實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌培養(yǎng)與代謝產(chǎn)物檢查

1、實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌培養(yǎng)與代謝產(chǎn)物檢查【目的】 學(xué)習(xí)并初步掌握基礎(chǔ)培養(yǎng)基制備方法。 了解細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需要營(yíng)養(yǎng)以及常用培養(yǎng)基的種類和用途。 了解細(xì)菌所具有的不同生化反應(yīng)及代謝產(chǎn)物，以利細(xì)菌的鑒定和鑒別 規(guī)范地進(jìn)行無(wú)菌操作。一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備（一）培養(yǎng)基的制作程序培養(yǎng)基制作的一般程序：準(zhǔn)確稱量培養(yǎng)基的各種成分T混合溶解一測(cè)定及矯 正pHH分裝、包裝f滅菌f檢定f保存?zhèn)溆?。?二） 常用培養(yǎng)基的種類按培 養(yǎng)基 的作用分為： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有細(xì)菌需要的最基本營(yíng)養(yǎng)成分（蛋白胨1%,牛肉膏0.3 %, 氯化鈉 0.5，用蒸餾水溶解 ）。按其性狀不同可分為： （1） 肉湯培養(yǎng)基。 （2） 普 通瓊脂培養(yǎng)基。分斜

2、面和平板培養(yǎng)基，內(nèi)含 23%的瓊脂，呈固體狀。（3）半固 體培養(yǎng)基，含0.20.5 %的瓊脂。 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：供營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌用，如血瓊脂培養(yǎng)基（在普通瓊脂培養(yǎng)基中加入 5 % 1 0%的脫纖維動(dòng)物血 ） 。 選擇培養(yǎng)基：如SS瓊脂培養(yǎng)基，可選擇性抑制非病原菌生長(zhǎng)，有利于分 離病原菌。 鑒別培 養(yǎng)基： 如含鐵雙糖培養(yǎng)基，用以鑒定細(xì)菌。 厭氧培養(yǎng)基：如庖肉培養(yǎng)基，用以培養(yǎng)厭氧菌。（ 三） 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備過(guò)程1 、肉湯 （ 肉浸液 ） 培養(yǎng)基【材料】牛肉、蛋白胨、氯化鈉、水（蒸餾水或自來(lái)水）、NaOH溶液（1N和N/10）、 0.02%酚紅指示劑、吸管等?！痉椒ā?取新鮮瘦牛肉，除去脂肪及筋膜

3、，切成小塊后用絞肉機(jī)絞碎，每500g碎肉加水1000ml，混合置4C冰箱過(guò)夜（使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)即溶解性蛋白質(zhì)充分滲出）。 次日取出煮沸半小時(shí)左右， 使肉渣蛋白質(zhì)全部凝固； 加熱過(guò)程中不時(shí)地用 玻璃棒攪拌，以免沉淀燒焦。也可不放置冰箱過(guò)夜，直接煮沸 1 小時(shí)。 用數(shù)層紗布過(guò)濾，棄去肉渣（肉渣中的液體應(yīng)盡量擠凈），于濾液中加入 1%蛋白胨及 0.5%氯化鈉，加熱溶解，并補(bǔ)足失水至 1000ml。 冷卻到50T在右，以N/10 NaOH調(diào)至pH值7.67.8。 待pH矯正后，再加熱10min,使肉湯中部分蛋白質(zhì)等因加堿及再度加熱 而凝固沉淀。過(guò)濾并補(bǔ)足失水，重復(fù)矯正 pH值一次， 將上述制備的肉湯分裝于燒

4、瓶或試管中，瓶口或管口加塞并包扎，經(jīng) 103.34kPa（15磅）20min高壓滅菌后，置冰箱中或干燥陰涼處備用。【用途】 用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其營(yíng)養(yǎng)比肉膏湯好，一般營(yíng)養(yǎng)要求不高的細(xì)菌均可生長(zhǎng)。2、肉膏湯培養(yǎng)基牛肉膏系將牛肉湯加熱濃縮而成， 每 1 000毫升能濃縮成肉膏約 70克。牛肉 膏湯可代替牛肉湯來(lái)培養(yǎng)細(xì)菌， 由于經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間加熱， 部分營(yíng)養(yǎng)成分 （如糖分）已損 失，故其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值略低于牛肉湯。但肉膏湯制作手續(xù)簡(jiǎn)單，制品透明清晰，酸堿 度變化較小，故仍常用?！静牧稀?牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、水、氫氧化鈉溶液、 0.02 酚紅指示劑、 吸管等?！痉椒ā?將牛肉膏35g、蛋白胨10g、氯化鈉5g加于

5、1000ml水中，用玻棒攪拌 使其溶解。必要時(shí)加熱使其溶解。 矯正至pH7.47.6，煮沸35min,過(guò)濾。 分裝于適當(dāng)容器內(nèi)，高壓滅菌15磅20min，置冰箱中或干燥陰涼處備用。 【用途】 供一般細(xì)菌培養(yǎng)用。3、肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基 瓊脂是海藻糖中提取出的一種多糖類物質(zhì)， 對(duì)病原性細(xì)菌無(wú)營(yíng)養(yǎng)作用。 加入培養(yǎng)基的目的是使之固態(tài)化，因其熔化點(diǎn)為100C,凝固點(diǎn)約40C,利用此特性， 加至肉湯或肉膏湯內(nèi)后， 趁熱可制得斜面， 平板等不同類型的固體培養(yǎng)基， 以供 分離培養(yǎng)、繁殖細(xì)菌等用?！静牧稀縫H7.6牛肉湯或牛肉膏湯、瓊脂、空試管、滅菌培養(yǎng)皿 （9cm直徑）。 【方法】 于 pH 7.6 的牛肉湯

6、或牛肉膏湯中，加入 23瓊脂，加熱溶化。 以脫脂棉過(guò)濾去除雜質(zhì) （或不過(guò)濾） ，分裝燒瓶或試管 （瓊脂斜面每管 5m1）。 經(jīng) 15 磅 20min 高壓滅菌后，趁熱將裝有 5ml 肉湯瓊脂之試管斜置，待冷凝后即成瓊脂斜面培養(yǎng)基。高層瓊脂的分裝量約為試管長(zhǎng)度的14或 13；若接種厭氧菌則應(yīng)為試管長(zhǎng)度的2/ 3。燒瓶中肉湯瓊脂冷至5060C時(shí)，以無(wú)菌 操作法將其傾入滅菌空培養(yǎng)皿中（每皿1520ml），迅速蓋上皿蓋，并將培養(yǎng)皿 于桌面輕輕回轉(zhuǎn)搖動(dòng)，使皿內(nèi)培養(yǎng)基平鋪皿底，待冷凝后即成瓊脂平板培養(yǎng)基?！居猛尽?瓊脂斜面培養(yǎng)基用于純種細(xì)菌接種以保存一般菌種。 瓊脂平板培養(yǎng)基用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)。4、肉湯瓊

7、脂半固體培養(yǎng)基【材料】pH7.6的牛肉湯或牛肉膏湯、瓊脂、空小試管（10 x 100mm）【方法】 于pH7.6的牛肉湯或牛肉膏湯中，加入0.30.5 %瓊脂，加熱溶化后， 過(guò)濾并補(bǔ)足失水。 分裝于小試管中，每管3ml，經(jīng)15磅20min高壓滅菌后直立冷凝即成?！居猛尽砍Ｓ糜诩?xì)菌的動(dòng)力檢查和菌種保存。5、干燥培養(yǎng)基干燥培養(yǎng)基是將新鮮配制的液體培養(yǎng)基用噴霧、真空、低溫、蒸發(fā)等干燥方法，將培養(yǎng)基內(nèi)水分去掉后形成各種固形成分，經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理使成干燥粉末狀。 用時(shí)只要按一定比例加入一定量的蒸餾水， 經(jīng)過(guò)溶解、分裝、高壓滅菌即可應(yīng)用。 其優(yōu)點(diǎn)是節(jié)省時(shí)間、使用方便。二、細(xì)菌的接種法（一）分離培養(yǎng)法細(xì)菌種類多

8、且分布廣，因此臨床標(biāo)本如糞便、痰、膿等以及水、牛乳中常含 有多種細(xì)菌。應(yīng)用分離培養(yǎng)法可獲得檢材中某一種細(xì)菌，亦可使被污染的菌種重 新分純?！静牧稀科咸亚蚓痛竽c埃希菌的混合菌液、普通瓊脂平板。【方法】當(dāng)標(biāo)本中含有兩種以上細(xì)菌時(shí)，可用平板劃線接種法。劃線方法很多，平板 分離劃線接種為常用的分離培養(yǎng)法，最后均使混雜的細(xì)菌在瓊脂平板表面分散， 形成菌苔；或者使單個(gè)細(xì)菌固定在一點(diǎn)上生長(zhǎng)繁殖， 形成單個(gè)菌落而得到純種細(xì) 菌。操作方法：右手持接種環(huán)，火焰滅菌后，挑取待分離標(biāo)本一環(huán)；左手持 瓊脂平板，以左手拇指和食指將平板蓋開(kāi)啟，右手將沾有檢材之接種環(huán)伸入平板， 與平板培養(yǎng)基表面成45°角，如圖所

9、示，在培養(yǎng)基表面分區(qū)劃線（每區(qū)劃線后， 接種環(huán)都須經(jīng)火焰滅菌），蓋好平板。最后接種環(huán)火焰滅菌；在平板底上標(biāo)好 組別、姓名、日期等（標(biāo)簽紙寫(xiě)好后貼上）。將平板底朝上、蓋朝下放入 37C 溫箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后觀察結(jié)果。平板劃線接種法【觀察結(jié)果】觀察瓊脂平板培養(yǎng)基表面菌苔以及單個(gè)菌落生長(zhǎng)情況，即觀察瓊脂平板培養(yǎng) 基表面單個(gè)菌落的大小、形狀、突起、邊緣、菌落表面、濕潤(rùn)度、透明度及顏色等性狀。挑取單個(gè)菌落可獲得純培養(yǎng)。（二）純種細(xì)菌培養(yǎng)法各種檢材經(jīng)分離培養(yǎng)得純種細(xì)菌后，若需保留菌種或進(jìn)一步測(cè)試其生化反應(yīng) 等生物學(xué)特性時(shí)，必須進(jìn)行純種細(xì)菌培養(yǎng)。根據(jù)常用培養(yǎng)基的物理性狀，純種細(xì) 菌培養(yǎng)接種法有以下幾種。1

10、、瓊脂斜面培養(yǎng)基接種法凡具有斜面外形的的固體培養(yǎng)基均采用此種方法接種細(xì)菌?！静牧稀凯傊泵媾?養(yǎng)基、 大腸埃希菌瓊脂斜面 1824小時(shí)培養(yǎng)物?！痉椒ā?右手持接種環(huán)，火焰滅菌后，在瓊脂板上挑取單個(gè)典型可疑菌落少許； 左手持斜面培養(yǎng)基試管，右手掌和小指撥出棉塞，將挑有細(xì)菌的接種環(huán)伸 入試管內(nèi)。 在培養(yǎng)基表面劃線后，塞好棉塞，接種環(huán)火焰滅菌；放入37°C孵育24小時(shí)后觀察。 預(yù)先在試管1/3處標(biāo)好組別、姓名、日期等。瓊脂斜面接種法【觀察結(jié)果】觀察斜面表面菌苔生長(zhǎng)情況。2、半固體培養(yǎng)基接種法半固體瓊脂培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基及明膠培養(yǎng)基等均用本法接種細(xì)菌?！静牧稀堪牍腆w瓊脂培養(yǎng)基、痢疾志賀菌及

11、大腸埃希菌斜面培養(yǎng)物?！痉椒ā坑沂殖纸臃N針，火焰滅菌后，挑取菌落或菌苔少許，垂直刺入半固體培養(yǎng)基 的中央，深入管內(nèi)培養(yǎng)基的3/4處，再循原穿刺線退出。放入37C孵育24小時(shí) 后觀察。【觀察結(jié)果】觀察細(xì)菌能否運(yùn)動(dòng)。有鞭毛菌能運(yùn)動(dòng)，細(xì)菌沿穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)，使培養(yǎng)基 呈毛玻璃樣混濁；而無(wú)鞭毛菌則不能運(yùn)動(dòng)，細(xì)菌沿穿刺線生長(zhǎng)，其周圍培養(yǎng)基仍 為原來(lái)的透明度。液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基接種法3、液體培養(yǎng)基接種法【材料】肉湯、葡萄糖蛋白胨水及各種單糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基都用本法接種細(xì)菌。 材料為普通肉湯培養(yǎng)基、大腸埃希菌瓊脂斜面 1824小時(shí)培養(yǎng)物?！痉椒ā?右手持接種環(huán)，火焰滅菌后，用接種環(huán)挑取菌落少許，如圖所

12、示，在接近培養(yǎng)基液面的管壁上輕磨后，豎直試管，使接種的細(xì)菌混入培養(yǎng)液（圖9-3A） 各種培養(yǎng)基接種細(xì)菌后，即放入 37°C溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。 【觀察結(jié)果】細(xì)菌生長(zhǎng)情況：均勻混濁、菌膜、沉淀。（三）細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)現(xiàn)象1、細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)現(xiàn)象，觀察結(jié)果并填入下圖。細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)現(xiàn)象2、 細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)現(xiàn)象，觀察結(jié)果并填入圖9-1 o纟田菌在區(qū)生長(zhǎng)最多，形成 ，在區(qū)生長(zhǎng)最少，可見(jiàn)單個(gè) o3、細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)現(xiàn)象，觀察結(jié)果并填入圖。本法為檢查細(xì)菌動(dòng)力的試驗(yàn)，凡細(xì)菌沿穿刺線向周圍擴(kuò)散生長(zhǎng)者，說(shuō)明該菌 有鞭毛，為動(dòng)力試驗(yàn)陽(yáng)性，只沿穿刺線生長(zhǎng)為陰性。細(xì)

13、菌在半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)現(xiàn)象三、細(xì)菌分解代謝產(chǎn)物檢查【原理】細(xì)菌的新陳代謝受一系列酶的控制， 各種細(xì)菌又具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因 而在代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的分解和合成代謝產(chǎn)物也不相同， 這些代謝產(chǎn)物又各具有 不同的生化特點(diǎn)。根據(jù)此特點(diǎn)，利用生物化學(xué)方法來(lái)鑒別不同的細(xì)菌稱為細(xì)菌的 生化反應(yīng)。這些試驗(yàn)在鑒別和鑒定細(xì)菌方面起著重要作用。（一）糖發(fā)酵試驗(yàn)【原理】各種細(xì)菌因含有發(fā)酵不同糖類的酶，因而分解各種糖 （醇）類的能力各不相 同。有些能分解糖（醇）產(chǎn)酸，使指示劑變色，有些能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有些則不能分解。 據(jù)此可鑒別細(xì)菌的種類。糖發(fā)酵管是將葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇或蔗糖等加入蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)，使其最終濃度

14、為0.75 %1 %,并加入一定量的溴甲酚紫指示劑和 1支倒置 的小管，管內(nèi)液體為紫色。接種細(xì)菌經(jīng) 37C孵育，細(xì)菌分解糖后，若產(chǎn)酸，則 使培養(yǎng)基變色。其顏色由所加指示劑而定，如指示劑為溴甲酚紫，則由紫色 （堿 性） 變成黃色 （酸性 ）；如為酚紅，則由紅色變成黃色。一般以 “”表示產(chǎn)酸；若 產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，不僅培養(yǎng)基變色，而且倒置小管內(nèi)出現(xiàn)氣泡，以表示；若不分解該種糖，則無(wú)以上兩種現(xiàn)象，以 “”表示?！静牧稀?葡萄糖發(fā)酵管 （乳糖）、產(chǎn)堿桿菌、傷寒沙門(mén)菌及大腸埃希菌斜面培養(yǎng)物。 【方法】分別將產(chǎn)堿桿菌，傷寒沙門(mén)菌及大腸埃希菌接種于葡萄糖發(fā)酵管中，置37r 孵箱中培養(yǎng) 1824小時(shí)。產(chǎn)堿桿菌不分解

15、葡萄糖 （） ；傷寒桿菌分解該糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 （）；大腸埃希 菌則產(chǎn)酸產(chǎn)氣（®）。（二）吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)（Indol試驗(yàn)）【原理】某些細(xì)菌具有色氨酸酶， 能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚 （靛基質(zhì)），吲 哚本身無(wú)色， 不能直接察見(jiàn)， 加入吲哚試劑 （對(duì)二甲基氨基苯甲醛 ）則形成紅色的 玫瑰吲哚，易被肉眼察見(jiàn)?！静牧稀康鞍纂怂囵B(yǎng)基、 大腸埃希菌、 乙型副傷寒沙門(mén)菌 1824小時(shí)斜面培養(yǎng)物、 吲哚試劑。【方法】分別接種大腸埃希菌及乙型副傷寒沙門(mén)菌于蛋白胨水培養(yǎng)基中。37 r孵育2448 小時(shí)?！居^察結(jié)果】沿管壁各加入吲哚試劑0. 5ml，約隔1min左右，在二層液面交界處如出現(xiàn) 一圈玫瑰紅色，即為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，若不出現(xiàn)紅色，則為吲哚試驗(yàn)陰性。（三）硫化氫試驗(yàn)【原理】某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的胱氨酸等含硫氨基酸， 產(chǎn)生硫化氫， 硫化氫遇鉛 鹽（或鐵鹽）則形成黑褐色的硫化鉛 （或硫化鐵）沉淀物。黑褐色沉淀物愈多， 表示 形成的硫化氫量亦愈多。 硫化氫試驗(yàn)用的培養(yǎng)基中含有硫代硫酸鈉， 能保持還原 環(huán)境