血清標(biāo)本溶血對(duì)血液生化指標(biāo)的影響

1、血清標(biāo)本溶血對(duì)血液生化指標(biāo)的影響45血清標(biāo)本溶血對(duì)血液生化指標(biāo)的影響；李大磊1，史文華1，劉志峰1,2；1山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心；2煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院山東省煙臺(tái)市264005；摘要：目的探討血清標(biāo)本溶血對(duì)血液生化檢驗(yàn)結(jié)果的影；關(guān)鍵詞：溶血；生化檢驗(yàn)；Theinfluenceofhemolysiso；LIDa-lei1，SHIWen-hua1，LI；1ShandongEngineerin血清標(biāo)本溶血對(duì)血液生化指標(biāo)的影響李大磊1，史文華1，劉志峰1,21山東省天然藥物工程技術(shù)研究中心2煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院 山東省煙臺(tái)市 264005摘要：目的 探討血清標(biāo)本溶血對(duì)血液生化檢驗(yàn)結(jié)果的影響，為藥物安全性評(píng)

2、價(jià)的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析提供一定的依據(jù)。方法 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)10份正常大鼠血液標(biāo)本在溶血前與溶血后血清葡萄糖(GLU)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐（Cre）、尿素氮(BUN)、膽固醇(CHO)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、鈣（Ca+）、鎂（Mg+）、鈉（Na+）、鉀（K+）、氯（Cl-）的值，并進(jìn)行了比較與統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 溶血后AST、TBIL 、ALT、K+的值比溶血前的值高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Cre的值比溶血前的值低，統(tǒng)計(jì)差異顯著；GLU、TP、ALB、BUN、CHO、ALP 、Ca+ 、Mg+ 、Na+ 、

3、Cl-的值溶血前后未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變。結(jié)論 溶血對(duì)血清AST、TBIL 、ALTK+、Cre有明顯的干擾影響，提請(qǐng)?jiān)诜治鰷y(cè)定結(jié)果時(shí)注意溶血情況。關(guān)鍵詞：溶血；生化檢驗(yàn)；The influence of hemolysis on sericem biochemical testsLI Da-lei1，SHI Wen-hua1，LIU Zhi-feng1,21Shandong Engineering Research Center for Natural Drugs, Yantai, Shandong 2640032School of Pharmacy, Yantai University,

4、 Yantai, Shandong 264005Abstraet：Aim To observe the influence of hemolysis on the results of biochemical tests. Methods The blood collected from the rat divided into 2 samples, one of which is to process hemolysis serum, the other is to process normal serum. The serum biochemical data were detected

5、respectively, which include glucose(GLU), alanine aminotransferase(ALT), aspartateaminotransferase(AST), total protein(TP), albumin(ALB), creatinine(Cre), Blood uric nitrogen (BUN), cholesterol (CHO), alkaline phosphal ase (ALP), total bilinibin(TBIL ), calcium (Ca+), magnesium (Mg+), natrium(Na+),

6、kalium (K+), chlorin(Cl-). The data were treated withpaired-test. Resluts The level of serum AST, TBIL, ALT and K+ increased in hemolysis samples than normal. The level of serum Cre in hemolysis samples is lower than normal. There is no significant difference in serum GLU, TP, ALB, BUN, CHO, Ca+, Mg

7、+, Na+ and Cl- . Theseresults indicate that hemolysis could interfere the results of serum AST, TBIL, ALT, K+ and Cre. The significance of hemolysis on serum biochemical analysis should be regarded in drug safety evaluation.Key words ：Hemolysis；Biochemical analysis在新藥安全性評(píng)價(jià)的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中，血液生化指標(biāo)的分析對(duì)藥物毒性作用的了

8、解與毒作用靶器官的判斷具有重要的意義，是評(píng)價(jià)藥物毒性的重要依據(jù)之一。長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的血液生化分析具有其特殊性，例如動(dòng)物尤其是小動(dòng)物的采血是不可重復(fù)的；血液生化測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析受數(shù)據(jù)資料數(shù)的限制等。在工作中往往因各種原因?qū)е聵?biāo)本溶血，溶血樣本不參與結(jié)果分析往往使統(tǒng)計(jì)資料數(shù)偏少，因此血清標(biāo)本溶血時(shí)主要影響哪些指標(biāo)，測(cè)定結(jié)果是否可以參與統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的分析，是所有藥物安全性評(píng)價(jià)工作者需要了解的問(wèn)題。為了能及時(shí)客觀地分析生化指標(biāo)的變化是否具有臨床意義，應(yīng)當(dāng)詳細(xì)了解標(biāo)本溶血對(duì)各項(xiàng)血液生化指標(biāo)的影響。目前國(guó)內(nèi)尚未見標(biāo)本溶血對(duì)藥物安全評(píng)價(jià)所要求的十幾項(xiàng)血清生化指標(biāo)影響的報(bào)道，本文觀察了藥物安全評(píng)價(jià)長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中需

9、要測(cè)定的生化指標(biāo)在標(biāo)本溶血前后檢測(cè)結(jié)果的變化，旨在為標(biāo)本溶血時(shí)血液生化結(jié)果分析提供一定的參考依據(jù)，盡量增加生化測(cè)定數(shù)據(jù)的可利用性。1 材料與方法1.1 動(dòng)物來(lái)源SD大鼠，清潔級(jí)。由山東綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為：魯動(dòng)質(zhì)字D20021133。1.2 儀器與試劑AUTOLAB全自動(dòng)生化分析儀（AMS，意大利）。血清電解質(zhì)分析儀(MEDICA，美國(guó)，EASYLYTE PLUS)，試劑原裝。血糖（GLU）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）、膽固醇（CHO）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）

10、、鎂、鈣血液生化分析試劑盒，均購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。1.3 溶血的血清標(biāo)本的制備取SD大鼠10只，雌雄各半。禁食不禁水12小時(shí)，用水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈取血6ml，分別注入兩支干燥試管各3ml。其中一支讓其自然凝固，另一支在血液凝固前用金屬棒攪拌使其溶血，然后以3 000 r*min-1離心10min，取上清液分別為未溶血與溶血的血清標(biāo)本。1.4 生化指標(biāo)的測(cè)定用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血清葡萄糖(GLU)、連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)與谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、雙縮脲法測(cè)定總蛋白(TP)、溴甲酚綠法測(cè)定白蛋白(ALB)、苦味酸法測(cè)定肌酐（Cre）、兩點(diǎn)動(dòng)力法測(cè)定尿素氮(BUN)、酶比

11、色法測(cè)定膽固醇(CHO)、連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)、重氮法測(cè)定總膽紅素(TBIL)、鄰甲酚酞絡(luò)合酮比色法測(cè)定Ca+、二甲苯胺藍(lán)法測(cè)定Mg+的值，以上指標(biāo)均用AUTOLAB全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。用EASYLYTE PLUS測(cè)定血清電解質(zhì)Na+、K+、Cl-的值。2 結(jié)果溶血后AST、TBIL 、ALT、K+的值比溶血前的值高；Cre的值比溶血前的值低，GLU、TP、ALB、BUN、CHO、Ca+ 、Mg+ 、Na+ 、Cl-的值在溶血前后未見明顯改變（表1）。Table 1 The influence of sample hemolysis on biochemical tests （

12、X±SD）biochemical datumAST (IU/L)ALT (IU/L)T-BIL(mg/dl)K+(mmol/l)ALP(IU/L)Cre(mg/dl)GLU(mg/dl)Cl-(mmol/l)TP(g/L)ALB(g/L)BUN(mg/dL)CHO(mg/dl)Ca+(mg/dl)Mg+(mg/dl)Na+(mmol/l)3 討論3.1. 谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)人紅細(xì)胞中AST活性約為血漿中的40倍1。當(dāng)標(biāo)本溶血時(shí)，勢(shì)必引起血清中AST活性的升高，從而使溶血標(biāo)本的結(jié)果明顯高于未溶血標(biāo)本。AST主要是作為肝損傷的敏感指標(biāo)，Normal Serum 131.5±1

13、9.5 42.8±8.5 0.13±0.05 4.6±0.3 255.5±112.4 0.83±0.18 105.5±22.4 107.4±3.7 60.2±4.6 17.2±1.8 20.5±3.8 48.7±6.9 18.8±7.2 1.5±0.8 133.8±1.9 Hemolysis serum 247.7±27.4* 49.9±6.3* 0.49±0.18* 5.9±0.5* 243.1±108.

14、9* 0.61±0.19* 98.7±21.5* 109.0±2.6* 61.2±2.9 17.2±1.3 21.6±4.9 50.7±6.0 20.9±7.8 1.7±0.7 134.9±4.4 % 91.7 18.9 315.0 27.2 -5.1 -27.7 -5.1 1.5 2.1 0.8 4.9 4.6 27.0 42.1 0.8 Compared with normal serum *P<0.05; *P<0.01.測(cè)定結(jié)果的偏高會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，嚴(yán)重影響了藥物毒性的判

15、斷。故溶血標(biāo)本AST的測(cè)定結(jié)果不能用于統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，若出現(xiàn)溶血標(biāo)本，應(yīng)當(dāng)在報(bào)告中注明。3.2 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)細(xì)胞內(nèi)ALT含量比血漿中高約7倍，因此溶血后ALT含量測(cè)定的增高主要來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)ALT的大量釋放。可見與AST相比，ALT受溶血影響輕些，故對(duì)樣品的要求低一些，如果標(biāo)本溶血不很嚴(yán)重，可以參與統(tǒng)計(jì)資料的處理，但在分析結(jié)果時(shí)要注意考慮溶血的影響。3.3 總膽紅素(TBIL)中生北控生物科技股份有限公司的測(cè)定試劑盒是用重氮法測(cè)定總膽紅素的，最后生成紅紫色的偶氮膽紅素，主要在波長(zhǎng)為540nm560nm處有光吸收。而血紅蛋白在波長(zhǎng)540nm550nm處有光吸收2，恰與偶氮膽紅素的比色波長(zhǎng)相近

16、。因此溶血后紅細(xì)胞破裂時(shí)大量血紅蛋白進(jìn)入血清，勢(shì)必造成總膽紅素測(cè)定值的升高，是總膽紅素測(cè)定的正向干擾因素。此外，由于血紅蛋白與重氮試劑反應(yīng)形成的產(chǎn)物可破壞偶氮膽紅素，溶血對(duì)重氮法測(cè)定膽紅素同時(shí)存在負(fù)向干擾，使測(cè)定結(jié)果偏低，但該作用較輕微3，因此溶血后由于血紅蛋白對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾，膽紅素的測(cè)定結(jié)果往往偏高。3.4 鉀（K+）鉀是細(xì)胞內(nèi)液的主要陽(yáng)離子，約98的鉀存于細(xì)胞內(nèi)，紅細(xì)胞內(nèi)鉀濃度約為105mmol/L，而血清中僅有3.5 mmol/L5.4 mmol/L4。因此溶血造成血清鉀測(cè)定的增高主要來(lái)源于紅細(xì)胞內(nèi)中鉀的大量釋放。有報(bào)道表明血清游離血紅蛋白在 2.52.8g / L時(shí)血清鉀增高14%1

17、6%，血清游離血紅蛋白達(dá) 6.6g / L時(shí)血清鉀增高可達(dá)41%5，因此在分析血清鉀的結(jié)果時(shí)引起注意。3.5 肌酐（Cre）中生北控生物科技股份有限公司的測(cè)定試劑盒是采用苦味酸法測(cè)定Cre的。而苦味酸特異性較差，易受其它還原性物質(zhì)影響，主要是維生素C、酮體、丙酮酸等假肌酐干擾4。假肌酐物質(zhì)亦可與苦味酸形成顏色反應(yīng)，導(dǎo)致測(cè)定值發(fā)生偏差。這種假肌酐物質(zhì)紅細(xì)胞中最多，血清中較少，故溶血后紅細(xì)胞中假肌酐物質(zhì)的釋放是造成測(cè)定值發(fā)生偏差的主要原因。3.6 血清葡萄糖(GLU)中生北控生物科技股份有限公司的測(cè)定試劑盒是采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定GLU，葡萄糖氧化酶法的特異性較強(qiáng)，干擾物較少，而過(guò)氧化氫酶易受到其

18、它物的影響，如維生素C、谷胱苷肽均因能競(jìng)爭(zhēng)H2O2而導(dǎo)致負(fù)偏差4。3.7堿性磷酸酶(ALP)中生北控生物科技股份有限公司的測(cè)定試劑盒是采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定ALP的。連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定ALP是通過(guò)在405nm處連續(xù)監(jiān)測(cè)生成的黃色對(duì)硝基酚氧離子，根據(jù)單位時(shí)間內(nèi)吸光度的增加來(lái)算出ALP的活力，因此排除了血紅蛋白在波長(zhǎng)540nm550nm處光吸收的影響。故溶血樣本ALP測(cè)定結(jié)果降低的原因可能是紅細(xì)胞破裂逸出了抑制ALP或底物反應(yīng)的物質(zhì)。3.8 氯（Cl-）血漿中氯約為103mmol/L，紅細(xì)胞中氯約為4954mmol/L。溶血會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氯離子轉(zhuǎn)移到血清中，從而引起了血清氯離子測(cè)定值得升高。43.9溶血后對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響的項(xiàng)目主要包括總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、膽固醇(CHO)、Ca+、Mg+與Na+。溶血后測(cè)定結(jié)果與未溶血時(shí)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）?？赡茉蚴沁@些項(xiàng)目的測(cè)定方法受溶血影響不大，因此在新藥的安全評(píng)價(jià)時(shí)可以列入統(tǒng)計(jì)資料中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與結(jié)果判定。3.10 溶血原因及其防止高亞英6等認(rèn)為溶血的原因主要是操作不當(dāng)與抽血器具不合格造成的。結(jié)合我們?nèi)粘９ぷ鞣治?/p>