基因工程步驟PPT學習教案

1、會計學1基因工程步驟基因工程步驟啟動子啟動子終止子終止子第1頁/共38頁非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶聚合酶結合位點結合位點外顯子外顯子內含子內含子1 12 23 34 45 5轉轉 錄錄mRNAmRNA前體前體成熟成熟mRNAmRNA加加 工工切除內含子轉錄部分切除內含子轉錄部分第2頁/共38頁非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點啟動子啟動子終止子終止子能轉錄相應的信使能轉錄相應的信使RNARNA，能編碼蛋白質，能編碼蛋白質第3頁/共38頁基因工程的基本操作程序

2、基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定第4頁/共38頁 用用3 3分鐘閱讀分鐘閱讀P8-11P8-11，并思考下列問題，然后用，并思考下列問題，然后用2 2分鐘與同桌交流、討論。分鐘與同桌交流、討論。1 1、獲取目的基因的常用方法有哪些、獲取目的基因的常用方法有哪些? ?2 2、何謂基因文庫？其類型有哪幾種？、何謂基因文庫？其類型有哪幾種？3 3、如何構建基因文庫？、如何構建基因文庫？4 4、何謂、何謂PCRPCR技術？其原理、條件和過程是怎樣的？技術？其原理、條件和過程是怎樣的？第5頁/共38頁第6頁/共38頁第7頁/共38頁第8頁/

3、共38頁3 3）載體與基因組）載體與基因組DNADNA片段的連接片段的連接4 4）重組）重組DNADNA轉化受體細胞轉化受體細胞4.4.基因文庫的構建基因文庫的構建第9頁/共38頁基因組文庫的構建基因組文庫的構建通過對受體菌通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存的培養(yǎng)而儲存基因基因第10頁/共38頁 cDNAcDNA文庫的構建文庫的構建 （反轉錄法）反轉錄法） 目的基因的目的基因的mRNAmRNA單鏈單鏈DNADNA反轉錄酶反轉錄酶DNADNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA(DNA(目的基因目的基因) )接到載體接到載體第11頁/共38頁小小大大無無有有無無有有某種生物的部分基因某種生物的部分基因 某種生物的全

4、部基因某種生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以第12頁/共38頁思考：思考：怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？因？ 根據基因的有關信息如根據基因的有關信息如根據基因的轉錄根據基因的轉錄產物產物mRNAmRNA、基因的核苷酸序列、基因翻譯產、基因的核苷酸序列、基因翻譯產物蛋白質物蛋白質等來獲取目的基因。等來獲取目的基因。第13頁/共38頁2 2、利用、利用PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因PCRPCR第14頁/共38頁 概念概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項在生物，是一項在生物_復制復制_的核酸合成技術的核酸合成技術 條件：條件

5、：_ _ _、 _ _ 、 _原理：原理：_方式：方式：以以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增循環(huán)的次數為擴增循環(huán)的次數）結果：結果：聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA雙鏈復制雙鏈復制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列( (前提條件前提條件) )四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸成對引物成對引物DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）指數指數2 2n n使目的基因的片段在短時間內成百萬使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增倍地擴增第15頁/共38頁過程：過程：a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNAD

6、NA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火（、退火（復性復性55-6555-65）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引物與物與DNADNA模板結合，形成局部模板結合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成與模板互補的合成與模板互補的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈第16頁/共38頁PCRPCR的基本反應步驟的基本反應步驟變性變性90-9590-95C C延伸延伸70-7570-75C C退火退火55-6055-60C CPCRPCR總結：總結：第17頁/共38頁 基

7、因比較小基因比較小, ,已知核苷酸序列，直接利已知核苷酸序列，直接利用用DNADNA合成儀用化學方法合成，不需要模板合成儀用化學方法合成，不需要模板。第18頁/共38頁第19頁/共38頁二、基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建 核心核心第20頁/共38頁質粒質粒DNADNA分子分子一個切口一個切口兩個黏性末端兩個黏性末端兩個切口兩個切口獲得目的基因獲得目的基因DNA DNA 連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒）同一種同一種 限制酶限制酶1 1、基因表達載體的構建方法、基因表達載體的構建方法第21頁/共38頁2.2.基因表達載體的目的基因表達載體的目的（1 1）使

8、目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代并可以遺傳給下一代（2 2）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。第22頁/共38頁b b、思考：它們有什么作用？第23頁/共38頁第24頁/共38頁 是為了鑒別受體細胞中是否含有目是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。出來。標記基因有什么作用？標記基因有什么作用？第25頁/共38頁三、將目的基因導入受體細胞三、將目的基因導入受體細胞2 2、方法、方法將目的基因導入將目的基因導入植物細胞植物細胞將目的基因導入將目的基因導入動物細

9、胞動物細胞將目的基因導入將目的基因導入微生物細胞微生物細胞農桿菌轉化法農桿菌轉化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞第26頁/共38頁（1）農桿菌轉化法特點：特點： 易感染雙子葉植物和裸子植物易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染，對大多數單子葉植物沒有感染能力能力原理：原理： TiTi質粒上的質粒上的T-DNAT-DNA可以轉移到受體細胞，并整可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的合到受體細胞染色體的DNADNA上。上。第27頁/共38頁轉化過程:TiTi質粒質粒目的基因目的基因構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色DNA

10、表達新性狀轉入農桿菌第28頁/共38頁 基因槍法又稱微彈轟擊基因槍法又稱微彈轟擊法，是法，是利用壓縮氣體產利用壓縮氣體產生的動力生的動力，將包裹在金，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體屬顆粒表面的表達載體DNADNA打入受體細胞中打入受體細胞中，使目的基因與其整合并使目的基因與其整合并表達的方法。表達的方法。（2）基因槍法第29頁/共38頁（3）花粉通道法 植物花粉在柱頭上萌植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ㄖ蓖ㄅ吣??；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加，剪去柱頭

11、，然后，滴加DNADNA（含目的基因），使（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。進入受體細胞。第30頁/共38頁胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第31頁/共38頁目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 顯微注射顯微注射 受精卵受精卵 新性狀動物新性狀動物第32頁/共38頁微生物作受體細胞原因：微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、繁殖快、多為單細胞、 遺傳物質相對少遺傳物質相對少過程：過程：CaCa2+2+處理大處理大腸桿菌腸桿菌感受態(tài)感受態(tài)細胞細胞表達載體表達載體與感受態(tài)與感受態(tài)細胞混合細胞混合感受態(tài)感受態(tài)細胞吸

12、細胞吸收收DNADNA3.3.將目的基因導入微生物細胞將目的基因導入微生物細胞第33頁/共38頁第34頁/共38頁1 1、檢測轉基因生物染色體的、檢測轉基因生物染色體的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 首先取出轉基因生物的基因組首先取出轉基因生物的基因組DNADNA；（1 1）方法）方法: :DNADNA分子雜交分子雜交（2 2）過程）過程: : 將含目的基因的將含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等作標記作標記, ,以此做探針；以此做探針； 使探針和轉基因生物的基因組雜交使探針和轉基因生物的基因組雜交, ,若顯示若顯示出雜交帶出雜交帶, ,表明染色體已插入染色體表明染色體已插入染色體DNADNA中。中。（