實時定量PCR技術(shù)應(yīng)用常見問題解答—ABI

1、定量PCR常見問題解答1. 定量PCR儀的開關(guān)機(jī)順序是怎樣的？按照正確的開關(guān)機(jī)順序操作，有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。 開機(jī)順序：先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量PCR儀主機(jī)，等主機(jī)面板上的綠燈亮后即可打開定量PCR的收集軟件，進(jìn)行實驗。關(guān)機(jī)順序：確認(rèn)實驗已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信 號收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR儀主機(jī)的電源，最后關(guān)閉電腦。2. 哪些種類的反應(yīng)管和蓋子適合定量PCR實驗使用？有何需要注意的地方？定量PCR實驗可以使用以下耗材：96孔光學(xué)反應(yīng)板配合光學(xué)膜，0.2 ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合光學(xué)膜，0.2 ml光學(xué)八聯(lián)反應(yīng)管配合平蓋的光學(xué)八聯(lián)管蓋。ABI公司生產(chǎn)的定量

2、PCR耗材的具體使用方法和貨號見下表：反應(yīng)管上機(jī)樣品支架蓋子或膜?？坠鈱W(xué)反應(yīng)板56-Well OpticalReaction Plate (P/N 4306737)兀血型定罩PCR儀將財孔板直捲放入Block其他型導(dǎo)的定Spur佟使用隨機(jī)配備的96孔板支架*Optical Adhesive Cover (P/N43H971> 或ABI PRISM Optical Caps, 8Caps/Strip (Fht Caps)(P/N 4323032)品聯(lián)管Micro Amp g-StripReaction Tube(P/NN801-058(J)7D0D型PCR儀】使用MicroAmp 96-W

3、ell Tray>ReteinerSet5(P/N 403081>73007500型定童PCR儀：康用 隨機(jī)酉2備的單管支架.Optical Adhesive Cover(P/N 4311971) 或 ABI PRISM® OpticalCaps, 8 Caps/Slrip (FlatCaps) (P/N4323032)帶蓋單個離心管 MicroAmp ReactionTubes with Cap (P/NN801-0540)同上.Optical Adhesive Cover(P/N 4311971)注卮.：先列掉管蓋后，冉用 光學(xué)膜或八聯(lián)平蓋密封.帶蓋光學(xué)離心管Micr

4、oAmp Optical Tube(P/NN801-0933)MicroAmp 96-Well Tray for Tubes with Caps (P/N N801-0541)3.為什么要定期對電腦進(jìn)行磁盤碎片整理？怎樣整理?當(dāng)運(yùn)行實時定量PCR儀及使用軟件分析實驗結(jié)果時，計算機(jī)會刪除并創(chuàng)建若干文件，計算機(jī)硬盤的空閑空間會被分割成越來越多的小塊。當(dāng)硬盤驅(qū)動器上文件以分解的碎片存儲時，程序需要更長的時間才能存取文件，因為必須多次尋找文件碎片以存取不同的片斷。碎片整理實用程序?qū)⒁粋€文件分解開的多個碎片合并在一起，并存儲到硬盤的同一個位置，從而清除文件碎片，進(jìn)而優(yōu)化系統(tǒng)性能。碎片整理的方法如下：&#

5、171; 在 Windows桌面上，選擇開始 （start）,我的電腦（My computer）。«在（我的電腦）窗口中，用鼠標(biāo)右鍵單擊硬盤驅(qū)動器，并選擇（屬性）property。«在（屬性）對話框中選擇工具（Tools）選項卡，單擊開始整理 （Defragment now）。«單擊碎片整理（Defragment）。-當(dāng)顯示碎片整理完畢”對話框時，單擊（確定）。在本地磁盤屬性”對話框中，單擊（確定）。為計算機(jī)機(jī)中剩余的驅(qū)動器重復(fù)如上步驟。4. 何時執(zhí)行 windows service pack 更新？不要執(zhí)行該操作。除非美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司代表通知您更新操作系統(tǒng)，

6、否則請不要更新控制定量 PCR儀的計算機(jī)的操作系統(tǒng)。新版本的Microsoft Win dows 操作系統(tǒng)有可能與 SDS軟件存在沖突，并導(dǎo)致儀器不能正常運(yùn)行。如果您希望安裝service pack （更新包）以更新操作系統(tǒng)，應(yīng)查看隨 SDS軟件提供的版本說明，避免兼容性問題。5. 應(yīng)該備份哪些數(shù)據(jù)？應(yīng)該定期備份您的實驗數(shù)據(jù)，備份頻率推薦每周一次，用光盤刻錄。同時您也應(yīng)該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗證實驗數(shù)據(jù)，這些文件所在的目錄是 C： /Appliedbiosystems/SDS Document。下圖是校正文件的樣本。SS *ndIl IfSW可曹!婕19 K

7、B SDS vi a Doamtft!2/200412:43 AM5<Et 蚩5利jttociE化涸2004浦 AM19 壬J'25/2tmk.:53AM19 tB SDSvl.x Etoonen?2j2S/20(M M 屮3Zt：B 306 vl x xxinient2/250KM 122 MStBtccLntr:匚:亍 刪fjeSpectr a JAH46 KB 505 ¥1上IhwSpe咖QJLSdi16tB iDSwl/xIgneot2/25/3001 1:30 聊46 Kfi 5DS 討左 OocEti!Z/2S/2HM t 朋 AT*tdClt.B 蠢

8、65;1.譏匚(56(1：逅炷小3 ;西屮6. 怎么樣的實驗室環(huán)境才能保證儀器設(shè)備正常運(yùn)行？良好的實驗室環(huán)境有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個方面：電源：推薦配備合適的 UPS或穩(wěn)壓器。通風(fēng)：儀器的通風(fēng)應(yīng)該沒有阻擋。溫度：推薦實驗室配備空調(diào)，溫度應(yīng)該控制在10-30 ° C之間。濕度： 20-80% ；對于潮濕的省份，推薦實驗室配備除濕機(jī)?？臻g：易于操作，安全。7. 怎樣判斷定量 PCR 儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？一個辦法是運(yùn)行背景校正反應(yīng)板， 當(dāng)一個或多個反應(yīng)孔連續(xù)顯示出不正常的高信號， 則 表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放

9、任何物品到樣本塊上的前提下，執(zhí)行 ROI 的校正，當(dāng)某個孔的信號明顯高出其他孔時，則表明該孔被污染。清除樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每個污染的反應(yīng)孔中。吹打數(shù)次。將廢液吸入廢液杯中。重復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認(rèn)反應(yīng)孔中的殘留液體蒸發(fā)完8. 什么是背景校正？多長時間執(zhí)行一次背景校正？背景校正程序測量定量 PCR 儀所使用的反應(yīng)管和水的空白熒光強(qiáng)度。在運(yùn)行校正程序 期間，定量 PCR 儀在 10 分鐘內(nèi)連續(xù)讀取背景校正板的熒光強(qiáng)度，信號收集的溫度為 60 ° C。隨后，SDS軟件計算所收集到的熒光強(qiáng)度的平均值，提取結(jié)果并保存到校正文件中。軟 件在今后

10、的分析中將自動調(diào)用此校正文件，從實驗數(shù)據(jù)中扣除背景信號。因為背景熒光的信號強(qiáng)度隨著許多外界因素（比如外來的污染、反應(yīng)板/反應(yīng)管的生產(chǎn)廠商不同、 水的純度等） 而變化，所以推薦定期進(jìn)行背景校正，一般每三個月到半年校正一 次。9. 什么是純熒光校正？多長時間校正一次？純熒光校正是測定各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的波長和信號強(qiáng)度，通俗地說是讓儀器 “認(rèn)識”各種熒光染料。 軟件收集并儲存各種純熒光染料標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信息。 以后每次定量實驗運(yùn)行 過程中，SDS軟件收集樣品的原始光譜信號，并將此原始光譜與純熒光文件中的數(shù)據(jù)進(jìn)行 比較，精確扣除不同染料的信號重疊部分，從而確定樣品中的熒光染料種類和信號強(qiáng)度。推薦每隔半

11、年進(jìn)行一次純熒光校正。在運(yùn)行光譜校正之前，請先進(jìn)行背景校正和ROI校正。10. 96 孔板怎樣封膜？當(dāng)使用 96 孔板做實驗的時候，推薦使用光學(xué)膜代替蓋子來密封反應(yīng)孔。正確的封膜方 法是：先沿著 96 孔板的縱向壓膜，然后橫向，最后沿著板的邊緣按壓使之密封。具體手法 見下面圖示：11.使用單管或8連管做實驗時，在樣品加熱塊上應(yīng)該怎樣安排放置?使用單管或8連管做實驗，并且樣本數(shù)量不多的時候，建議在樣品加熱塊（TRAY）上對稱地安放樣品，最好是縱向放置，并且優(yōu)先放在第 6列或第7列，然后逐漸向兩邊放置。 這 樣做的好處是熱蓋壓下來的時候不至于發(fā)生傾斜，各個反應(yīng)管的受力和受熱都比較均勻， 提高孔與孔

12、之間的數(shù)據(jù)精密性。12. 絕對定量與相對定量有什么區(qū)別？絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝數(shù)。 相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。舉例來說，如果研究項目中包括處理過的和未經(jīng)處理的對照樣本，通常可以將未經(jīng)處理的樣本指定為基準(zhǔn)，規(guī)定其目的基因濃度為100%，將經(jīng)處理的樣本的定量結(jié)果除以對照樣品的定量結(jié)果，就可以計算各個處理樣本的基因含量相對于未處理樣品的百分 比。絕對定量實驗必須使用已知拷貝數(shù)的絕對標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對定量實驗有兩種方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法和

13、Ct值比較法。如果使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法， 可以使用絕對標(biāo)準(zhǔn)品，也可以使用相對標(biāo)準(zhǔn)品，而且相對標(biāo)準(zhǔn)品在實驗操作上更為簡便易行。相對標(biāo)準(zhǔn)品是只知道樣品中 DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)品，典型 的做法是將一個已知 pg數(shù)的樣品做一系列梯度稀釋。Ct值比較法是利用 Ct值與起始DNA濃度的對數(shù)成反比的數(shù)學(xué)關(guān)系，來計算不同樣本之 間的相對百分比，其計算公式是相對含霾（） =100%絕對定量的數(shù)據(jù)易于理解，但是絕對標(biāo)準(zhǔn)品的制備和測定其DNA含量比較困難。有許多商業(yè)性的標(biāo)準(zhǔn)品試劑盒供選購，可以解決這種困難。 相對定量的標(biāo)準(zhǔn)品容易在實驗室里自己制備，但是數(shù)據(jù)處理比較麻煩，對實驗數(shù)據(jù)的解釋有一

14、定難度。13. 定量PCR基因表達(dá)的實驗數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？總的來說，有三個層次的校正是必須要做的。首先，參比信號校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX，這樣由于反應(yīng)總體積的差異、所在孔的位置不同、 試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號波動都能 夠被扣除，使數(shù)據(jù)真正反映 PCR進(jìn)程。ROX校正能夠極大地改進(jìn)定量的精確度，提高重復(fù) 管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。其次，內(nèi)對照校正。實驗中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來自不同數(shù)目的細(xì)胞，所以將實驗結(jié)果校正到每個細(xì)胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同時定量一個內(nèi)對照基因 （如18S RNA基因）

15、，然后IL-2/18S。 內(nèi)對照校正使不同樣品的實驗數(shù)據(jù)可以相互比較。第三，計算相對于基準(zhǔn)樣品 (Calibrator)的相對基因含量。比如研究處理和未處理的、0小時和6小時的、正常和患病的之間的基因表達(dá)的差別，則需要計算處理侏處理、6小時/0小時、患病/正常。14. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對定量的數(shù)據(jù)應(yīng)該怎么處理？假設(shè)實驗的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用的內(nèi)對照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測定結(jié)果都是總 RNA的pg數(shù)，數(shù)據(jù)的處理方法見下表：IL-2甚因Cpg 總 RNA)1SS忌慶1(pg 總 RNA)Normalized IL

16、-2Calibrated IL-2表達(dá)(P卜時103?52152.2.0 x IO3124小時2320451235.1 x 10a2.5548 "卜時4048017(50,5 k 10a0.2515. 什么是Ct值比較法？數(shù)據(jù)怎么處理？Ct值與起始DNA濃度的對數(shù)成反比：魄兀煽禺譏)餾凡如果(1)不同管之間的PCR反應(yīng)效率相同；(2)這些PCR的反應(yīng)效率接近100%，可以從 上面的公式推出相對含量(X01/X02) = 2 "AA CT假設(shè)實驗的目標(biāo)是研究藥物處理后0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達(dá)量的變化，所用內(nèi)對照是 18S RNA基因。IL-2和18S

17、RNA的測定結(jié)果都是 Ct值，而沒有通過 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定總 RNA的pg數(shù)。數(shù)據(jù)的處理方法見下表：IL-2平均Ct)18S(平均cyNormalizedIL-2 表ii(ACi)Calibrated1L 2 表達(dá)(MCt)倍數(shù)差別(2iiCT)0小時24.512.6-11.9Ci1対小時25. fl12.5-13.1-1.22.348小時25.411.6-13.&-1 90.2716. 每個反應(yīng)管中可以加入多少種探針？每個反應(yīng)管中可以加入的探針數(shù)目，取決于儀器、軟件、試劑和實驗設(shè)計等幾個方面。首先是儀器的硬件構(gòu)成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下，全波長檢測的定量PCR儀如激光

18、管-CCD類型對于探針的數(shù)量實際上是沒有限制的。如果信號的采集要通過濾色片，那么探針的數(shù)量取決于濾色片的數(shù)目，增加探針需要增加或改變?yōu)V色片。改動儀器的結(jié)構(gòu)通常很困難。 以AB公司的儀器為例，7900和7700是激光-全波長檢測的，7000、 7300是4色濾色片的，7500是5色濾色片的。其次是化學(xué)上的可能性。 不同的熒光基團(tuán)要組合到一起， 在同一反應(yīng)管內(nèi)使用， 必須其 激發(fā)波長既相對靠近又不能靠得太近， 既保證信號激發(fā)的效率又保證信號不重疊干擾， 能夠 區(qū)分清楚。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的熒光基團(tuán)種類有限， 滿足這樣條件的分子組合更少。 目前的最佳組合 只能達(dá)到每組 4 到 5 種熒光的水平。第三是實驗方

19、案的設(shè)計和選用的探針類型。 定量 PCR 實驗必須使用 ROX 校正熒光， 占 去一種熒光； TaqMan 探針的淬滅基團(tuán) （TAMRA） 也要占用一種熒光， 對于 4 色檢測的儀器來 說，只剩下 2 種熒光可以標(biāo)記探針， 對于 5色檢測的儀器還有 3 種熒光可以使用。 如果將探 針改用 TaqMan MGB 探針，由于它的淬滅基團(tuán)是不發(fā)熒光的，比之 TaqMan 探針就可以多 1 種熒光用于標(biāo)記探針。如果實驗要求不高，不做 ROX 校正（ AB 公司不推薦這樣做），還 可以再多一種熒光用于標(biāo)記探針。第四是研究應(yīng)用本身的要求。如果研究 SNP 和基因突變，因為絕大多數(shù)人類基因是 2 態(tài)的，只存在兩種等位基因， 2 條探針已經(jīng)足夠。 如果研究基因表達(dá)， 通常是兩兩比較居多， 比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個內(nèi)對照， 3 色也就足夠了。最后是成本控制方面的要求。 多重定量的目的一是提高數(shù)據(jù)精確度， 二是節(jié)省反應(yīng)成本。 同時測定的基因越多，成本也越低。但是加入 4-5 種探針，就要同時加入 8-10 條引物。在 引物設(shè)計的時候要考慮到盡量減少這些引物之間的競爭和抑制等多種干擾， 平衡各對引物之 間的 PCR 效率。雖然這是可以做到的，但是要花費(fèi)大量時間、人力和物