月季組織培養(yǎng)17頁

1、目錄摘要·················································&#

2、183;·4前言················································

3、;···4綜述··············································&#

4、183;····51外植體··········································51.1取材部位1.2取材時間

5、1.3取材大小2. 消毒···········································83. 接種方式···

6、3;···································84.培養(yǎng)基·············

7、3;····························94.1基本培養(yǎng)基4.2激素4.2.1不同激素對誘導愈傷組織的影響4.2.2不同激素對繼代培養(yǎng)的影響4.2.3不同激素對生根培養(yǎng)的影響4.3糖濃度的影響4.4無機鹽4.5瓊脂5.培養(yǎng)基的配置······

8、;····························136.培養(yǎng)條件····················

9、83;·················147防褐化·······························

10、83;······14技術路線與實驗設計································15參考文獻········

11、3;·································17摘要：為了進行月季組織培養(yǎng)實驗，我們查閱了相關文獻，從多個方面了解影響月季組織培養(yǎng)的因素，如外植體的取材部位、時間、大小、消毒、接種方式、不同階段激素的配比、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件等，以期在實驗中調(diào)

12、控月季組培的環(huán)境，確保實驗順利進行?；谖覀兿胩骄考に貙M織培養(yǎng)中細胞的脫分化和再分化的作用這一想法，我們的設計了以濃度、濃度、外植體部位為影響因素的正交實驗（L9（3），并考察NAA與6BA的交互作用。同時，我們還以接種方式作為單因素考察其對愈傷組織誘導的影響。關鍵詞：組織培養(yǎng)、影響因素、正交前言在閱讀了植物組織培養(yǎng)的相關文獻資料后，我們設計了此次組織培養(yǎng)實驗方案，考察細胞分裂素濃度、生長素濃度、接種方式、取材部位因素對愈傷組織的形成有何影響，期望尋找出誘導月季愈傷組織的最佳條件；同時探究由愈傷組織誘導出芽及生根所需的最佳濃度配比。并在月季組織培養(yǎng)過程中，掌握外植體消毒方面要注意的事項，整個

13、培養(yǎng)過程中培養(yǎng)條件的選取與控制，實驗過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象的觀察記錄以及分析，在這個過程中不斷加強理論與實踐的聯(lián)系，深化對理論知識的理解。對于外植體選擇，我們采用了以往研究者的做法，即選用帶腋芽的枝條。但是，我們的不同之處在于，我們還保留了一部分剛好能包裹住腋芽的葉柄。這樣做的目的是為了在消毒時避免芽受到太大損傷。參考論文中防褐化多用抗氧化劑和其他抑制劑，減輕外植體在組培中的酶促褐變，我們根據(jù)生理生化原理，考慮到酶活性與溫度有關、以及外植體內(nèi)的酚類物質(zhì)含量有關，因此需對外植體做如下處理：接種前先將外植體用低溫水流沖洗24小時；選擇晴朗天氣采摘外植體。激素濃度的選擇：由于不同種的月季對濃度的需求有差異

14、，我們是以前人得到的最適濃度為中間值，設置了不同濃度，試圖探究我們所培養(yǎng)的月季品種所需的最適宜濃度。培養(yǎng)條件：我們決定采用一般植物組織培養(yǎng)的條件，如溫度控制在24左右，光照時間為12h/天?？紤]到光對褐化的影響，我們計劃接種后暗培養(yǎng)一周后，再光照下培養(yǎng)。培養(yǎng)基的配制方面，我們著重考慮pH對培養(yǎng)基的影響。通過查閱文獻，激素加入MS培養(yǎng)基后將pH調(diào)為6，配置鐵鹽過程中同樣注意pH的調(diào)節(jié)。 組織培養(yǎng)的每個步驟均有可考察因素，很多細節(jié)需要把握，在實驗過程中不斷吸取經(jīng)驗和教訓，學以致用。因此我們希望通過實驗深入學習植物組織培養(yǎng)的基本過程和基本方法，了解組培的經(jīng)濟意義和實用價值，能夠廣泛應用于生產(chǎn)，進一步

15、實現(xiàn)理論與實際應用的相互轉(zhuǎn)化。綜述1. 外植體1.1取材部位外植體一般選取生長健壯的當年枝條的飽滿而外萌發(fā)的側(cè)芽1。李青等分別選取一年生枝條的冬牙當年生枝條腋芽作為外植體，相同條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)越冬牙的成活率較高，且從接種到萌芽時間短，生長快，在后代繁殖中植株健壯1。本實驗材料取自盆栽的豐花月季，剪取腋芽尚未萌發(fā)的枝條，去除莖段兩端各2毫米選芽以莖段中芽為最好，因為接種后，中段芽第5 天左右就能萌發(fā)，而基部和稍部的芽往往遲至15 天才萌發(fā)2。用“和平”品種月季的枝條，均等分為6 段，取每段的一個側(cè)芽培養(yǎng)在無激素的MS 基本培養(yǎng)基上，2-3 天即可見接近枝條最頂端和緊挨著枝條基部的芽發(fā)育最慢，而枝條

16、中的芽發(fā)育比較快2。不同外植體的脫分化能力不同，誘導出愈傷組織的頻率和愈傷組織的狀態(tài)也存在較大差異。以葉片和莖段為外植體誘導得到的形態(tài)上差異不明顯，愈傷組織多數(shù)呈乳黃色部分呈綠色，白色，松散，程度不一，葉片誘導率稍高于莖段能達到90%以上，選取好的經(jīng)2-3代的繼代培養(yǎng)可獲得較疏松的，適宜于細胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織；葉柄為外植體主要是在基部及切口處形成愈傷組織，接種后生長極其緩慢，接10D時可見邊緣切口處發(fā)生褐化，得到愈傷組織少；因此認為葉片和莖段是誘導愈傷組織和進行細胞懸浮培養(yǎng)的理想材料3。1.2取材時間外植體的取材部位對芽的萌發(fā)也有影響。外植體的取材時間及培養(yǎng)所需時間對月季嫩莖的發(fā)育和增殖也有

17、影響。對于“Bulgarian rose”而言，選取外植體的最佳時間是冬季4。外植體的取材時間及培養(yǎng)所需時間對月季嫩莖的發(fā)育和增殖也有影響。對于“Bulgarianrose”而言選取外植體的最佳時間是冬季(1-3月)(321；而“Improvedfire”月季的培養(yǎng)時問以28d繼代一次較好，超過28天，莖的數(shù)目就不再增加了5。1.3取材大小取無菌苗葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，葉柄，莖段切成小段3。外植體很小時，有利于培養(yǎng)脫毒的植株對月季的杉樹壞疽環(huán)斑病毒(Prtmus necrotic ringspot virus，PNRSV)可通過莖尖培養(yǎng)的方式達到脫毒的目的，如果單純?yōu)?/p>

18、了快速繁殖，可用大的莖尖或莖段進行離體培養(yǎng)，這時外植體的大小決定了莖尖的成活比例。一般說外植體愈大，成活率愈高，成苗時間愈短。莖尖在1-10mm長短時，對形成多芽苗最有效，不但多芽苗所占百分率高，而且每個莖段的側(cè)枝數(shù)也比較多。外植體的大小同時影響外植體自身的發(fā)育和月季組培苗莖的增殖，外植體的長度在9.0-10.0mm，直徑在3.0-3.5mm范圍時莖的增殖和發(fā)育是最好的。但Horn對某幾種月季進行微繁實驗時發(fā)現(xiàn)外植體的大小對莖的增殖、葉片數(shù)目沒有影響，其他一些研究者對只有個莖節(jié)的“Sweet Promise”進行組織培養(yǎng)中得到了類似的結(jié)論5。 2. 消毒 接種材料為當年抽生側(cè)芽飽滿的幼嫩莖段，

19、自來水沖洗10-20min；75%或70%乙醇浸泡30s,0.1%升汞表面消毒3min,無菌水沖洗4-5次，將側(cè)芽切下接種到MS培養(yǎng)基上，獲得無菌苗備用3。 取回枝條用自來水沖洗干凈，無菌條件下用70%酒精表面消毒30-40s，再用0.1%Hgcl2溶液滅菌5-10min，最后用無菌水沖洗3-5次1。 組織培養(yǎng)中的污染源大致可分為三類：外界環(huán)境污染，植株內(nèi)生菌和外植體處理不當。因此，可在試驗過程中每隔一段時間用巴斯德消毒液噴灑培養(yǎng)室；對培養(yǎng)基，工具的高壓滅菌要徹底；試驗員要在進入超凈太之前用1.0%巴斯德消毒液擦手；接種時工具和手不要在培養(yǎng)基上方攪動，以防止細菌落入其中；探索適宜的消毒處理時間

20、。此外，防止細菌特別是內(nèi)生菌污染，很重要的措施是在培養(yǎng)基中加入抗生素63.接種方式 在外植體的接種中采用了垂直接種，斜向上45度接種，水平接種和反轉(zhuǎn)接種4種方式，發(fā)現(xiàn)垂直接種和斜向上45接種，水平接種和反轉(zhuǎn)接種4種方式，發(fā)現(xiàn)垂直接種和斜向上45度接種是最佳的接種方式，腋芽再生芽數(shù)多，且生長健壯，這可能與植物的生長極性有關1。4.培養(yǎng)基4.1基本培養(yǎng)基眾多培養(yǎng)基中以 MS 培養(yǎng)基的效果為最好，廣泛用于月季的離體快速繁殖中。對 MS 培養(yǎng)基的成分及物理性能進行合理的選擇會提高月季組織培養(yǎng)的成功率4莖段培養(yǎng)階段，將帶有腋芽的嫩莖接種到不添加任何激素類物質(zhì)的 MS 和 1/2MS 培養(yǎng)基上，兩周后，M

21、S 培養(yǎng)基上的腋芽生長，而在 1/2MS 培養(yǎng)基上的腋芽幾乎不萌發(fā)或發(fā)育不良4。MS培養(yǎng)基上愈傷個數(shù)最多達到32個，誘導率為35.5%；培養(yǎng)基上愈傷個數(shù)達到27個，誘導率為30%，培養(yǎng)4d后外植體葉的一端開始膨大，葉片切口處可見少數(shù)綠色愈傷組織；大小如沙粒，柔軟，結(jié)構(gòu)密實。而WPM，White在培養(yǎng)第二天外植體即有部分開始脫色變白，第三天有部分變黃，大部分褐變，最后枯死?？梢奙S，B5兩種培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導效果明顯，結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基對葉片誘導程度可排列為MS>B5>WPM>White.94.2激素4.2.1不同激素對誘導愈傷組織的影響誘導培養(yǎng)基以為基本培養(yǎng)基，附加適量

22、的細胞分裂素6-BA和NAA。NAA增加至0.1mg/L時，6-BA濃度的高與低已對增殖系數(shù)不產(chǎn)生明顯影響。最適的側(cè)芽誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5-3.0mg/L和NAA0.01-1.00mg/L，且培養(yǎng)基中添加蔗糖有增加叢生芽數(shù)量的作用1。激素及激素濃度直接影響著愈傷組織的狀態(tài)，質(zhì)地和分散性。單獨使用細胞分裂素沒有愈傷組織形成，對正交研究進行極差分析，各因素對愈傷組織誘導率的影響作用：2,4-D濃度KT濃度BA濃度NAA濃度。最佳愈傷組織誘導組合是：KT2mg/L NAA2mg /L+2,4-D 1 mg /L3。BA用量及側(cè)芽在莖段上的位置對側(cè)芽發(fā)育的影響。在不同濃度BA的MS培養(yǎng)基上

23、，BA含量為0.03-0.3毫克/升的培養(yǎng)基促進側(cè)芽的發(fā)育，若超過0.3mg/L則延遲芽的發(fā)育，但對于莖段中部的芽影響較小7。不同生長素種類和濃度對月季生根和移栽成活率的影響。以“彩云”為材料，用NAA 誘導生根和提高移栽成活率效果最好，濃度為100ppm 為宜，現(xiàn)在IAA 誘導生根和提高移栽成活率效果并不理想，其濃度只能在1mg/L 以下,超過時對生根的促進作用已不顯著,反而大幅度降低移栽成活率。NAA和IBA對月季的誘導生根都有較好的效果,在1/2MS培養(yǎng)基附加NAA或IBA0.1-1.5mg/kg均可誘導不定根的產(chǎn)生,生根63.3%-93.3%8。4.2.2不同激素對繼代培養(yǎng)的影響低濃度

24、的6-BA有利于不定芽的增殖，濃度過高則抑制不定芽的增值，適量NAA有利于芽和葉生長。在NAA濃度相同而BA濃度不同的培養(yǎng)基中，隨BA濃度的升高，芽苗的增殖系數(shù)也相應提高。此外，增殖系數(shù)還與品種有關。從增值倍數(shù)、葉片數(shù)。再生芽長勢等綜合因子來看，MS+BA0.5-02.0mg/L+NAA0.01-0.05mg/L是最適的不定芽增殖培養(yǎng)基1。NAA濃度為0.5mg/kg時對生根是較為適宜的濃度,而不必向在誘導植物芽分化時必須按一定比例配比細胞分裂素與生長素混合使用8。將上述無菌芽從原莖段上切下轉(zhuǎn)接到MS+BA1-2+IAA0.1-0.3或MS+BA1-2+NAA0.01-0,1的培養(yǎng)基上促使嫩莖

25、長出更多的側(cè)芽，原莖段棄去。繼代增殖培養(yǎng)基每升用蔗糖30克7。4.2.3不同激素對生根培養(yǎng)的影響多數(shù)實驗采用的培養(yǎng)基為1/2MS(大量元素減半）。Skivrin等在用“Forever yours ”月季做生根試驗時發(fā)現(xiàn)，采用1/4MS培養(yǎng)基，不加生長素可以促進生根。利用1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭誘導生根，生根率最高90%，且隨著隨著活性炭百分比的加大，生根率逐漸下降。活性炭的加入能顯著促進生根量和根的長勢，但又含活性碳的培養(yǎng)基只見較少發(fā)根，且根細弱，說明植物激素對于生根是必不可少的。MS培養(yǎng)基中鹽濃度過高，特別是氮含量過高會導致生根不適應，所以需減少無機鹽用量1。4.3糖濃度的影

26、響不同類型的月季，其組培要求的碳源和糖濃度有所不同。月季組培最常用的碳源是蔗糖，在豐花月季的組織培養(yǎng)中，初代培養(yǎng)的蔗糖含量為5%，繼代培養(yǎng)的蔗糖含量為3%時培養(yǎng)效果最好9。4.4無機鹽試驗證明，全量的MS無機鹽對莖增殖效果最好5。無機鹽濃度和含糖量對月季生根的影響。采用較低濃度的無機鹽對月季生根效果較好。但糖濃度不可降低。否則削弱苗的生長勢，試驗證明，1/2MS+30克/升蔗糖利于生根10。Hyndman認為 MS 培養(yǎng)基中的氮鹽含量是影響月季生根的主要因素，把 MS 培養(yǎng)基中氮素含量從 60mmol/l減少到 7.5mmol/L（相當于 1/8MS 中的氮素含量）時，嫩莖生根效果良好，保持

27、7.5mmol/L的氮素含量，MS 培養(yǎng)基中其它無機鹽的濃度減少到原配方的1/16，對生根沒有影響；但氮素含量過高會引起月季組培苗的生根不適4。4.5瓊脂 培養(yǎng)基中的固化支持物，并非完全不起作用的物質(zhì)，它含有能影響外植體的物質(zhì)，培養(yǎng)基中大約有十分之九的固化支持物是瓊脂，月季組織培養(yǎng)中，瓊脂的種類和產(chǎn)品質(zhì)量的差異會影響芽的發(fā)育與增殖：月季的側(cè)芽在純凈的瓊脂BD上發(fā)育較好，而在Merck1614和不純凈的BD上發(fā)育較差，但目前尚未有較好的方法檢測瓊脂的質(zhì)量?，F(xiàn)在已經(jīng)有人成功地利用其他支持物替代價格昂貴的瓊脂，月季試管苗在蛭石作固化物的培養(yǎng)基上的生根率幾乎與瓊脂作固化物的培養(yǎng)基上的一樣，而移栽成活率

28、卻高于瓊脂作固化物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的月季 10 。5.培養(yǎng)基的配置配置母液和激素時應注意的事項：（1）配置母液時，各種化合物一定要單獨充分溶解后再倒入容量瓶中定容，避免其中的離子之間發(fā)生沉淀(2）激素一般難溶于水，所以生長素用少量0.1mol/L NaOH溶液，少量0.1mol/L HCL溶解，然后用蒸餾水或去離子水定容6。6.培養(yǎng)條件（溫度、光照、PH、無機鹽）誘導和繼代培養(yǎng)均在黑暗條件下進行，培養(yǎng)溫度為25，3-4周更換一次培養(yǎng)基。3次重復。培養(yǎng)溫度21最好最高不超過25，有晝夜溫差，生根階段對溫度變化非常敏感，生根溫度保持在21度左右，光照10-12h/d，光強800-1200LX。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

29、,在不同的溫度下其生長情況有很大的差異。在21時嫩莖生根數(shù)目最多,而且嫩莖生根的百分率也最高,然而在溫度低于或高于21時,嫩莖生根數(shù)目均較21時減少,同時嫩莖生根的百分率降低,呈現(xiàn)出一個明顯的生根數(shù)量變化趨勢8。7防褐化 對于較易褐化的植物，在培養(yǎng)過程中應在接種后進行一段時間的遮光處理或暗培養(yǎng)；縮短培養(yǎng)基更換時間，接種后1-2天即轉(zhuǎn)至新鮮培養(yǎng)基中。此外，在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和其他抑制劑，可以有效地減輕外植體在組培中的酶促褐變，因此可選擇在培養(yǎng)基中加入抗生素（如VC），活性炭 等6。外源激素2mg/L 6-BA易引發(fā)褐變，應用時可考慮少量添加。2mg/L Kt和2mg/L NAA對組織褐變影響不大，考慮使用；使用乙醇消毒劑時，對外植體泡的時間不能過長，建議以5-10為佳；全光照條件培養(yǎng)容易誘發(fā)褐變，采用仿人工氣候條件培養(yǎng)較其他條件培養(yǎng)科有效抑制褐變的發(fā)生，條件允許時推廣使用4。雖然我們培養(yǎng)的是木本植物，防褐化也是我們要注意的問題。特別是王的關于外源激素2mg/L 6-BA易引發(fā)褐變，觀點新穎值得重視。我們可以在分析實驗結(jié)果時，把褐變和6-BA濃度關系進行簡要分析。 外植體的大小對褐變的發(fā)生及褐變程度有一定影響. Bonga認為外植體越小,切面與體積的比率越大，傷害及褐化的程度就越大;相對