哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

1、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)動(dòng)物基因工程原理特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于能夠指導(dǎo)蛋白 質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的0型 糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達(dá)產(chǎn)物在分 子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然 的高等生物蛋白質(zhì)分子。應(yīng)用領(lǐng)域哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺(tái)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中亦起了極為重要的作用。研究現(xiàn)狀部分蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)已從實(shí)驗(yàn)室研究邁向生 產(chǎn)或中試生產(chǎn)階段。-已有許多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá) 和大量制備、生產(chǎn)。如人組織型血纖蛋白酶原激活因子、 凝血因子VIII、干

2、擾素、乙肝表面抗原、紅血球生成激素、 人生長(zhǎng)激素、人抗凝血素川，集落刺激因子等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平從整個(gè)水平上看仍偏低， 一般處在雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體蛋白產(chǎn)率的下限，即 30 |ig/IO8細(xì)胞/24小時(shí)。其限速步驟可能是在工程細(xì)胞中重 組蛋白的分泌效率較低。、穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的篩選構(gòu)建目的基因的表達(dá)載體。確定受體細(xì)胞。確定篩選方法(抗生素的使用濃度)。轉(zhuǎn)染后48h,傳代鋪板(1 : 100)，加篩選藥物。 3-4d換液1次，直至存活細(xì)胞長(zhǎng)出島狀細(xì)胞簇，約2周?？寺∧退幖?xì)胞，檢測(cè)目基因的存在與表達(dá)。二、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（一）宿主細(xì)胞（二）表達(dá)載體的構(gòu)建（三）表達(dá)細(xì)胞株的基因共土廣

3、增和篩選方法（四河調(diào)控的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)展高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記 常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性正常的哺乳類動(dòng)物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特征：錨地依賴性：細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長(zhǎng)分裂血清依賴性：細(xì)胞必須具有生長(zhǎng)因子才能生長(zhǎng)接觸抑制性：細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長(zhǎng)便受到抑制形態(tài)依賴性：細(xì)胞稱扁平狀，并有長(zhǎng)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上述特征使得正常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存 活50代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長(zhǎng)，即單層細(xì)胞生長(zhǎng)。有 時(shí)，正常細(xì)胞會(huì)改變某些特征而越過(guò)生理臨界點(diǎn)，繼續(xù)增殖并 無(wú)限

4、制分裂，這種狀態(tài)稱為細(xì)胞系形成，此時(shí)的細(xì)胞成為細(xì)胞 系O高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的條件以高效表達(dá)外源基因?yàn)槟繕?biāo)的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞應(yīng)具 備以下條件：細(xì)胞系特征：?jiǎn)适Ъ?xì)胞接觸抑制和錨地依賴特征，便于大 規(guī)模培養(yǎng)。遺傳穩(wěn)定性：外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長(zhǎng)期 保存。合適的標(biāo)記：便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持。生長(zhǎng)快且齊：分裂周期短，生長(zhǎng)均一，便于控制。安全性能好：不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌。高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機(jī)理APH-氨基糖昔磷酸轉(zhuǎn)移酶G418APH 滅活 G418DHFR二氫葉酸還原酶氨甲喋噲DHFR變體抗氨甲碟吟HPH潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶潮霉素BHPH滅活潮

5、霉素BTK-胸腺卩密唳核昔激酶氨甲喋噲TK合成TMPXGPRT-黃瞟噲鳥(niǎo)瞟噲磷酸核糖霉酚酸XGPRT和成轉(zhuǎn)移酶GMPADA-腺瞟吟核昔脫氨酶腺瞟吟木酮糖昔ADA-滅活 Xyl-A宿主細(xì)胞常用的非淋巴細(xì)胞類有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、小倉(cāng)鼠 腎(BHK)細(xì)胞、COS細(xì)胞、小鼠NSO胸腺瘤細(xì)胞和小鼠骨 髓瘤SP2/0細(xì)胞等。不同宿主細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白其穩(wěn)定性和蛋白糖基化類型 不同，需根據(jù)要表達(dá)的目的蛋白選擇最佳的宿主細(xì)胞。常用的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)朋迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī) 模生產(chǎn)的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞主要還是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì) 胞（CHO）,其優(yōu)勢(shì)有如下幾個(gè)方面：遺傳背景清

6、楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國(guó)FDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞宿主細(xì)胞猴腎細(xì)胞(cos)是進(jìn)行外源基因瞬時(shí)表達(dá)時(shí)用途最廣的 宿主，其重組載件易于組建，便于使用，而且對(duì)插入DNA 的量或者采用基因組DNA序列的情況都沒(méi)有什么限制，便 于通過(guò)檢測(cè)表達(dá)情況來(lái)確證cDNA的陽(yáng)性克隆，也利于快 速分析引入克隆化cDNA序列中的突變。宿主細(xì)胞近幾年也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了幾種新的有較大應(yīng)用價(jià)值的細(xì)胞株：如來(lái)源于Madlin-Darb y犬腎的高分化內(nèi)皮細(xì)胞株(MDCK)。 Pei等用該細(xì)胞株表達(dá)分泌型的基質(zhì)金屬蛋白酶MMPI3,發(fā)現(xiàn) 高

7、表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞克隆可占轉(zhuǎn)染細(xì)胞的5%10%,其中一個(gè) 克隆的表達(dá)量可占細(xì)胞上清總蛋白的15%20%,在細(xì)胞單層 貼壁培養(yǎng)情況下表達(dá)量達(dá)10 mg/Lo對(duì)細(xì)胞株選擇性地進(jìn)行遺傳改造 BHK/V16細(xì)胞株是穩(wěn)定表達(dá)單純皰疹病毒(HSV)VP16蛋白的BHK細(xì)胞，由于VP16的轉(zhuǎn)錄激活作用，載體中的HSV早期啟動(dòng)子在該工程細(xì)胞中有很高的活性o已用該細(xì)胞株獲得了包括人組織纖溶酶原激活劑、生長(zhǎng)因 子等在內(nèi)的多種蛋白的高效穩(wěn)定表達(dá)。對(duì)細(xì)胞株選擇性地進(jìn)行遺傳改造基于腺病毒EIA蛋白可反式激活CMV啟動(dòng)子，Cockett等建 立了穩(wěn)定表達(dá)EIA的CHO細(xì)胞株，在該細(xì)胞中重組前膠原 酶的產(chǎn)量與CHO細(xì)胞相比增加

8、了 12倍；該細(xì)胞在多種抗體 的表達(dá)中亦取得滿意的結(jié)果。對(duì)細(xì)胞株選擇性地進(jìn)行遺傳改造對(duì)細(xì)胞其它特性的遺傳改造，包括細(xì)胞生長(zhǎng)周期 的調(diào)控、細(xì)胞的抗凋亡能力、細(xì)胞貼壁能力、蛋 白糖基化的模式等方面，亦有相關(guān)報(bào)道，其實(shí)際 應(yīng)用價(jià)值有待得到更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。真核表達(dá)載體哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的必要元件包括：一個(gè)高活性的啟 動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列和一個(gè)有效的mRNA翻譯信號(hào)。原核DNA序列，包括能在大腸桿菌中自身復(fù)制的復(fù)制子，便 于篩選含重組細(xì)菌的抗生素抗性基因，以及便于目的基因 插入的限制性酶切位點(diǎn)?？梢晫?shí)驗(yàn)需要加入標(biāo)志基因、內(nèi)含子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位 點(diǎn)等。4g>N§k bXhol Xba

9、rHind III Kpn I BamH I QstXI EcoR I EcoR V BstXINot I真核表達(dá)載體常用的標(biāo)記基因有胸腺激酶(tk)基因、二氫葉酸還原酶 (dhfr)基因新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶 (cat)基因等 dhfr還可作為共擴(kuò)增基因使外源基因的表達(dá)產(chǎn)物增加。當(dāng) 培養(yǎng)基中逐漸增加氨甲蝶吟(MTX)的濃度時(shí)，隨著細(xì)胞對(duì) MTX抗性的增加。dhfr基因與外源基因均明顯擴(kuò)增。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在不斷提高的選擇壓力下，dhfr及側(cè)翼序列能擴(kuò)增至上千個(gè)拷貝，大大增加目的基因的表達(dá)水平。真核表達(dá)載體啟動(dòng)子外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)與多種因素有關(guān)，主要 是啟動(dòng)子和增

10、強(qiáng)子的強(qiáng)弱以及它們之間的搭配。啟動(dòng)子需包含兩個(gè)識(shí)別序列：mRNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和TATA 盒。TATA盒位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25-30bp處，是引導(dǎo) RNA聚合酶在正確起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄所必需的序列，即保證轉(zhuǎn) 錄的精確起始。其他上游啟動(dòng)子元件常位于TATA盒上游 100200bp之間，其功能是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始頻率和提高轉(zhuǎn) 錄效率。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子受細(xì)胞類型的限制，在不同的細(xì) 胞系中有很大不同，因此需根據(jù)宿主細(xì)胞的類型 選擇不同的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以便于目的基因的高 效委達(dá)。目前常用的強(qiáng)啟動(dòng)子包括人巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng) 子(CMV-IE)V人延伸因子1 亞基啟動(dòng)子和Rous肉 瘤長(zhǎng)末端重復(fù)序列；Invitrogen

11、公司開(kāi)發(fā)的pcDNA、 pEF和pRL三種系列載體即分別是以這三種啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)。近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)了一些新的強(qiáng)啟動(dòng)子，如：人leukosiali n基因啟動(dòng)子和鼠3-磷酸甘油激酶1 (PGKI)基因啟動(dòng)子，活性與CMV-IE相當(dāng)。人泛素蛋白(ubiquitin)C基因啟動(dòng)子不僅具有較高的活性，而且比CMV-IEx PGK1等啟動(dòng)子有更廣泛的宿主細(xì)胞范圍，幾乎在轉(zhuǎn)基因小鼠的所有組織細(xì)胞中都具有較高活性。構(gòu)建雜合的啟動(dòng)子是獲得新啟動(dòng)子的一個(gè)重要途徑。 比如由人ubiquitin C啟動(dòng)區(qū)序列與CMV增強(qiáng)子組成 的雜合啟動(dòng)字、由SV40早期啟動(dòng)子和人I型T淋巴 細(xì)胞病毒LTR中的增強(qiáng)子序列（

12、R-U5片段）組成的 SR-a啟動(dòng)子的活性均與CMV-IE相當(dāng)；由雞卩-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子序列構(gòu)成的 雜合啟動(dòng)子不僅活性比CMVIE高，而且具有更 為廣譜的宿主細(xì)胞范圍。Novagen公司的pBacMam 表達(dá)系統(tǒng)即是以該雜合啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄。另一類雜合啟動(dòng)子是由活性很低的啟動(dòng)子與數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)錄激活 因子結(jié)合位點(diǎn)串聯(lián)而成，這些位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合 受細(xì)胞外小分子藥物的調(diào)控；這類啟動(dòng)子主要用作基因的 誘導(dǎo)表達(dá)。如Invitrogen公司的ecdysone (脫皮激素)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)， 其負(fù)責(zé)目的基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子是由敝休克蛋白啟動(dòng)子核心 序列(minimal promotor)和5個(gè)

13、E/GRE元件組成； Clontech公司開(kāi)發(fā)的Tet-off系統(tǒng)中的啟動(dòng)子則由CMV啟動(dòng) 子的核心序列和7個(gè)Tet阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)組成。這些啟動(dòng)子在誘導(dǎo)前后活性可相差4個(gè)數(shù)量級(jí)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中已發(fā)現(xiàn)存在大量在低氧環(huán)境中可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄 的基因，如編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅素加 氧酶-1等的基因，它們都有一個(gè)共同的順式作用元件 (CGTG ),有利于在亍或3,側(cè)翼區(qū)的低氧誘導(dǎo)作用因子-1 (HIF-1)和低氧反應(yīng)增強(qiáng)子(HRE)結(jié)合，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄， 在低氧濃度下可使重組蛋白大量表達(dá)。據(jù)報(bào)道紅細(xì)胞生成素啟動(dòng)子在1%氧濃度比在21%氧濃度下活 性增強(qiáng)100倍。這又是一種新的提高表達(dá)

14、量的作用機(jī)制。真核表達(dá)載體增強(qiáng)子常用的增強(qiáng)子有Rous肉瘤病毒基因長(zhǎng)末端重復(fù)序列和人巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子。 James等利用糖皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)的鼠乳房瘤病毒(MMTV)啟 動(dòng)子和鼠乳房瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(MMTV-LTR),在CHO細(xì)胞中表達(dá)分泌的堿性磷酸酶，產(chǎn)量為利用常規(guī)的SV40和CMV啟動(dòng)子的10倍，超過(guò)04mg/ml。內(nèi)含子某些內(nèi)含子有重要的基因功能調(diào)控序列，目的基因以基因 組形式克隆入載體能得到高表達(dá)。為增加轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性，表達(dá)載體中一般含有天然的或 人工合成的內(nèi)含子序列。 mRNA前體的剪切能夠促進(jìn)mRNA從胞核向胞質(zhì)的運(yùn)輸。外顯子和內(nèi)含子接頭每個(gè)外顯子和內(nèi)含子接頭區(qū)都有一 段高度保

15、守的一致序列(consensus sequence),即內(nèi)含子 5,末端大多數(shù)是GT開(kāi)始，3,末端大多數(shù)是AG結(jié)束，稱為 GT-AG法則，是普遍存在于真核基因中RNA的識(shí)別信號(hào)。轉(zhuǎn)錄終止序列真核基因的hnRNA的加工過(guò)程需要Poly A信號(hào)，在目的基因 3端加上PolyA,表達(dá)水平提高10倍以上。 SV40的早期和晚期PolyA.牛生長(zhǎng)激素基因PolyA.人工合成PolyA.or陽(yáng)IIH 吊eH INh e I 増迪I EcoR IMU/1 XiwlAccl Sfna I BstZi Waf I7 SV*1O Entianc&r7V| Carl/ Prcrfnoter pgl VECt

16、Df(363?cpjlnlron<. 肉陰 |SV40 LaiePoly(A) j6786B468969&707713714720724724mIntronCM.V L E,、EinharHner/iPrcfriDlerVector(tDOGhp)SV40 Laiesxily(A)Bgl.llfisrt»8 I10521O5S10631D69W?91D81W710881410081098Bc?rnH IT7丄|Xtol £TcoR IK腫I Xba H San Accl Sma I ferzi to iBgl.llBgl.llAmprSyntheticpoly

17、(A)BamHIon 1CMVEiihancer/PromoterpCl-neaVecto(5472bp)InlronSgllhPpolSV4O Laiepoly(A)SV40 Enhancer/Early ProiwlenT7 1NhelXholEcoRlMlul Xbal Sall Ac Cl SinaiNoilT3 TfisQ 196031 4202 1273 1Bgl.llIRES IRES (internal Ribosome entry site)內(nèi)部核糖體切入 位點(diǎn)，可從一個(gè)mRNA翻譯二個(gè)ORF。IRES位于小RNA病毒RNA5,非編碼區(qū)，約為450bp。 IRES可與它連接的

18、ORF同時(shí)翻譯，構(gòu)建雙順?lè)醋雍?多順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體。Bgl II,：13：, /Vn/I(209)(2939)9C0CGAGCTCGGATCGATATCTGCGGCCGCGTCGACGGgVTTCAGTGGATCCACh I* £mR V Not IEcoR I BamH I950CTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTAATTCGBstXI:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase I:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase

19、IMCS AT7 Promoter iora10910ffl1100hid:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase I:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase ITAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGMTTCACGCGTCGAGCANhe Xhol EcoRIMCSBT2 Promoter17201730174017E017TOXbal Sail Xma I / Not ISma I * Eag I:TOPO:TOPOIF Rci?i

20、 citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase I:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase IT7V5 epitope6xHis:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase I申il jjjflp%pcDNA3.1/V5-二His-TOPO*5.5 kb 封:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase IWCoriSee pulyliiikur sequen

21、ce nn ihe web.:TOPOIF Rci?i citrllb caviilcntt/ bound topDisiDnierase I分泌表達(dá)載體ATG Iqk Leader> HOCJI-II 一tnCL 一CCGOL1I -X巒 -工 ErsOQ-簽< -多 一 ZX 一ON -XSEg epitope (Hisk TAA哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的基因擴(kuò)增現(xiàn)象基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。氨甲喋吟（MTX）是動(dòng)物細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶CDHFR）的特異性抑制劑，細(xì)胞培養(yǎng)

22、物經(jīng)氨甲喋吟處理后，絕大多數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來(lái)的抗性細(xì)胞中，助fr基因均得以擴(kuò) 增。這些抗性細(xì)胞正是通過(guò)増加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶 的表達(dá)水平，從而抵消氨甲喋吟的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū) 域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dM基因本身，即與亦片基因相鄰的DNA區(qū)域同時(shí)被擴(kuò)增。哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因外源基因dhfrDHFR-MTX高效表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因GS-MSX高效表達(dá)系統(tǒng)谷氨酰胺合成酶(GS)能解除甲硫氨酸亞楓(MSX)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的毒害作用。先將帶有GS編碼基因的載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)

23、物細(xì)胞中，由于只有多拷貝的GS編碼基因才能抗MSX,所以在轉(zhuǎn)染過(guò)程中不必使用GS缺陷型的受體細(xì)胞,而且在正常的MSX濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是GS-MSX系統(tǒng)比DHFR-MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑第一個(gè)由重組哺乳動(dòng)物 細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)的醫(yī)用蛋白 是治療急性心肌梗塞的溶血 栓藥物：人組織型纖溶酚原 激活劑（tPA） °同樣采用 DHFR-MTX系統(tǒng)表達(dá)，受體 細(xì)胞選用CHO系統(tǒng)。目前，人 tPA cDNA終止子dhfr用該工藝路線生產(chǎn)的重組人tPA已經(jīng)商品化。此外，人tPA也可由重組大腸桿菌生產(chǎn)，但蛋白的重折疊效率低?？烧{(diào)控

24、的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)四環(huán)素（tet）調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)U!TJ勺相關(guān),加入或撤除四環(huán)素和四環(huán)素衍生物來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。 外源基因表達(dá)的水平與所加的Tc濃度在一定范圍 因而可通過(guò)控制tet的濃度來(lái)控制基因表達(dá)的水平。 應(yīng)用于研究基因不同水平的表達(dá)對(duì)細(xì)胸，個(gè)體發(fā)育的影響 有何不同。tetRAytRExpRB&sion RepressedTATAgene of intarast+ tetl)TMAgem of-爭(zhēng)一 8-03M-2-weA鷲応二£一 Hgrc-A*一二三匸w 一是弋 -i| pcDNAw5/T07 trh5ev iiotylinker set|iiencts mi she

25、 web.pcDNAP/TO/吋 1 也 AXkC 5.1 kb)-=&SxHb一一ulnQI I冬-OS -3< my A?ul z£ ug -=wg 二仝 f決< 一 ？-s£科E ptrwvr n nP Eor;pcDMA/TO ($.1 kb)-?一一-En$<一 w寸 pcDNAM/TO% Veck)rsI片Ihe major component ot' I he I REx Sy stem is the inducible expression plasmid. Expression oTyour gene of iniercs

26、l Irom llie inducible expression vector h controlled by the strong CMV promoter (Andersson el a!., 1989; Bosh art et al. 1985; Nelson et aL. 1987) into which 2 copies of the tel operator 2 (l'etO2) sequence have been inserted i n laiidein. I he TeiO2 sequences consisi ol' 2 copies of llie 19

27、 nucl已ul】ck sequence.5 -TCC CT AT C AGT GAT AG AGA-3r separated by a 2 base pair spacer (Hillen and Berens, 1994; I lillen et uL. 1983). Each 19 nucleotide TetO2 sequence serves as the binding site lor 2 molecules of the I et repressor. For niore in formation about the Tel operalor sequcnees and the

28、 speciHe features of each inducible expression vector, please reier to Ih 已 msinLial lor the vector vou are us ins.Figure 2 - High levels of induced expression achieved with the T-REx 1 SystemFigure 2 - High levels of induced expression achieved with the T-REx 1 SystemA.B.CSSL3d s-5_-aJy'sr 兀巴.r

29、Rsu 一 rs,dAnti莊陰I wesierjiPkj|MainAj 293 cells stably expiessing the wiracyellne repressor (丁 were irjnsiemly n<insfectft1 wiih a fRtxcAprussiiig ihe !ucZfiene (pcDM A"4/T0/fdrZj or a CMV-based expression plasmid (pcDNAF i/llis/fwX) consiiiuiivly expressing aLiciosidasc. Phiiein expression w

30、as induced by adding I jig/ml or leirjQ'dine for 2斗 hours, .iiivr which ciinp p-g.ilactosidasp ai rivitv was assayeil A cullnrr of stably cidiisfecitid single ceB "TR&T 2字3 chnvs weie stained for |i!-gala.ci;ci- d.w aciivify (B) prior io in duel ion .iiilI (Cj 24 hours i)osi-i.wnsUuUHMi

31、 widi 1 y/inl teiucycline.gwfifirtaraBt1. Ligate gene cf interact Into the inducible region vectorCotransfect this inducible expreGsion vector and pcDHAfi/TR1- into mammalian cells3. Add tetracycllrre to de re press the liybrldCMW/TetO2 promoter and induce expression of the desired gene4. Assay for6

32、Xpre6«d protein四環(huán)素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)成元件四環(huán)素阻遏子(Tet repressor protein,TetR)四環(huán)素操縱子(Tet opemtor DNA Sequence, TetO)單純皰疹病毒Vpl6轉(zhuǎn)錄活化區(qū)(Vpl6 activation domain,AD)四環(huán)素調(diào)控反式激活子(Tetracyeline-Contrcdled transactivator tTA)TetR與Vpl6組成融合表達(dá)蛋白。四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活子(tetracyline transcriptional activator, tTA) tTA靶位點(diǎn)由四環(huán)素操縱子的幾個(gè)拷貝42bp大小的串聯(lián)序

33、列和一個(gè)來(lái)自細(xì)胞巨化病毒(cytomegalovinasCMV)的立即早期啟動(dòng)子啟動(dòng)序列組成一個(gè)重組啟動(dòng)子，構(gòu)建成一個(gè)四環(huán)素應(yīng)答表達(dá)系統(tǒng)(a tetracycline-responsive express system,TRES)。0tTA反之，去DOX，tTA與TRE結(jié)合，達(dá).BDTebOffMU!四環(huán)素調(diào)控 反式激活子 tTATetR AD加DOX tTA+DOX 結(jié)合貝IJtTA不與TRE結(jié)合，外 源基因不封 達(dá)BD Tet-Off SystemAhabinds TRE and activates transcription in the absence of Dox000反式四環(huán)素轉(zhuǎn)錄

34、激活子反式四環(huán)素調(diào)控激活子rTetR (a "reverse Tetrepressor)含突變氨基酸位點(diǎn)的DNA結(jié)合蛋白的，含X95 ->Asn95 .LeulOl ->SerlOl , Glyl02Asp 102) o結(jié)合四環(huán)素后的結(jié)構(gòu)可與調(diào)空序列 結(jié)合。rtTATet-On SystemrtTAbinds TRE and activates transcription in the presence of DoxTranscriptionriC(iEne of intE restTREThe MreverseM Tet repressor (rTetR) was cr

35、eated by four amino acid changes that reverse the protein's response to Dox. Asa result of these changes, therTetR domain of rtTA binds theTRE and activates transcription in the presence of Dox.Figure 9 pTetCHf and pTet-On composite vector map. Unique sites are in bold. Only pTet-On contains the

36、 second Hind III site at Position #871 This site can be used to distinguish pTeT-O彳f from pTet-On. pT et-Of expresses the tT A (tet transact! vator) regulator protein from thestrong immediate early promoter of cytomegalovirus (PCMV)- pTet-On expresses the rtTA (reverse tTA), which contains four amin

37、o-acid mutations (as marked on the map). In addition, there are several silent mutations in pTet-On In all other respects, the vectors are identical.XhoXho IMCS070-5371(2)P、 TRESV4°PhCMVMpTRE2hygSV40 poly A5.3 kb B呷吵poly AXho I<3759|AmpColElori4/04934905005105GATCCTCTAETCAGCTGAc5cGTGCTAG

38、3;cGGCCGCATdGATBaiM IPvuW Mlu Nhe Noil Cla I514 蛍0AAGCHGTCGACGATATCTCTAGA EcoRVAcclEcoRI (117514/0朋5OJ510GGATCCTCTAGTCAG CTGAcEcGTGCTAGcbcGGCCG CATC GATMH IPw/ll Mli/ Nhe Hoi Cla514!i20530AAG CTTGTCGACGATATCTCTAGAfcoRVGene X 'minWTREI ReporterminWFigure 16. The pBI expression cassette. Two genes

39、-either two genes of interest, a gene of interest and a reporter, ortworeporters-can be expressed simultaneously from the Pbi promoter. Reporters are iirefly luciferase, p-galactosidase, or EGFP.香豆霉素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)SV40 early promoter 6X Lambda OPXmnl5298ADSV40 early en hancer/ promoterSV40 late poly(A) signa

40、lCMV minimal promoterSynthetic poly(A)signalLambda repressor (DNA binding domain)AmprGyrBpReg neo Vector(68O2bp)(O= kRep-GyrB-AD chimeric acdvatorFigure 1 Schematic representation of the coumerin-regulated system.香豆霉素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)OnAuto-ampliffcation ol activatorOffLow levelsRapid and Efficient Generation of IsogenicExpression Cell Lines using Targeted IntegrationRapid and Efficient Generation of IsogenicExpression