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1、. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA).目錄目錄一、二、 三、四、 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)概述酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)應(yīng)用場景酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)操作流程全自動酶免工作站.一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)概述)概述 基本概念: 抗原:抗原是指進入人或動物機體后,可刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答,從而引起動物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細(xì)胞,并能和抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。 抗體:是由抗原刺激動物的免疫系統(tǒng)后,由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生分泌的能和相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。 酶結(jié)合物:酶與抗體或抗原、半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物,它不僅具有抗體抗原
2、特異的免疫反應(yīng),還能催化酶促反應(yīng),顯示出生物放大作用。.一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)概述)概述 酶聯(lián)免疫吸附試驗,簡稱ELISA,是實驗室最常用的檢測方法。 酶是能夠催化化學(xué)反應(yīng)的特殊蛋白質(zhì),其催化效力超過目前所有人造催化劑。ELISA是將酶催化的放大作用與特異性抗原抗體反應(yīng)結(jié)合起來的一種微量分析技術(shù)。酶標(biāo)記抗原或抗體以后,既不影響抗原抗體反應(yīng)的特異性,也不改變酶本身的活性。因此ELISA具有準(zhǔn)確性高、檢測時間短、價格低廉、判斷結(jié)果有客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點,適合于大批標(biāo)本的檢測,廣泛應(yīng)用于食品安全檢測、醫(yī)療檢測以及免疫實驗分析等領(lǐng)域。.一、酶聯(lián)免疫吸附試
3、驗(一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)概述)概述基本原理: 抗原抗體的特異性結(jié)合以及抗原或抗體的酶標(biāo)記。 .一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)概述)概述 酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后,可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在,而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的,可根據(jù)已知濃度的抗原或抗體的顏色反應(yīng)的深淺繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并依此計算出未知樣品中抗體或抗原的濃度。 測定對象:可以是抗原也可以是抗體。.二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)應(yīng)用場景)應(yīng)用場景 1、食品、飼料: 農(nóng)藥殘留(有機磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥)、獸藥殘留(青霉
4、素、氯霉 素 、 慶 大 霉 素等)、添加劑(三聚氰胺、瘦肉精、孔雀石綠等)、真菌毒素檢測(黃曲霉毒素、赤霉烯酮、嘔吐毒素等)、微生物檢測(如金黃色葡萄球菌菌體細(xì)胞中的蛋白A等),等等;2、醫(yī)療衛(wèi)生: 檢驗科、腫瘤科、婦科、兒科、疾控中心、傳染病醫(yī)院、體檢中心、腫瘤醫(yī)院等(乙肝兩對半、甲(丙、丁、戊)型肝炎抗體、梅毒、艾滋病甲胎蛋白、性激素六項等)。3、畜牧行業(yè):豬口蹄疫、豬藍(lán)耳病、禽流感H5N1抗體、雞傳染性貧血; .三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAELISA)操作流程)操作流程試驗流程:樣品、標(biāo)準(zhǔn)品以及試劑準(zhǔn)備加樣孵育洗板顯色比色結(jié)果分析.三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(三、酶
5、聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAELISA)操作流程)操作流程例:飼料中黃曲霉毒素B1的檢測:樣品、標(biāo)準(zhǔn)品以及試劑準(zhǔn)備加樣(標(biāo)準(zhǔn)品/樣品,酶結(jié)合物)孵育,洗板加入底物溶液A、B加入終止液吸光度測量結(jié)果分析孵育.三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAELISA)操作流程)操作流程天平粉碎機電動振蕩器離心機移液器例:飼料中黃曲霉毒素B1的檢測.三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAELISA)操作流程)操作流程飼料中黃曲霉毒素B1的檢測:樣品、標(biāo)準(zhǔn)品以及試劑準(zhǔn)備加樣(標(biāo)準(zhǔn)品/樣品,酶標(biāo)試劑)孵育,洗板加入底物溶液A、B加入終止液光密度(OD)測量結(jié)果分析.三、酶聯(lián)免疫吸附
6、試驗(三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAELISA)操作流程)操作流程飼料中黃曲霉毒素B1的檢測:樣品、標(biāo)準(zhǔn)品以及試劑準(zhǔn)備加樣(標(biāo)準(zhǔn)品/樣品,酶標(biāo)試劑)孵育,洗板加入底物溶液A、B加入終止液光密度(OD)測量結(jié)果分析Or37孵育.三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAELISA)操作流程)操作流程飼料中黃曲霉毒素B1的檢測:樣品、標(biāo)準(zhǔn)品以及試劑準(zhǔn)備加樣(標(biāo)準(zhǔn)品/樣品,酶標(biāo)試劑)孵育,洗板加入底物溶液A、B加入終止液光密度(OD)測量結(jié)果分析孵育.三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAELISA)操作流程)操作流程飼料中黃曲霉毒素B1的檢測:樣品、標(biāo)準(zhǔn)品以及試劑準(zhǔn)備
7、加樣(標(biāo)準(zhǔn)品/樣品,酶標(biāo)試劑)孵育,洗板加入底物溶液A、B加入終止液光密度(OD)測量結(jié)果分析孵育.三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAELISA)操作流程)操作流程飼料中黃曲霉毒素B1的檢測:樣品、標(biāo)準(zhǔn)品以及試劑準(zhǔn)備加樣(標(biāo)準(zhǔn)品/樣品,酶標(biāo)試劑)孵育,洗板加入底物溶液A、B加入終止液光密度(OD)測量結(jié)果分析孵育.三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAELISA)操作流程)操作流程飼料中黃曲霉毒素B1的檢測:樣品、標(biāo)準(zhǔn)品以及試劑準(zhǔn)備加樣(標(biāo)準(zhǔn)品/樣品,酶標(biāo)試劑)孵育,洗板加入底物溶液A、B加入終止液光密度(OD)測量結(jié)果分析孵育.三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(三、酶
8、聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAELISA)操作流程)操作流程ELISA的比色測定主要由酶標(biāo)儀進行。此處強調(diào)以下幾點:(1)酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下,室溫宜在1530,測讀結(jié)果更穩(wěn)定。各種酶標(biāo)儀性能不同,使用前應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書。(2)比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙,然后將板正確放入比色架中,以免銹蝕酶標(biāo)儀比色架。(3)比色測定時,一定要注意酶標(biāo)儀的波長是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。.三三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISAELISA)操作流程)操作流程單波長或雙波長比色選擇的問題:所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定;而雙波長比色則在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次,最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非敏感波長下的吸光度值的差值。因此,雙波長比色測定具有能排除由微孔板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異性吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色干擾的優(yōu)點。.四、全自動酶免工作站四、全自動酶免工作站 1、加 樣 模 塊 2、孵 育 模 塊 3、洗 板 模 塊 4、讀 數(shù) 模 塊 5、控 制 模 塊(軟件) 全自動-從加樣、孵育、洗滌到數(shù)據(jù)處理打印報告都由儀器自動完成; 無污染-直接使用原樣本試管和原試劑瓶,消除生物污染和試劑污染; 高效率-一次性處理樣本量大;醫(yī)院計生站疾控中心.四、全自動酶免工作
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