)最外層由最外層由-和和-葡葡聚糖混合組成聚糖混合組成, (b)葡聚糖組合葡聚糖組合在蛋白類資料中的糖蛋白網(wǎng)絡(luò)在蛋白類資料中的糖蛋白網(wǎng)絡(luò),(c)主要是蛋白質(zhì)類物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)類物質(zhì),(d)內(nèi)部的內(nèi)部的殼多糖類物質(zhì)區(qū)，嵌鑲在蛋白類殼多糖類物質(zhì)區(qū)，

13、嵌鑲在蛋白類物質(zhì)中的微原纖維殼多糖。物質(zhì)中的微原纖維殼多糖。 裂褶菌裂褶菌(Schizophyllum commune)細(xì)胞壁的細(xì)胞壁的組分雖然與之不同，但具有一樣的層次構(gòu)造。三組分雖然與之不同，但具有一樣的層次構(gòu)造。三種聚合物種聚合物(R)-葡聚糖，葡聚糖，(S)-葡聚糖和殼多糖大約葡聚糖和殼多糖大約占細(xì)胞壁干重的占細(xì)胞壁干重的70%，(R)-葡聚糖是一個高分枝葡聚糖是一個高分枝聚合物，分支點(diǎn)為聚合物，分支點(diǎn)為(1,3)和和(1,6)，且與壁的惰性，且與壁的惰性層中的微原纖維殼多糖復(fù)合。層中的微原纖維殼多糖復(fù)合。 真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度與聚合物的網(wǎng)狀構(gòu)造有關(guān)，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度與聚合物的網(wǎng)狀構(gòu)造有關(guān)

14、，至少含有的纖維狀的殼多糖和纖維素對細(xì)胞強(qiáng)度至少含有的纖維狀的殼多糖和纖維素對細(xì)胞強(qiáng)度有加強(qiáng)作用。有加強(qiáng)作用。 微生物細(xì)胞壁的外形和強(qiáng)度與壁內(nèi)構(gòu)造聚合物的構(gòu)造和它們彼此之間交聯(lián)及與其它組分的交聯(lián)程度有關(guān)。為到達(dá)破碎細(xì)胞目的，必需突破這種共價(jià)結(jié)合的網(wǎng)狀構(gòu)造。這種構(gòu)造不僅與其遺傳特性有關(guān)，也與其生長環(huán)境和生長階段有關(guān)，而真菌的細(xì)胞壁構(gòu)造還和發(fā)酵時的機(jī)械作用有關(guān)，因此表現(xiàn)為極其豐富的多樣性。 利用機(jī)械破碎細(xì)胞時，細(xì)胞的外形和大小，細(xì)胞壁構(gòu)造聚合物的交聯(lián)程度均是決議破碎難易的重要要素。要預(yù)知各種微生物細(xì)胞對機(jī)械破碎的耐受才干也有困難。 利用化學(xué)法和酶法破碎細(xì)胞時，了解細(xì)利用化學(xué)法和酶法破碎細(xì)胞時，了解

15、細(xì)胞壁的組成和構(gòu)造對選擇詳細(xì)方法顯得非常胞壁的組成和構(gòu)造對選擇詳細(xì)方法顯得非常重要。由于在網(wǎng)狀構(gòu)造之上覆蓋有維護(hù)層，重要。由于在網(wǎng)狀構(gòu)造之上覆蓋有維護(hù)層，掌握它們的構(gòu)造組成和非構(gòu)造組成是選擇酶掌握它們的構(gòu)造組成和非構(gòu)造組成是選擇酶和化學(xué)方法的根據(jù)。然而，有關(guān)這些方面的和化學(xué)方法的根據(jù)。然而，有關(guān)這些方面的知識還非常有限，還需運(yùn)用其它方法對這種知識還非常有限，還需運(yùn)用其它方法對這種精細(xì)構(gòu)造進(jìn)展更有效的研討。精細(xì)構(gòu)造進(jìn)展更有效的研討。 破碎細(xì)胞的目的主要有二，一是獲得細(xì)胞破碎細(xì)胞的目的主要有二，一是獲得細(xì)胞的內(nèi)含物，二是獲得細(xì)胞膜物質(zhì)。不論是那一的內(nèi)含物，二是獲得細(xì)胞膜物質(zhì)。不論是那一種目的，獲得

16、最大的破碎率是一切破碎技術(shù)追種目的，獲得最大的破碎率是一切破碎技術(shù)追求的目的。求的目的。 為了檢測破碎過程和破碎結(jié)果，需求快速、為了檢測破碎過程和破碎結(jié)果，需求快速、簡捷的細(xì)胞破碎程度的分析技術(shù)。細(xì)胞破碎率簡捷的細(xì)胞破碎程度的分析技術(shù)。細(xì)胞破碎率可直接利用完好細(xì)胞計(jì)數(shù)法或質(zhì)量檢測法，也可直接利用完好細(xì)胞計(jì)數(shù)法或質(zhì)量檢測法，也可利用細(xì)胞釋放出來的特定組分間接測定?？衫眉?xì)胞釋放出來的特定組分間接測定。 直接測定法是規(guī)范化法，間接測定法能夠直接測定法是規(guī)范化法，間接測定法能夠更有用，更有價(jià)值?？筛鶕?jù)詳細(xì)情況采用不同更有用，更有價(jià)值?？筛鶕?jù)詳細(xì)情況采用不同的測定方法。的測定方法。1. 直接測定法直接

17、測定法 運(yùn)用顯微鏡或用電子粒子計(jì)數(shù)器直接進(jìn)展完好細(xì)胞運(yùn)用顯微鏡或用電子粒子計(jì)數(shù)器直接進(jìn)展完好細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)數(shù),適宜細(xì)胞破碎過程。然而，破碎釋放的物質(zhì)，適宜細(xì)胞破碎過程。然而，破碎釋放的物質(zhì)，如如DNA和其它聚合物組分會干擾計(jì)數(shù)。為進(jìn)展顯微和其它聚合物組分會干擾計(jì)數(shù)。為進(jìn)展顯微鏡計(jì)數(shù)，可進(jìn)展染色，以便區(qū)分破碎和未破碎細(xì)胞。鏡計(jì)數(shù)，可進(jìn)展染色，以便區(qū)分破碎和未破碎細(xì)胞。例如破碎的格蘭氏陽性細(xì)菌會象陰性菌一樣染色；例如破碎的格蘭氏陽性細(xì)菌會象陰性菌一樣染色；如格蘭氏染色法時，未破碎酵母細(xì)胞顯紫色，而破如格蘭氏染色法時，未破碎酵母細(xì)胞顯紫色，而破碎細(xì)胞顯亮紅色。碎細(xì)胞顯亮紅色。 對于量大的樣品，顯微鏡計(jì)數(shù)

18、法耗時，枯燥；電子對于量大的樣品，顯微鏡計(jì)數(shù)法耗時，枯燥；電子粒子計(jì)數(shù)器雖可測定酵母細(xì)胞破碎率，但大的細(xì)胞粒子計(jì)數(shù)器雖可測定酵母細(xì)胞破碎率，但大的細(xì)胞破碎物能夠有干擾；用于細(xì)菌破碎率的測定時破碎物能夠有干擾；用于細(xì)菌破碎率的測定時,靈敏靈敏度較低。度較低。 2. 間接測定法間接測定法 根據(jù)破碎過程中破碎的細(xì)胞釋放的胞內(nèi)物質(zhì)量測算，根據(jù)破碎過程中破碎的細(xì)胞釋放的胞內(nèi)物質(zhì)量測算，如測定可溶性蛋白量或酶活性等，但需與破碎率到如測定可溶性蛋白量或酶活性等，但需與破碎率到達(dá)達(dá)100%的規(guī)范進(jìn)展比較。在運(yùn)用酶活性測定法時需的規(guī)范進(jìn)展比較。在運(yùn)用酶活性測定法時需留意，由于粗酶提取物的酶動力學(xué)與完好細(xì)胞或純留

19、意，由于粗酶提取物的酶動力學(xué)與完好細(xì)胞或純化的酶能夠有差別而產(chǎn)生誤差?；拿改軌蛴胁顒e而產(chǎn)生誤差。 當(dāng)運(yùn)用較濃的細(xì)胞懸浮液時，為獲得準(zhǔn)確結(jié)果，必當(dāng)運(yùn)用較濃的細(xì)胞懸浮液時，為獲得準(zhǔn)確結(jié)果，必需進(jìn)展校正。這是由于破碎細(xì)胞釋放胞內(nèi)物質(zhì)與水需進(jìn)展校正。這是由于破碎細(xì)胞釋放胞內(nèi)物質(zhì)與水混合時會使體積添加。另外，稀釋法并不適宜在破混合時會使體積添加。另外，稀釋法并不適宜在破碎過程中易失活的物質(zhì)測定。因此需運(yùn)用新的方法。碎過程中易失活的物質(zhì)測定。因此需運(yùn)用新的方法。 (1)稀釋法稀釋法 假設(shè)細(xì)胞破碎過程中失活不成為問題，可經(jīng)過測定破碎樣品(Cu)和稀釋樣品(Cd)的上清液中的可溶性蛋白來測定破碎率。運(yùn)用公式

20、可獲得破碎樣品的水相體積百分?jǐn)?shù)(Fd), Fd=(Vd/Vs)Cd/(Cu-Cd) Vd為加到體積為Vs的破碎樣品中的稀釋劑體積。運(yùn)用Folin-Lowry法或雙縮脲法測定蛋白質(zhì)，經(jīng)過下式可得破碎懸浮物中單位質(zhì)量的細(xì)胞所含的蛋白質(zhì)(Rp)， Rp=Fd(Cu/X) (2) X是以干物重為根底的細(xì)胞濃度。為計(jì)算細(xì)胞破碎率，必需測定相當(dāng)于破碎率為100%的Rp值。 (1)稀釋法稀釋法 普通來說，水相體積百分?jǐn)?shù)Fd與樣品的稀釋量無關(guān)。這也闡明蛋白質(zhì)的溶解度不受樣品的稀釋的影響。但實(shí)踐上，在多數(shù)條件下，稀釋會影響蛋白質(zhì)的溶解度，因此在采用稀釋法之前，要檢查稀釋對蛋白質(zhì)溶解度的影響。 (2)質(zhì)量平衡法質(zhì)

21、量平衡法 破碎樣品的水相體積分?jǐn)?shù)破碎樣品的水相體積分?jǐn)?shù)(F)與樣品破碎前與樣品破碎前的水相體積分的水相體積分(Fo)及完好細(xì)胞內(nèi)的含水量及完好細(xì)胞內(nèi)的含水量(質(zhì)量質(zhì)量分?jǐn)?shù)分?jǐn)?shù)M)的關(guān)系為：的關(guān)系為： F=Fo+(1-Fo)M R(Qc/Qaq) R為細(xì)胞破碎率，為細(xì)胞破碎率，Qc為細(xì)胞密度，而為細(xì)胞密度，而Qaq為水懸浮介質(zhì)的密度。在上式中假設(shè)細(xì)胞內(nèi)水為水懸浮介質(zhì)的密度。在上式中假設(shè)細(xì)胞內(nèi)水釋放會使水相體積分?jǐn)?shù)添加。利用凱氏定氮法釋放會使水相體積分?jǐn)?shù)添加。利用凱氏定氮法測定破碎樣品水相測定破碎樣品水相(Cn)和未破碎細(xì)胞和未破碎細(xì)胞(Cno)的氮的氮含量表示蛋白含量，它們與含量表示蛋白含量，它

22、們與F和和R的關(guān)系為：的關(guān)系為： R=FCn/CnoX (2)質(zhì)量平衡法質(zhì)量平衡法 將兩式合拚，刪去將兩式合拚，刪去F項(xiàng)，得項(xiàng)，得 R=Fo Cn/Cno X -(1-Fo)Cn M(Qc/Qaq) 當(dāng)細(xì)胞濃度當(dāng)細(xì)胞濃度(X)高時，用直接測定法測定細(xì)高時，用直接測定法測定細(xì)胞濃有困難，也可從樣品的物理性質(zhì)和固體質(zhì)胞濃有困難，也可從樣品的物理性質(zhì)和固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算得到。量分?jǐn)?shù)計(jì)算得到。 X=Qc Qaq W(1-M)/W(Qaq-Qc) + Qc(1-M) 運(yùn)用質(zhì)量平衡法計(jì)算細(xì)胞破碎率時運(yùn)用了幾個運(yùn)用質(zhì)量平衡法計(jì)算細(xì)胞破碎率時運(yùn)用了幾個假設(shè)，因此該方法的準(zhǔn)確度有時比稀釋法差。假設(shè)，因此該方法的準(zhǔn)

23、確度有時比稀釋法差。但是，當(dāng)稀釋影響蛋白的溶解度，不能運(yùn)用稀但是，當(dāng)稀釋影響蛋白的溶解度，不能運(yùn)用稀釋法時，可以運(yùn)用質(zhì)量平衡法測定細(xì)胞破碎率。釋法時，可以運(yùn)用質(zhì)量平衡法測定細(xì)胞破碎率。 (3)電導(dǎo)測定法電導(dǎo)測定法 電導(dǎo)測定法是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)釋放到水中會電導(dǎo)測定法是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)釋放到水中會改動溶液電導(dǎo)的原理開展的一種快速測定方法。改動溶液電導(dǎo)的原理開展的一種快速測定方法。細(xì)胞懸浮液電導(dǎo)的添加與細(xì)胞破碎率成正比。細(xì)胞懸浮液電導(dǎo)的添加與細(xì)胞破碎率成正比。 這種方法需求有其它方法作對比。由于電這種方法需求有其它方法作對比。由于電導(dǎo)與生物類型，保管條件，細(xì)胞濃度，溫度，導(dǎo)與生物類型，保管條件，細(xì)胞濃度，溫

24、度，懸浮介質(zhì)中的電解質(zhì)類型和含量等有關(guān)。因此，懸浮介質(zhì)中的電解質(zhì)類型和含量等有關(guān)。因此，在利用電導(dǎo)測定法測定細(xì)胞破碎率時，為了保在利用電導(dǎo)測定法測定細(xì)胞破碎率時，為了保證測定的準(zhǔn)確，除破碎率以外證測定的準(zhǔn)確，除破碎率以外, ,必需在堅(jiān)持的其必需在堅(jiān)持的其它一切條件恒定的情況下進(jìn)展。它一切條件恒定的情況下進(jìn)展。 依托細(xì)胞內(nèi)外浸透壓差忽然加大呵斥細(xì)胞壁破裂依托細(xì)胞內(nèi)外浸透壓差忽然加大呵斥細(xì)胞壁破裂, ,使胞內(nèi)物質(zhì)釋放到溶液中。使胞內(nèi)物質(zhì)釋放到溶液中。 將搜集到的細(xì)胞用適當(dāng)?shù)木彌_液或生理鹽水將搜集到的細(xì)胞用適當(dāng)?shù)木彌_液或生理鹽水洗滌，除去細(xì)胞沾染的培育基或其它雜質(zhì)，將其懸浮洗滌，除去細(xì)胞沾染的培育基

25、或其它雜質(zhì)，將其懸浮在含在含10-30%10-30%蔗糖的適當(dāng)緩沖液中，為了防止目的酶或蔗糖的適當(dāng)緩沖液中，為了防止目的酶或蛋白質(zhì)失活，假設(shè)目的酶或蛋白質(zhì)需求金屬離子時，蛋白質(zhì)失活，假設(shè)目的酶或蛋白質(zhì)需求金屬離子時，在緩沖液中參與金屬離子；假設(shè)金屬離子會使目的酶在緩沖液中參與金屬離子；假設(shè)金屬離子會使目的酶或蛋白質(zhì)失活，在緩沖液中需參與金屬離子螯合劑，或蛋白質(zhì)失活，在緩沖液中需參與金屬離子螯合劑，如如EDTAEDTA等。在低溫下，使細(xì)胞懸浮液混合均勻，放置等。在低溫下，使細(xì)胞懸浮液混合均勻，放置使細(xì)胞內(nèi)外浸透壓到達(dá)平衡。在低溫下離心，搜集細(xì)使細(xì)胞內(nèi)外浸透壓到達(dá)平衡。在低溫下離心，搜集細(xì)胞；在猛

26、烈的攪拌下將細(xì)胞快速加到較大體積的低濃胞；在猛烈的攪拌下將細(xì)胞快速加到較大體積的低濃度的緩沖液中，由于細(xì)胞外浸透壓忽然降低，使細(xì)胞度的緩沖液中，由于細(xì)胞外浸透壓忽然降低，使細(xì)胞破碎。破碎。 用此法處置大腸桿菌，可使磷酸酯酶、核糖核酸酶用此法處置大腸桿菌，可使磷酸酯酶、核糖核酸酶I以以及脫氧核糖核酸酶等釋放到溶液中。釋放的蛋白質(zhì)的及脫氧核糖核酸酶等釋放到溶液中。釋放的蛋白質(zhì)的量普通僅占細(xì)胞蛋白質(zhì)的量普通僅占細(xì)胞蛋白質(zhì)的4-7%。因此，后序的蛋白質(zhì)。因此，后序的蛋白質(zhì)分別純化比較簡單。此法對細(xì)胞壁外有著結(jié)實(shí)的糖蛋分別純化比較簡單。此法對細(xì)胞壁外有著結(jié)實(shí)的糖蛋白包裹層，使胞內(nèi)浸透壓不受嚴(yán)重影響的格蘭

27、氏陽性白包裹層，使胞內(nèi)浸透壓不受嚴(yán)重影響的格蘭氏陽性菌不適用。菌不適用。 在高浸透壓環(huán)境下生長的細(xì)菌在高浸透壓環(huán)境下生長的細(xì)菌, 如海洋細(xì)菌，嗜鹽細(xì)如海洋細(xì)菌，嗜鹽細(xì)菌，更適宜該法。如可有效的將海洋發(fā)光細(xì)菌的細(xì)菌菌，更適宜該法。如可有效的將海洋發(fā)光細(xì)菌的細(xì)菌熒光素酶釋放，酶釋放率可到達(dá)熒光素酶釋放，酶釋放率可到達(dá)80-90%。 超聲破碎器由高頻電發(fā)生器和產(chǎn)生高強(qiáng)度超聲信超聲破碎器由高頻電發(fā)生器和產(chǎn)生高強(qiáng)度超聲信號的電功率轉(zhuǎn)換器構(gòu)成，并把超聲波傳送到與其接觸號的電功率轉(zhuǎn)換器構(gòu)成，并把超聲波傳送到與其接觸的溶液中。普通在頻率的溶液中。普通在頻率15-25KHz下進(jìn)展操作，由聲波下進(jìn)展操作，由聲波的

28、沖擊和振蕩，在溶液中產(chǎn)生空化作用，空化泡的急的沖擊和振蕩，在溶液中產(chǎn)生空化作用，空化泡的急劇膨脹緊縮和內(nèi)向爆破產(chǎn)生沖擊彈性波，將聲能轉(zhuǎn)化劇膨脹緊縮和內(nèi)向爆破產(chǎn)生沖擊彈性波，將聲能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能，構(gòu)成粘性散失渦流，假設(shè)液體旋渦小于細(xì)為機(jī)械能，構(gòu)成粘性散失渦流，假設(shè)液體旋渦小于細(xì)胞尺寸，產(chǎn)生不同密度挪動，當(dāng)細(xì)胞的動能超越細(xì)胞胞尺寸，產(chǎn)生不同密度挪動，當(dāng)細(xì)胞的動能超越細(xì)胞壁強(qiáng)度時，至使細(xì)胞破碎。因此，細(xì)胞破碎率與輸入壁強(qiáng)度時，至使細(xì)胞破碎。因此，細(xì)胞破碎率與輸入功率大小，細(xì)胞大小，細(xì)胞壁強(qiáng)度，細(xì)胞外形和破碎功率大小，細(xì)胞大小，細(xì)胞壁強(qiáng)度，細(xì)胞外形和破碎時間有關(guān)。普通來說，超聲破碎對球狀或近球狀細(xì)胞時間

29、有關(guān)。普通來說，超聲破碎對球狀或近球狀細(xì)胞較有效，對絲狀菌破碎效果較差。在輸入功率為較有效，對絲狀菌破碎效果較差。在輸入功率為60-195W的條件下，細(xì)胞破碎時的蛋白釋放與細(xì)胞濃度的條件下，細(xì)胞破碎時的蛋白釋放與細(xì)胞濃度無關(guān)，最大細(xì)胞濃度可達(dá)無關(guān)，最大細(xì)胞濃度可達(dá)60 mg/ml。 在破碎輸入功率恒定條件下，對面包酵母破碎實(shí)驗(yàn)在破碎輸入功率恒定條件下，對面包酵母破碎實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)際分析得出以下關(guān)系式過程的實(shí)際分析得出以下關(guān)系式: 1-Rp=exp-(kt) 這里這里Rp為蛋白釋放率，為蛋白釋放率，k為蛋白釋放常數(shù)，為蛋白釋放常數(shù)，t為破碎為破碎時間時間(min)。在面包酵母濃度為。在面包酵母濃度

30、為20mg/ml，超聲波頻，超聲波頻率為率為20KHz，輸入功率，輸入功率190瓦的條件下，蛋白釋放常瓦的條件下，蛋白釋放常數(shù)數(shù)k與輸入功率有如下關(guān)系與輸入功率有如下關(guān)系: k=b(p-po)/0.9 其中其中b為常數(shù)，為常數(shù)，p是輸入功率是輸入功率(J/kg.s)，po是空化作用是空化作用的最低界限輸入功率。的最低界限輸入功率。 最大問題是在超聲過程中聲波被溶液吸收最大問題是在超聲過程中聲波被溶液吸收產(chǎn)生大量熱量，不能及時將熱量移出，細(xì)胞產(chǎn)生大量熱量，不能及時將熱量移出，細(xì)胞懸浮液的溫度急劇升高，導(dǎo)致酶和其它生物懸浮液的溫度急劇升高，導(dǎo)致酶和其它生物活性物量變性失活。因此，在實(shí)驗(yàn)室中往往活性

31、物量變性失活。因此，在實(shí)驗(yàn)室中往往采取延續(xù)破碎的方法，即經(jīng)短時間破碎，冷采取延續(xù)破碎的方法，即經(jīng)短時間破碎，冷卻降溫，再進(jìn)展破碎，經(jīng)多次反復(fù)到達(dá)破碎卻降溫，再進(jìn)展破碎，經(jīng)多次反復(fù)到達(dá)破碎目的。目的。 因此在細(xì)胞破碎過程中，有效冷卻是關(guān)鍵。因此在細(xì)胞破碎過程中，有效冷卻是關(guān)鍵。 也因大容量容器的聲波傳送和散熱困難，也因大容量容器的聲波傳送和散熱困難，限制了超聲破碎的大規(guī)模運(yùn)用。限制了超聲破碎的大規(guī)模運(yùn)用。 超聲破碎在實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用比較普遍，處置量超聲破碎在實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用比較普遍，處置量小時比較方便。小時比較方便。 超聲波作用產(chǎn)生游離基，超聲波作用產(chǎn)生游離基， 超聲波會呵斥超聲波會呵斥蛋白質(zhì)構(gòu)造變化均會使

32、之失活。蛋白質(zhì)構(gòu)造變化均會使之失活。 超聲破碎法細(xì)胞較為徹底，細(xì)胞內(nèi)含物全超聲破碎法細(xì)胞較為徹底，細(xì)胞內(nèi)含物全部釋放，破碎細(xì)胞懸浮液粘稠，利用簡單的部釋放，破碎細(xì)胞懸浮液粘稠，利用簡單的過濾法難于回收含有目的產(chǎn)物的上清液，只過濾法難于回收含有目的產(chǎn)物的上清液，只需經(jīng)過長時間離心回收上清液，使后序工藝需經(jīng)過長時間離心回收上清液，使后序工藝復(fù)雜。復(fù)雜。 超聲噪音污染環(huán)境，影響人們安康，應(yīng)對超聲噪音污染環(huán)境，影響人們安康，應(yīng)對操作人員加以維護(hù)。操作人員加以維護(hù)。 在超聲破碎細(xì)胞時，正確的方法是探頭的下外表在超聲破碎細(xì)胞時，正確的方法是探頭的下外表處于菌懸液外表下處于菌懸液外表下0.3-1.0 cm處

33、最好，深淺以不會使處最好，深淺以不會使菌懸液產(chǎn)生大量泡沫為準(zhǔn)。菌懸液產(chǎn)生大量泡沫為準(zhǔn)。 超聲破碎細(xì)胞的破碎率普通可到達(dá)超聲破碎細(xì)胞的破碎率普通可到達(dá)80-90%，如，如要進(jìn)一步提高破碎率，需添加更多的破碎時間。因后要進(jìn)一步提高破碎率，需添加更多的破碎時間。因后期破碎率提高并不明顯，且添加時間和能耗，更重要期破碎率提高并不明顯，且添加時間和能耗，更重要的是目的產(chǎn)物會因失活而使產(chǎn)物收率反而下降。從回的是目的產(chǎn)物會因失活而使產(chǎn)物收率反而下降。從回收目的產(chǎn)物的角度看是不經(jīng)濟(jì)的。因此有必要經(jīng)過破收目的產(chǎn)物的角度看是不經(jīng)濟(jì)的。因此有必要經(jīng)過破碎時間與破碎率和生物活性產(chǎn)物收率關(guān)系曲線確定最碎時間與破碎率和生

34、物活性產(chǎn)物收率關(guān)系曲線確定最正確破碎時間。正確破碎時間。大規(guī)模延續(xù)破碎細(xì)胞的超聲破碎系統(tǒng)表示圖大規(guī)模延續(xù)破碎細(xì)胞的超聲破碎系統(tǒng)表示圖 A 超聲波轉(zhuǎn)換器，超聲波轉(zhuǎn)換器，B 細(xì)胞破碎腔，細(xì)胞破碎腔，C 細(xì)胞懸浮液儲存細(xì)胞懸浮液儲存器，器，D 冷凍系統(tǒng)，冷凍系統(tǒng)，E 高頻電發(fā)生器高頻電發(fā)生器 關(guān)鍵是破碎腔的設(shè)計(jì)。關(guān)鍵是破碎腔的設(shè)計(jì)。腔的大小及深度要可以被超腔的大小及深度要可以被超聲波覆蓋，且料液無流動死聲波覆蓋，且料液無流動死角。操作要求嚴(yán)厲控制細(xì)胞角。操作要求嚴(yán)厲控制細(xì)胞懸浮液和冷凍液的流速，以懸浮液和冷凍液的流速，以保證破碎流出物料的溫度不保證破碎流出物料的溫度不超越控制程度。采用批式多超越控制

35、程度。采用批式多次單循環(huán)或延續(xù)混合循環(huán)方次單循環(huán)或延續(xù)混合循環(huán)方式均可到達(dá)破碎細(xì)胞的目的。式均可到達(dá)破碎細(xì)胞的目的。 高壓釋放勻漿法是一種有效的大規(guī)模破碎細(xì)胞高壓釋放勻漿法是一種有效的大規(guī)模破碎細(xì)胞技術(shù)。有各種類型的工業(yè)產(chǎn)品可供選擇，主要由高技術(shù)。有各種類型的工業(yè)產(chǎn)品可供選擇，主要由高壓泵和釋放閥兩部分組成。高壓泵普通是一級或二壓泵和釋放閥兩部分組成。高壓泵普通是一級或二級的正向柱塞泵，細(xì)胞懸浮液在級的正向柱塞泵，細(xì)胞懸浮液在40-350 Mpa的高壓的高壓下經(jīng)過閥座中心孔高速噴出，因針狀調(diào)理閥的阻撓下經(jīng)過閥座中心孔高速噴出，因針狀調(diào)理閥的阻撓而改動方向，放射在碰撞環(huán)上，細(xì)胞在高速放射，而改動

36、方向，放射在碰撞環(huán)上，細(xì)胞在高速放射，湍流碰撞和急劇降壓中，由于各種剪切力的作用致湍流碰撞和急劇降壓中，由于各種剪切力的作用致使細(xì)胞破碎。使細(xì)胞破碎。 高壓釋放閥表示圖高壓釋放閥表示圖A.控制卸壓的手柄控制卸壓的手柄, B.控制桿控制桿, C.針閥針閥, D.閥座閥座, E.碰撞環(huán)碰撞環(huán) 釋放閥的構(gòu)造，特別是閥座的外形對細(xì)胞破碎釋放閥的構(gòu)造，特別是閥座的外形對細(xì)胞破碎率有明顯影響。在一樣的操作壓力下破碎啤酒母細(xì)率有明顯影響。在一樣的操作壓力下破碎啤酒母細(xì)胞時，刃式構(gòu)造要比平式構(gòu)造的破碎率高胞時，刃式構(gòu)造要比平式構(gòu)造的破碎率高20-25%。.兩種閥座構(gòu)造的表示圖兩種閥座構(gòu)造的表示圖 a.平式構(gòu)造

37、平式構(gòu)造, b.刃式構(gòu)造刃式構(gòu)造 高壓釋放破碎細(xì)胞機(jī)理的研討闡明，致使細(xì)胞破高壓釋放破碎細(xì)胞機(jī)理的研討闡明，致使細(xì)胞破碎的緣由比較復(fù)雜。對產(chǎn)元假絲酵母和啤酒酵母細(xì)胞碎的緣由比較復(fù)雜。對產(chǎn)元假絲酵母和啤酒酵母細(xì)胞破碎機(jī)理的研討發(fā)現(xiàn)由于高速流動呵斥的碰撞是細(xì)胞破碎機(jī)理的研討發(fā)現(xiàn)由于高速流動呵斥的碰撞是細(xì)胞破碎的主要緣由，而普通的應(yīng)力切變呵斥的細(xì)胞破碎破碎的主要緣由，而普通的應(yīng)力切變呵斥的細(xì)胞破碎約只占總破碎力的約只占總破碎力的20%，其它的作用力較難估計(jì)。，其它的作用力較難估計(jì)。 碰撞和普通應(yīng)力對細(xì)胞破碎的碰撞和普通應(yīng)力對細(xì)胞破碎的影響影響碰撞碰撞, 普通應(yīng)力普通應(yīng)力 一切微生物細(xì)胞只需施加的壓力

38、到達(dá)某一程度時一切微生物細(xì)胞只需施加的壓力到達(dá)某一程度時才開場破碎，繼之細(xì)胞破碎率隨著壓力的添加而迅速才開場破碎，繼之細(xì)胞破碎率隨著壓力的添加而迅速添加。破碎為一級動力學(xué)過程：添加。破碎為一級動力學(xué)過程： ln1/(1-R)=kNPa N為經(jīng)過勻漿器閥門的次數(shù)，為經(jīng)過勻漿器閥門的次數(shù)，P為操作壓力，為操作壓力，k為與溫為與溫度有關(guān)的速度常數(shù)，度有關(guān)的速度常數(shù)，a為功率值，它與細(xì)胞破碎時需為功率值，它與細(xì)胞破碎時需求抑制的壓力范圍有關(guān)。求抑制的壓力范圍有關(guān)。 利用高壓勻漿器破碎面包酵母的破碎曲線 溫度為30, 溫度為5 破碎過程中，在很寬的范圍內(nèi)破碎與細(xì)破碎過程中，在很寬的范圍內(nèi)破碎與細(xì)胞濃度胞

39、濃度(29-224 g/L(29-224 g/L的干細(xì)胞的干細(xì)胞) )無關(guān)。面包酵無關(guān)。面包酵母破碎時，不同酶的釋放速度不同，集積在母破碎時，不同酶的釋放速度不同，集積在細(xì)胞壁和胞間質(zhì)的酶的釋放要比可溶性蛋白細(xì)胞壁和胞間質(zhì)的酶的釋放要比可溶性蛋白質(zhì)快些，而在線粒體上的酶的釋放與可溶性質(zhì)快些，而在線粒體上的酶的釋放與可溶性蛋白質(zhì)具有一樣的速度，在亞細(xì)胞顆粒上的蛋白質(zhì)具有一樣的速度，在亞細(xì)胞顆粒上的酶的釋放速度要慢些。酶的釋放速度要慢些。 蛋白與酶釋放的相互關(guān)系 A.酸性磷酸酯酶, B.蔗糖酶, C.葡萄糖-5-磷酸, D.醇脫氫酶, E.堿性磷酸酯酶, F.富馬酸酶. 酵母細(xì)胞在酵母細(xì)胞在30破

40、碎的破碎率大約比破碎的破碎率大約比5的破碎率高的破碎率高1.5倍。因此倍。因此,在不影響酶活力回收在不影響酶活力回收的前題下，適當(dāng)提高破碎溫度對破碎是有利的前題下，適當(dāng)提高破碎溫度對破碎是有利的。的。 高壓耗費(fèi)的能量大部分轉(zhuǎn)化為熱量。在高壓耗費(fèi)的能量大部分轉(zhuǎn)化為熱量。在200 MPa下緊縮下緊縮1 ml菌懸液釋放熱量菌懸液釋放熱量47卡，可卡，可提高溫度提高溫度47。因此，在實(shí)踐操作時，為防。因此，在實(shí)踐操作時，為防止溫度過高，需求冷卻控制破碎操作溫度。止溫度過高，需求冷卻控制破碎操作溫度。 不同微生物細(xì)胞因其形狀，大小，細(xì)胞壁構(gòu)不同微生物細(xì)胞因其形狀，大小，細(xì)胞壁構(gòu)造不同，在破碎時需求的壓力

41、不同。下表列造不同，在破碎時需求的壓力不同。下表列出了不同微生物細(xì)胞到達(dá)出了不同微生物細(xì)胞到達(dá)50%破碎率所需求破碎率所需求的壓力。的壓力。 微生物微生物格蘭氏菌格蘭氏菌大小大小(m)破碎破碎50%所需壓力所需壓力(Pa)大腸桿菌陰性 2-40.5 1.5107枯草芽孢桿菌 陽性 1.5-30.5-0.82.4107干酪乳桿菌陽性 40.4-0.7 3.1107糞鏈球菌陽性 1.021.5108金黃葡萄球菌陽性 1.01.9108釀酒酵母陽性 7-125-81.5108破碎不同微生物細(xì)胞需求的壓力破碎不同微生物細(xì)胞需求的壓力 細(xì)胞破碎率與培育條件和生長期有關(guān)。生長在合成培育基上的大腸桿菌要比生

42、長在復(fù)雜培育基上的易破碎；對數(shù)生長期中期收獲的細(xì)胞要比對數(shù)生長期后期收獲的細(xì)胞易破碎。細(xì)胞類型和培育條件對破碎的影響細(xì)胞類型和培育條件對破碎的影響 1.批式培育的產(chǎn)元假絲酵母批式培育的產(chǎn)元假絲酵母 2.延延續(xù)培育的產(chǎn)元假絲酵母續(xù)培育的產(chǎn)元假絲酵母 3.好氣培好氣培育的啤酒酵母育的啤酒酵母4.厭氣培育的面包酵厭氣培育的面包酵母母 5.延續(xù)培育的枯草芽孢桿菌延續(xù)培育的枯草芽孢桿菌 高壓釋放破碎細(xì)胞雖然也存在細(xì)胞破碎釋放原生高壓釋放破碎細(xì)胞雖然也存在細(xì)胞破碎釋放原生質(zhì)物質(zhì)使破碎物粘度不斷添加，改動流變學(xué)性質(zhì)的問質(zhì)物質(zhì)使破碎物粘度不斷添加，改動流變學(xué)性質(zhì)的問題，但因不會發(fā)生細(xì)胞壁降解而構(gòu)成更小的碎片和

43、釋題，但因不會發(fā)生細(xì)胞壁降解而構(gòu)成更小的碎片和釋放細(xì)胞壁糖原，防止了破碎物粘度的進(jìn)一步添加，因放細(xì)胞壁糖原，防止了破碎物粘度的進(jìn)一步添加，因此對后序工藝的影響較小。此對后序工藝的影響較小。 細(xì)胞破碎率與細(xì)胞懸浮液經(jīng)過勻漿器的次數(shù)成正比，細(xì)胞破碎率與細(xì)胞懸浮液經(jīng)過勻漿器的次數(shù)成正比，因每次破碎率有限，在實(shí)踐操作中可以采用批式循環(huán)因每次破碎率有限，在實(shí)踐操作中可以采用批式循環(huán)或混合循環(huán)方式。為控制破碎溫度，需在細(xì)胞懸浮液或混合循環(huán)方式。為控制破碎溫度，需在細(xì)胞懸浮液儲罐進(jìn)展冷卻降溫。儲罐進(jìn)展冷卻降溫。 在細(xì)胞懸浮液中參與細(xì)玻璃珠，或冷凍細(xì)胞懸浮液在細(xì)胞懸浮液中參與細(xì)玻璃珠，或冷凍細(xì)胞懸浮液構(gòu)成適當(dāng)

44、量的冰晶，可提高細(xì)胞破碎率。構(gòu)成適當(dāng)量的冰晶，可提高細(xì)胞破碎率。 冷凍的細(xì)胞懸浮液在低溫低壓力下不能流動，但提高壓力時，水的結(jié)晶構(gòu)造會發(fā)生相變，隨著壓力的增高，水的結(jié)晶內(nèi)聚性降低，從不能流動的固相變成可流動的液相；在高壓下發(fā)生流動放射，使細(xì)胞破碎。 壓力與溫度對水的相圖的影響壓力與溫度對水的相圖的影響 冷壓釋放破碎器構(gòu)造表示圖冷壓釋放破碎器構(gòu)造表示圖 1.活塞，活塞，2.尼龍殼，尼龍殼，3.園桶環(huán)，園桶環(huán)， 4.柱塞，柱塞，5.緊縮腔內(nèi)的細(xì)胞懸緊縮腔內(nèi)的細(xì)胞懸浮液，浮液，6.O-型環(huán)，型環(huán)，7.園盤，園盤，8.園盤支架，園盤支架，9.固定固定栓，栓，10.空氣閥，空氣閥，11.螺旋彈簧，螺旋彈

45、簧，12.網(wǎng)網(wǎng). 破碎細(xì)胞操作中，物料從小孔放射由壓力控制。破碎細(xì)胞操作中，物料從小孔放射由壓力控制。只需壓力高于相變臨界壓力時，細(xì)胞懸浮液從固相只需壓力高于相變臨界壓力時，細(xì)胞懸浮液從固相轉(zhuǎn)變?yōu)橐合?，發(fā)生放射。而放射的結(jié)果是壓力急劇轉(zhuǎn)變?yōu)橐合?，發(fā)生放射。而放射的結(jié)果是壓力急劇降低，低于相變臨界壓力，細(xì)胞懸浮液成為固相，降低，低于相變臨界壓力，細(xì)胞懸浮液成為固相，放射停頓，壓力再度升高超越相變臨界壓力，再次放射停頓，壓力再度升高超越相變臨界壓力，再次放射，周而復(fù)始，完成細(xì)胞破碎。放射，周而復(fù)始，完成細(xì)胞破碎。 在園盤小孔上安裝調(diào)理控制壓力閥，使破碎在更高壓力下進(jìn)展。如將細(xì)胞懸浮液冷凍到-20，

46、施以200Mpa壓力，可將釀酒酵母細(xì)胞一次破碎率到達(dá)90%。 由于在低溫下操作，對于熱敏感的生物活性物質(zhì)由于在低溫下操作，對于熱敏感的生物活性物質(zhì)有利，破碎的活性收率要比其他破碎方法高。有利，破碎的活性收率要比其他破碎方法高。 利用該破碎技術(shù)破碎格蘭氏陽性球菌和桿菌，分利用該破碎技術(shù)破碎格蘭氏陽性球菌和桿菌，分枝桿菌，放線菌，酵母和真菌提取酶均獲得很好結(jié)果，枝桿菌，放線菌，酵母和真菌提取酶均獲得很好結(jié)果，闡明微生物種類，細(xì)胞構(gòu)造和外形對破碎影響較小。闡明微生物種類，細(xì)胞構(gòu)造和外形對破碎影響較小。 該技術(shù)用于破碎原生動物，花粉，甚至動物細(xì)胞，該技術(shù)用于破碎原生動物，花粉，甚至動物細(xì)胞，也均獲得理

47、想結(jié)果。破碎兔皮提取透明質(zhì)酸，不僅可也均獲得理想結(jié)果。破碎兔皮提取透明質(zhì)酸，不僅可防止與粗構(gòu)造結(jié)合，還可減少產(chǎn)物降解。將粗的動物防止與粗構(gòu)造結(jié)合，還可減少產(chǎn)物降解。將粗的動物組織，如皮和健切成幾毫米的小塊，與等量的水混合組織，如皮和健切成幾毫米的小塊，與等量的水混合冷凍也可破碎。像軟組織，如肝，腎等也可直接進(jìn)展冷凍也可破碎。像軟組織，如肝，腎等也可直接進(jìn)展冷凍緊縮釋放破碎。因此與其它破碎技術(shù)相比，其適冷凍緊縮釋放破碎。因此與其它破碎技術(shù)相比，其適用范圍更寬。用范圍更寬。 酵母細(xì)胞懸浮液在酵母細(xì)胞懸浮液在-25破碎過程：活塞以破碎過程：活塞以0.95 cm/秒的速度向前推進(jìn)，秒的速度向前推進(jìn)，1

48、415秒后，壓力到達(dá)秒后，壓力到達(dá)200 Mpa以上，細(xì)胞懸浮物液化在壓力下經(jīng)過釋放孔，高以上，細(xì)胞懸浮物液化在壓力下經(jīng)過釋放孔，高速放射，發(fā)出速放射，發(fā)出嘭嘭的一聲，壓力降到幾乎為零，測定的一聲，壓力降到幾乎為零，測定的物料放射速度高于的物料放射速度高于200m/秒，秒，0.15秒后，壓力上升接秒后，壓力上升接近原來的近原來的200 Mpa，再次反復(fù)這一過程。因此，脈動，再次反復(fù)這一過程。因此，脈動的時間間隔為的時間間隔為0.15秒，這段時間大部分是用于提高壓秒，這段時間大部分是用于提高壓力。整個破碎過程為不延續(xù)脈沖釋放過程。力。整個破碎過程為不延續(xù)脈沖釋放過程。酵母細(xì)胞破碎過程的壓力變化情

49、況酵母細(xì)胞破碎過程的壓力變化情況 將釀酒酵母懸浮參與不同濃度的氯化鉀，氯化鈉和氯化鈣，分別在-15、-25、-35下進(jìn)展緊縮破碎，發(fā)如今鹽存在下，于-25和-35時破碎率較高；鹽的作用主要是改動相變的共熔點(diǎn)，降低釋放的臨界壓力(Po)。氯化鈣和氯化鈉比氯化鉀的作用明顯，在破碎中的影響也較大。 在-25下，運(yùn)用不同濃度的酵母細(xì)胞進(jìn)展破碎，發(fā)現(xiàn)破碎率隨細(xì)胞濃度的添加而添加，至少細(xì)胞濃度可到達(dá)270mg/ml(干重)。高濃度的酵母細(xì)胞使懸浮液粘度添加，較低的相轉(zhuǎn)移速度和平滑的流動會產(chǎn)生較高的破碎。同時會延伸脈沖的間隔時間。 為了大量破碎微生物細(xì)胞和其它生物資料，建立為了大量破碎微生物細(xì)胞和其它生物資

50、料，建立了半延續(xù)的操作方式。首先將細(xì)胞懸浮液在冷凍箱內(nèi)了半延續(xù)的操作方式。首先將細(xì)胞懸浮液在冷凍箱內(nèi)冷凍制成圓柱狀，其大小要適宜加壓圓筒。將預(yù)先冷冷凍制成圓柱狀，其大小要適宜加壓圓筒。將預(yù)先冷凍成形的物料放入破碎器，利用水泵加壓驅(qū)動活塞，凍成形的物料放入破碎器，利用水泵加壓驅(qū)動活塞，使之經(jīng)過小孔進(jìn)展破碎。普通樣品溫度為使之經(jīng)過小孔進(jìn)展破碎。普通樣品溫度為-35，加壓，加壓破碎溫度為破碎溫度為-20，面包酵母以平滑流動方式經(jīng)過小孔，面包酵母以平滑流動方式經(jīng)過小孔，一次破碎的破碎率可到達(dá)一次破碎的破碎率可到達(dá)90%。每小時可處置。每小時可處置20Kg資資料，效果可到達(dá)料，效果可到達(dá)20%，能量耗費(fèi)

51、為，能量耗費(fèi)為1 KW h/Kg。假設(shè)。假設(shè)再添加處置量也是能夠的。再添加處置量也是能夠的。 球磨破碎細(xì)胞的破碎率可高達(dá)球磨破碎細(xì)胞的破碎率可高達(dá)95%，用于提取，用于提取細(xì)胞壁，線粒體，核酸，蛋白以及其它細(xì)胞器的收細(xì)胞壁，線粒體，核酸，蛋白以及其它細(xì)胞器的收率也高。用率也高。用Dyno mill破碎酵母細(xì)胞提取線粒體的收破碎酵母細(xì)胞提取線粒體的收率要比其它機(jī)械破碎法要高率要比其它機(jī)械破碎法要高5-8倍。球磨破碎細(xì)胞運(yùn)倍。球磨破碎細(xì)胞運(yùn)用范圍廣，從實(shí)驗(yàn)室到大規(guī)模消費(fèi)均可運(yùn)用，并可用范圍廣，從實(shí)驗(yàn)室到大規(guī)模消費(fèi)均可運(yùn)用，并可控制系統(tǒng)及破碎工藝過程的溫度；操作系統(tǒng)密閉，控制系統(tǒng)及破碎工藝過程的溫度

52、；操作系統(tǒng)密閉，可對系統(tǒng)進(jìn)展滅菌，防止污染。因此，該技術(shù)和設(shè)可對系統(tǒng)進(jìn)展滅菌，防止污染。因此，該技術(shù)和設(shè)備的開展和運(yùn)用遭到廣泛關(guān)注。備的開展和運(yùn)用遭到廣泛關(guān)注。設(shè)備及原理設(shè)備及原理 國際上不同消費(fèi)廠家分別消費(fèi)多種球磨破碎細(xì)胞國際上不同消費(fèi)廠家分別消費(fèi)多種球磨破碎細(xì)胞的設(shè)備，從實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用的小型細(xì)胞球磨機(jī)到大規(guī)模消的設(shè)備，從實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用的小型細(xì)胞球磨機(jī)到大規(guī)模消費(fèi)運(yùn)用的每小時可破碎費(fèi)運(yùn)用的每小時可破碎 100 100公斤細(xì)胞的大型細(xì)胞破碎公斤細(xì)胞的大型細(xì)胞破碎機(jī)，多各種類型和規(guī)格。但根本原理和機(jī)械構(gòu)造大同機(jī)，多各種類型和規(guī)格。但根本原理和機(jī)械構(gòu)造大同小異。這里主要引見瑞典的小異。這里主要引見瑞典的D

53、yno-mill Dyno-mill 機(jī)。機(jī)。 設(shè)備及原理設(shè)備及原理Dyno-mill 細(xì)胞破碎機(jī)構(gòu)造表示圖細(xì)胞破碎機(jī)構(gòu)造表示圖 1為整體構(gòu)造圖，為整體構(gòu)造圖， 2為破碎為破碎室構(gòu)造圖，室構(gòu)造圖， A 破碎室夾套，破碎室夾套， B 攪拌葉，攪拌葉， C 攪拌軸，攪拌軸， D 微微孔分別器孔分別器, E 物料進(jìn)口物料進(jìn)口, F 溫度測試孔溫度測試孔, G 冷卻液進(jìn)口冷卻液進(jìn)口, H 攪拌軸攪拌軸 設(shè)備及原理設(shè)備及原理 球磨容器球磨容器 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的容積為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的容積為0.15、0.3和和0.6升，工升，工業(yè)規(guī)模的為業(yè)規(guī)模的為1.4升到升到15升，最大的可達(dá)升，最大的可達(dá)265升，升，為帶有冷

54、卻夾套的圓桶容器，小型的實(shí)驗(yàn)室運(yùn)為帶有冷卻夾套的圓桶容器，小型的實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用的是無鉛玻璃制造，而大型的是不銹鋼制造。用的是無鉛玻璃制造，而大型的是不銹鋼制造。有通向容器內(nèi)部的菌懸液進(jìn)料口和球磨劑裝料有通向容器內(nèi)部的菌懸液進(jìn)料口和球磨劑裝料口。依托夾具將其固定，很容易改換。口。依托夾具將其固定，很容易改換。 驅(qū)動馬達(dá)驅(qū)動馬達(dá) 為三相為三相380 V，1.85 KW，2900 rpm的電動的電動馬達(dá)。其自動輪經(jīng)過一個特殊的馬達(dá)。其自動輪經(jīng)過一個特殊的V型皮帶與攪型皮帶與攪動軸上的被動輪連結(jié)，利用安裝在操作馬達(dá)開動軸上的被動輪連結(jié)，利用安裝在操作馬達(dá)開關(guān)板上的手柄，控制皮帶在自動輪和被動輪上關(guān)板上的手

55、柄，控制皮帶在自動輪和被動輪上的位置，改動攪動速度。分別到達(dá)的位置，改動攪動速度。分別到達(dá)2000，3000，4500和和6000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/秒，這時的攪拌葉的線速度分秒，這時的攪拌葉的線速度分別為別為6.7，10，15和和20米米/秒。秒。設(shè)備及原理設(shè)備及原理 電動馬達(dá)的控制電動馬達(dá)的控制 控制馬達(dá)的開關(guān)有兩個按鈕，開和關(guān)，安培控制馬達(dá)的開關(guān)有兩個按鈕，開和關(guān)，安培表，信號燈，在防護(hù)罩上有磁性開關(guān)，一當(dāng)防表，信號燈，在防護(hù)罩上有磁性開關(guān)，一當(dāng)防護(hù)罩翻開，或在操作時未關(guān)上，電動馬達(dá)不能護(hù)罩翻開，或在操作時未關(guān)上，電動馬達(dá)不能啟動。啟動。 攪拌葉攪拌葉 由聚氨酯或不銹鋼制造的直徑為由聚氨酯或不銹鋼制造

56、的直徑為64毫米的圓毫米的圓盤，它們是用墊片和分別子按一定間隔間隔將盤，它們是用墊片和分別子按一定間隔間隔將其固定在攪動軸上。其固定在攪動軸上。 A B 攪拌葉攪拌葉輪構(gòu)造表示圖輪構(gòu)造表示圖 A 聚氨聚氨酯葉輪酯葉輪 B 不銹不銹鋼葉輪鋼葉輪設(shè)備及原理設(shè)備及原理 分別器分別器 為一種高效狹縫分別器，它的作用是將研磨為一種高效狹縫分別器，它的作用是將研磨劑保管在研磨容器內(nèi)，而使破碎的細(xì)胞懸浮液劑保管在研磨容器內(nèi)，而使破碎的細(xì)胞懸浮液流出。狹縫的寬度是利用不同厚度的規(guī)范隔片流出。狹縫的寬度是利用不同厚度的規(guī)范隔片控制，分別為控制，分別為0.02，0.05，0.1，0.2和和0.3 mm。狹縫大小的

57、選擇取決于運(yùn)用的研磨劑的粒度，狹縫大小的選擇取決于運(yùn)用的研磨劑的粒度，普通為研磨劑直徑的三分之一。普通為研磨劑直徑的三分之一。 球磨劑球磨劑 球磨劑為無鉛玻璃制造的玻璃珠，直徑范圍球磨劑為無鉛玻璃制造的玻璃珠，直徑范圍最小的為最小的為0.1mm，最大的為，最大的為1.5mm，可根據(jù)破，可根據(jù)破碎的細(xì)胞種類進(jìn)展選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡明在球磨碎的細(xì)胞種類進(jìn)展選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡明在球磨容器內(nèi)的球磨劑裝量為研磨容器的容積的容器內(nèi)的球磨劑裝量為研磨容器的容積的80-85%為宜。為宜。 設(shè)備及原理設(shè)備及原理 給料泵給料泵 為了延續(xù)破碎，可運(yùn)用能調(diào)速的普通蠕動泵，為了延續(xù)破碎，可運(yùn)用能調(diào)速的普通蠕動泵，將細(xì)胞懸浮液

58、延續(xù)輸?shù)狡扑槠鲀?nèi)，其供料速度將細(xì)胞懸浮液延續(xù)輸?shù)狡扑槠鲀?nèi)，其供料速度可由需求的破碎率來控制?？捎尚枨蟮钠扑槁蕘砜刂啤?冷凍設(shè)備冷凍設(shè)備 由于在細(xì)胞破碎過程中高速攪拌，研磨劑與由于在細(xì)胞破碎過程中高速攪拌，研磨劑與研磨劑，研磨劑與細(xì)胞之間的磨擦?xí)a(chǎn)生大量研磨劑，研磨劑與細(xì)胞之間的磨擦?xí)a(chǎn)生大量熱量，破碎過程溫度不斷升高，為防止生物活熱量，破碎過程溫度不斷升高，為防止生物活性物質(zhì)失活，對破碎系統(tǒng)進(jìn)展冷卻是非常必需性物質(zhì)失活，對破碎系統(tǒng)進(jìn)展冷卻是非常必需的。對于的。對于Dtno-mill KDL可配用可配用DMK 15/F型的型的循環(huán)流動式制冷機(jī)，對球磨容器和細(xì)胞懸浮液循環(huán)流動式制冷機(jī)，對球磨容器和

59、細(xì)胞懸浮液儲存器進(jìn)展冷卻。儲存器進(jìn)展冷卻。 冷凍液可采用聚乙二醇冷凍液可采用聚乙二醇/水溶液水溶液1/1。設(shè)備及原理設(shè)備及原理 破碎效能破碎效能 當(dāng)運(yùn)用當(dāng)運(yùn)用0.3 L的研磨容器時，采用延續(xù)破碎，的研磨容器時，采用延續(xù)破碎，最大的細(xì)胞懸浮液輸入量可達(dá)最大的細(xì)胞懸浮液輸入量可達(dá)15L/h，而實(shí)踐，而實(shí)踐的輸入量要取決于破碎率。的輸入量要取決于破碎率。0.3和和0.15 L的破碎的破碎容器也可進(jìn)展批式破碎，主要適用于低粘度的容器也可進(jìn)展批式破碎，主要適用于低粘度的懸浮液，如微生物資料，其一次裝量分別為懸浮液，如微生物資料，其一次裝量分別為160-170和和80-85 ml。而不銹鋼破碎球磨容器主。

60、而不銹鋼破碎球磨容器主要用于高速破碎和粘度高的懸浮液的破碎。要用于高速破碎和粘度高的懸浮液的破碎。 在高速細(xì)胞破碎球磨機(jī)內(nèi)，高速旋轉(zhuǎn)攪拌葉攪動細(xì)胞懸浮液和球磨劑-玻璃珠，由于切力層間的碰撞及球磨劑的旋輾而使細(xì)胞破碎。因此，細(xì)胞破碎的過程實(shí)為一級反響動力學(xué)過程。假設(shè)以細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放來衡量破碎程度，蛋白質(zhì)釋放速度直接與未釋放的蛋白質(zhì)量成正比。 log e Rm/(Rma - R) = log e D = kt R為某一時間測定的細(xì)胞破碎釋放的蛋白質(zhì)量，Rm 為總蛋白質(zhì)釋放量，k 為一級反響動力學(xué)常數(shù)。將上式對時間 t 積分 D = Rm/Rma-R，即為未釋放蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)的倒數(shù)。 假設(shè)按細(xì)胞