試驗水中細菌總數(shù)的測定水中大腸桿菌的測定

1、實驗2水中大腸菌群數(shù)的測定一、目的要求1. 了解大腸菌群數(shù)量在引用水中的重要性2. 學習掌握多管發(fā)酵法和濾膜法測定大腸菌群數(shù)二、原理若水源被糞便污染，則有可能也被腸道病原菌污染，然而腸道病原菌在水中容易死亡與變異，因此數(shù)量較少，要從中特別是自來水中分離出病原菌常較困難與費時，這樣就要找到一個合適的指示菌，此指示菌要求是大量出現(xiàn)在糞便中的非病原菌，并且和水源病原菌相比是較易檢出的。若指示菌在水中不存在或數(shù)量很少，則大多數(shù)情況也保證沒有病原菌。最廣泛應(yīng)用的指示菌是大腸菌群，它的定義是：一群好氧和兼性厭氧、革蘭氏陰性、無芽胞的桿狀細菌，并在乳糖培養(yǎng)基中，經(jīng)370C、2448h培養(yǎng)能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，根據(jù)水中

2、大腸菌群的數(shù)目來判斷水源是否被糞便所污染，并間接推測水源受腸道病原菌污染的可能性。我國規(guī)定每升自來水中大腸菌群不得檢出；若只經(jīng)過加氯消毒即供作生活飲用水的水源水，大腸菌群數(shù)平均每升不得超過 1000個；經(jīng)過凈化處理及加氯消毒后供作生活飲用水的水源水，其大腸 菌群數(shù)平均每升不得超過 10000個。檢查大腸菌群的方法有多管發(fā)酵法與濾膜法兩種。多管發(fā)酵法使用歷史較久，又稱水的標準分析方法，為我國大多數(shù)衛(wèi)生單位與水廠所采用； 濾膜法是一種快速的替代方法， 而且 結(jié)果重復性好，又能測定大體積的水樣，目前國內(nèi)已有很多大城市的水廠采用此法。三、實驗儀器和材料1 .錐形瓶（500 ml）、試管（18 mm X

3、 180 mm ）、大試管（容積 150 ml ）、移液管1 ml 及10ml、培養(yǎng)皿（直徑 90 mm）、接種環(huán)、試管架 1個。2. 革蘭氏染色液一套：草酸鉉結(jié)晶紫、革氏碘液、 95%乙醇、蕃紅染液3. 顯微鏡4. 自來水（或受糞便污染的河、湖水）400ml5. 蛋白月東、乳糖、磷酸氫二鉀、瓊脂、無水亞硫酸鈉、牛肉膏、氯化鈉、1.6%漠甲酚 紫乙醇溶液、5%堿性品紅乙醇溶液、2%伊紅水溶液、0.5%美藍水溶液。6. 10% NaOH、10% HCl、精密 pH 試紙 6.48.4。四、實驗前準備工作（一）配培養(yǎng)基1. 乳糖蛋白腺培養(yǎng)基（供多管發(fā)酵法的復發(fā)酵用）配方：蛋白月東10g、牛肉膏3g

4、、乳糖5g、氯化鈉5g、1.6%漠甲酚紫乙醇溶液 1 ml、蒸 儲水 1 000ml、pH = 7.2 7.4。制備：按配方分別稱取蛋白月東、牛肉膏、乳糖及氯化鈉加熱溶解于1 000 ml蒸儲水，調(diào)整pH為7.27.4。加入1.6%漠甲酚紫乙醇溶液 1 ml,充分混勻后分裝于試管內(nèi)，每管 10 ml,另取一小倒管裝滿培養(yǎng)基倒放入試管內(nèi)。塞好棉塞、包扎。置于高壓滅菌鍋內(nèi)以 0.7kg/cm2 （115C）滅菌20min ,取出置于陰冷處備用。2. 三倍濃縮乳糖蛋白腺培養(yǎng)液（供多管法初發(fā)酵用）按上述乳糖蛋白腺培養(yǎng)液濃縮三倍配制，分裝于試管中，每管 5ml。再分裝大試管，每 管裝50ml,然后在每管

5、內(nèi)倒放裝滿培養(yǎng)基的小導管、塞棉塞、包扎，置高壓滅菌鍋內(nèi)以 0.7kg/cm2 （115C）滅菌20min ,取出置于陰冷處備用。3. 品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（即遠滕氏培養(yǎng)基），供多管發(fā)酵法的平板劃線用配方：蛋白腺10g、乳糖10g、磷酸氫二鉀3.5g、瓊脂2030g、蒸儲水1000ml、無水 亞硫酸鈉5g左右、5%堿性品紅乙醇溶液。制備：先將瓊脂加入900ml蒸儲水中加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀及蛋白腺，混勻使之溶解，加蒸儲水補足至l 000 ml,調(diào)整pH為7.27.4,趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入乳糖，混勻后定量分裝于錐形瓶內(nèi)，置高壓滅菌鍋內(nèi)以0.7 kg/cm2滅菌20min ,取出置于陰

6、冷處備用。現(xiàn)市場上有售配制好的乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，使用方便。4. 伊紅美藍培養(yǎng)基配方：蛋白腺10g、乳糖10 g、磷酸氫二鉀2g、瓊脂2030 g、蒸溜水1000ml、2%伊紅水溶液10 ml、0.5%美藍水溶液13 ml制備：按品紅亞硫酸鈉的制備過程制備?，F(xiàn)市場上有售配制好的伊紅美藍培養(yǎng)基，使用方便。五、實驗方法與步驟（一）大腸菌群的測定1 .多管發(fā)酵MPN法（按三個步驟進行）多管發(fā)酵法適用于飲用水、水源水，特別是渾濁度高的水中的大腸菌群測定。（1）生活飲用水的測定步驟 初步發(fā)酵試驗 在2支各裝有50 ml三倍濃縮乳糖蛋白月東培養(yǎng)液的大發(fā)酵管中， 以無 菌操作各加入100ml水樣。在10支各裝有

7、5 ml三倍濃縮乳糖蛋白月東培養(yǎng)液的發(fā)酵管中， 以 無菌操作各加入10ml水樣.混勻后冒于 37oC恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察其產(chǎn)酸產(chǎn)氣的情況。情況分析：a. 若培養(yǎng)基紅色不變?yōu)辄S色，小導管沒有氣體，即不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，為陰性反應(yīng)，表明 無大腸菌群存在。b. 若培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色，小導管有氣體產(chǎn)生，即產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，為陽性反應(yīng)，說明 有大腸菌群存在。c. 培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色說明產(chǎn)酸，但不產(chǎn)氣，仍為陽性反應(yīng)，表明有大腸菌群存在。 結(jié)果為陽性者，說明水可能被糞便污染，需進一步檢驗。d. 若小倒管有氣體，培養(yǎng)基紅色不變，也不渾濁，是操作技術(shù)上有問題，應(yīng)重作檢驗。 確定性試驗用平板劃線分離，將經(jīng)培養(yǎng) 24

8、h后產(chǎn)酸（培養(yǎng)基呈黃色）、產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的發(fā)酵管取出，以無菌操作，用接種環(huán)挑取一環(huán)發(fā)酵液于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（或伊紅美藍培養(yǎng)基）平板上劃線分離，共三個平板。置于37C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)1824 h,觀察菌落特征。如果平板上長有如下特征的菌落并經(jīng)涂片和進行革蘭氏染色，結(jié)果為革蘭氏陰性的無芽孑包桿菌，則表明有大腸菌群存在。在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基平板上的菌落特征:a. 紫紅色，具有金屬光澤的菌落；b. 深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；c. 淡紅色，中心色較深的菌落。在伊紅、美藍培養(yǎng)基平板上的菌落特征：a. 深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；b. 紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；c. 淡紫紅色，中心色較深

9、的菌落。 復發(fā)酵試驗以無菌操作，用接種環(huán)在具有上述菌落特征、革蘭氏染色陰性的無芽弛桿菌的菌落上挑取一環(huán)于裝有10ml普通濃度乳糖蛋白腺培養(yǎng)基的發(fā)酵管內(nèi)，每管可接種同一平板上（即同一初發(fā)酵管）的 13個典型菌落的細菌。蓋上棉塞置于 37oC恒溫箱內(nèi)培 養(yǎng)24h,有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者證實有大腸菌群存在。根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性菌（瓶）數(shù)查表。報告每升水樣中大腸菌群數(shù)。（2）水源水中大腸菌群的測定步驟（一） 稀釋水樣根據(jù)水源水的清潔程度確定水樣的稀釋倍數(shù)，除嚴重污染外，一般稀釋倍數(shù)為10-1及10-2,稀釋方法如實驗七中所述的10倍稀釋法（均需無菌操作）。初步發(fā)酵試驗 以無菌操作，用無菌移液管吸取 1

10、ml 10-2、10-1的稀釋水樣及l(fā) ml原 水樣，分別注入裝有 10 ml普通濃度乳糖蛋白腺培養(yǎng)基的發(fā)酵管中，另取10ml原水樣注入裝有5 ml三倍濃縮乳糖蛋白月東培養(yǎng)基的發(fā)酵管中 （注：如果為較清潔的水樣，可再取100ml 水樣注入裝有50ml三倍濃縮的乳糖蛋白月東培養(yǎng)基發(fā)酵瓶中） 。置37cC恒溫箱中培養(yǎng)24h后 觀察結(jié)果。以后的測定步驟與生活飲用水的測定方法相同。根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性管數(shù)或瓶數(shù)查表，報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。（3）水源水中大腸菌群的測定步驟（二） 稀釋水樣 將水樣作10倍稀釋。 于各裝有5ml三倍濃縮乳糖蛋白月東培養(yǎng)液的 5個試管中，各加10ml水樣。于裝有

11、10 ml乳糖蛋白月東培養(yǎng)液的 5個試管中，各加l ml水樣。于裝有10ml孚L糖蛋白月東培養(yǎng)液的 5 個試管中，各加1 ml 10-1的稀釋水樣。三個稀釋度，共計15管。將各管充分混勻，置于370C 怛溫箱中培養(yǎng)24h。 平板分離和復發(fā)酵試驗的檢驗步驟同“生活飲用水檢驗方法”。 根據(jù)證實大腸菌群存在的陽性管數(shù)查表，即可求得每 100ml水樣中存在的大腸菌群 數(shù)。乘以10即為1L水中的大腸菌群數(shù)。2.濾膜法適用范圍：適用于測定飲用水和低濁度的水源水（1）原理：濾膜是一種微孔薄膜，孔徑 0.450.65微米，能濾過大量水樣并將水中含有的細菌截留在濾膜上，然后將濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，直

12、接計數(shù)濾膜上生長的典型大腸菌群菌落，算出每L水樣中含有的大腸菌群數(shù)。（2）儀器與材料：除與多管發(fā)酵法的相同外，另還有：過濾器、抽濾設(shè)備、無菌鑲子、 濾膜（直徑3.5 cm和4.7 cm）。（3）培養(yǎng)基: 品紅亞硫酸鈉培 養(yǎng)基 （乙）配方：蛋白月東10g、酵母浸膏5g、牛肉膏5g、孚L糖10g、磷酸氫二鉀3.5g、瓊脂15 20g、無水亞硫酸鈉 5g左右、5%堿性品紅乙醇溶液 20ml、蒸儲水1 000ml, pH = 7.27.4。乳糖蛋白腺培養(yǎng)液（與多管發(fā)酵法相同）。乳糖蛋白腺半固體培養(yǎng)基：配方：蛋白腺10g、牛肉膏5g、酵母浸膏5g、乳糖10g、瓊脂5g、蒸儲水l 000ml, pH =7

13、.2 7.4。（4）操作步驟：首先要作好準備工作，而后才是過濾水樣。準備工作主要是濾膜和濾 器的滅菌。濾膜滅茵時，將濾膜放入燒杯中，加入蒸儲水，置于沸水浴中煮沸滅菌三次，每次15min,前兩次煮沸后需更換蒸儲水洗滌23次，以除去殘留溶劑。濾器滅菌使用高壓滅菌鍋在121oC下，滅菌20min。過濾水樣時，用無菌鑲子夾住濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼在濾器上，穩(wěn)妥地固定好濾器，將333ml水樣（如果水樣中含菌量多，可減少過濾水樣）注入濾器中，加蓋，打 開濾器閥門，在-500Pa下抽濾。水樣濾畢，再抽氣5s,關(guān)上濾器閥門，取下濾器，用鑲子夾住濾膜邊緣移放在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基平板上，濾膜截留細菌面向上， 濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37oC恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2224h后觀察結(jié)果。挑取具有大腸菌群菌落特征的菌落（菌落特征見上述多管發(fā)酵法）進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。將具有大腸菌群菌落特征、革蘭氏染色陰性的無芽弛桿菌接種到乳糖蛋白腺培養(yǎng)液或乳 糖蛋白月東半固體培養(yǎng)基。經(jīng)37C培養(yǎng)，前者于 24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣者；或后者經(jīng) 68h培養(yǎng)后產(chǎn)氣者，則判定為大腸菌群陽性。計算每L水樣中大腸菌群數(shù)，即將平板上長出的大腸菌落總數(shù)乘以3。六實驗報告1記錄結(jié)果，根據(jù)你的結(jié)果判斷所取水樣