病毒感染實驗診斷淺談

1、病毒感染實驗診斷淺談病毒感染實驗診斷淺談什么是病毒？什么是病毒？n病毒（病毒（virus）是一類體積微小、結構簡單、）是一類體積微小、結構簡單、有嚴格的細胞內寄生性的非細胞型微生物。有嚴格的細胞內寄生性的非細胞型微生物。n 特點：特點：體積微小，只能在電鏡下觀察，能通過濾菌器體積微小，只能在電鏡下觀察，能通過濾菌器無完整的細胞結構：蛋白質衣殼核酸核心無完整的細胞結構：蛋白質衣殼核酸核心只有一種類型核酸：只有一種類型核酸：RNA或或DNA有嚴格的細胞內寄生性，只能在活細胞內生長有嚴格的細胞內寄生性，只能在活細胞內生長以核酸復制的方式增殖，不能進行二分裂繁殖以核酸復制的方式增殖，不能進行二分裂繁殖

2、抵抗力特殊：耐冷不耐熱，對化學因素的抵抗力較抵抗力特殊：耐冷不耐熱，對化學因素的抵抗力較一般比細菌強，耐甘油，對抗生素及磺胺類藥物不一般比細菌強，耐甘油，對抗生素及磺胺類藥物不敏感，干擾素可抑制病毒復制。敏感，干擾素可抑制病毒復制。病毒感染的實驗診斷方法病毒感染的實驗診斷方法 n病原學診斷病原學診斷 病毒分離培養(yǎng)病毒分離培養(yǎng)顯微鏡檢查顯微鏡檢查抗原檢測抗原檢測核酸檢測核酸檢測n血清學診斷血清學診斷 抗體檢測抗體檢測 IgM、IgG一、標本采集、運送和處理一、標本采集、運送和處理（一）標本采集（一）標本采集采集時間：盡早采集（越早越好）采集時間：盡早采集（越早越好）標本種類：根據(jù)感染的部位、可能

3、感染的病毒類標本種類：根據(jù)感染的部位、可能感染的病毒類型選擇標本種類型選擇標本種類無菌采集標本：必要時用抗生素或抗真菌藥處理無菌采集標本：必要時用抗生素或抗真菌藥處理抑制細菌生長抑制細菌生長 100U/ml青霉素青霉素100g/ml鏈霉素鏈霉素抑制真菌生長抑制真菌生長 2.5gg/ml二性霉素二性霉素B 或或40 g/ml制霉菌素制霉菌素血清學檢查標本：雙份血清血清學檢查標本：雙份血清（二）標本的運送與保存（二）標本的運送與保存1.低溫送檢低溫送檢 4可保存數(shù)小時，可保存數(shù)小時，- -70可長期保存可長期保存 - -10 - -20下病毒易滅活，不可用于保存病毒標下病毒易滅活，不可用于保存病毒

4、標本本對冷凍標本應避免反復凍融對冷凍標本應避免反復凍融2.保濕送檢保濕送檢50%甘油鹽水保存送檢甘油鹽水保存送檢 病毒轉運培養(yǎng)基（病毒轉運培養(yǎng)基（virus transport medium ，VTM）含含0.5%明膠或牛血清白蛋白的明膠或牛血清白蛋白的Hanks液液3.無菌送檢無菌送檢抑制細菌生長抑制細菌生長 100U/ml青霉素青霉素100g/ml鏈霉素鏈霉素 抑制真菌生長抑制真菌生長 2.5gg/ml二性霉素二性霉素B 或或40 g/ml制霉制霉菌素菌素二、病毒的形態(tài)學檢查二、病毒的形態(tài)學檢查1. 光學顯微鏡檢查光學顯微鏡檢查 n主要觀察病變組織中的包涵體，某些大病毒也通主要觀察病變組織

5、中的包涵體，某些大病毒也通過光學顯微鏡觀察。過光學顯微鏡觀察。n簡便、快速，但敏感性低，有些病毒感染細胞后簡便、快速，但敏感性低，有些病毒感染細胞后不形成包涵體不形成包涵體 狂犬病毒胞漿內包涵體狂犬病毒胞漿內包涵體（內基小體）（內基小體）巨細胞病毒胞核內包涵體巨細胞病毒胞核內包涵體（貓頭鷹眼）（貓頭鷹眼）2. 電鏡及免疫電鏡檢查電鏡及免疫電鏡檢查直接檢查標本中的病毒顆粒，快直接檢查標本中的病毒顆粒，快速，可確診。但敏感性低（速，可確診。但敏感性低（10106 6/ml/ml）免疫電鏡敏感性高，但只能用于免疫電鏡敏感性高，但只能用于已知病毒的檢測）已知病毒的檢測）乙型肝炎病毒電鏡圖 輪狀病毒電鏡

6、圖 三、病毒的分離與鑒定三、病毒的分離與鑒定動物接種動物接種組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)標本采集標本采集標本處理后接種標本處理后接種雞胚接種雞胚接種卵黃囊膜卵黃囊膜尿囊液尿囊液羊膜腔液羊膜腔液絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜觀察囊膜病變觀察囊膜病變血凝試驗血凝試驗血凝抑制試驗血凝抑制試驗CPEEM包涵體包涵體空斑試驗空斑試驗紅細胞吸附紅細胞吸附中和試驗中和試驗觀察發(fā)病觀察發(fā)病抗原檢測抗原檢測抗體檢測抗體檢測病理檢查病理檢查（一）病毒的分離（一）病毒的分離n組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)n雞胚培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)n動物接種動物接種1. 組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)n將人或動物離體的活組織或分散的活細胞在體外將人或動物離體的活組織或分散的活細胞在體外人工

7、控制的條件下使其生長繁殖的一種技術。人工控制的條件下使其生長繁殖的一種技術。組織培養(yǎng)的類型組織培養(yǎng)的類型:（1）組織塊培養(yǎng)）組織塊培養(yǎng)（2）器官培養(yǎng)）器官培養(yǎng) 人胚氣管呼吸道病毒；人胚氣管呼吸道病毒； 人胚腸人胚腸 腸道病毒腸道病毒（3）細胞培養(yǎng)）細胞培養(yǎng) 最常用最常用q原代和次代細胞培養(yǎng)原代和次代細胞培養(yǎng) q二倍體細胞培養(yǎng)二倍體細胞培養(yǎng)q傳代細胞培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)n動物新鮮組織（人胚腎等）動物新鮮組織（人胚腎等）胰酶消化胰酶消化營養(yǎng)營養(yǎng)液培養(yǎng)液培養(yǎng)單層細胞（原代細胞）單層細胞（原代細胞）n原代細胞原代細胞胰酶消化胰酶消化轉種培養(yǎng)（次代培養(yǎng)細轉種培養(yǎng)（次代培養(yǎng)細胞）胞）n對病毒敏感，但制備費時費

8、力，只能傳對病毒敏感，但制備費時費力，只能傳23代。代。 原代和次代培養(yǎng)細胞原代和次代培養(yǎng)細胞二倍體細胞株二倍體細胞株 原代細胞反復傳代（原代細胞反復傳代（5070代）代）仍保持二倍體染色體特性。病毒分離和疫苗制仍保持二倍體染色體特性。病毒分離和疫苗制備的首選細胞株。備的首選細胞株。傳代細胞株傳代細胞株 來源于腫瘤細胞或突變的二倍體來源于腫瘤細胞或突變的二倍體細胞，能在體外無限增殖。增殖快，不易衰老，細胞，能在體外無限增殖。增殖快，不易衰老，易于傳代保存。常用于病毒的分離鑒定，但不易于傳代保存。常用于病毒的分離鑒定，但不能用于制備疫苗。能用于制備疫苗。優(yōu)點優(yōu)點細胞來源廣、敏感細胞株多細胞來源廣

9、、敏感細胞株多不受機體免疫因素的影響，個體差異小不受機體免疫因素的影響，個體差異小病變結果易于觀察病變結果易于觀察可用于病毒的分離鑒定和制備疫苗及抗原可用于病毒的分離鑒定和制備疫苗及抗原缺點缺點條件要求相對較高，有細胞培養(yǎng)條件的實驗室條件要求相對較高，有細胞培養(yǎng)條件的實驗室才能做才能做2. 雞胚培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)新鮮受精卵新鮮受精卵 接種病毒接種病毒3839713d卵黃囊接種（流行性腦炎病毒）卵黃囊接種（流行性腦炎病毒）羊膜腔接種（流感病毒）羊膜腔接種（流感病毒）尿囊腔接種（傳代培養(yǎng)）尿囊腔接種（傳代培養(yǎng)）絨毛尿囊膜接種（痘類病毒）絨毛尿囊膜接種（痘類病毒）絨毛尿囊膜表現(xiàn)有痘病毒的特異性損傷絨毛尿囊

10、膜表現(xiàn)有痘病毒的特異性損傷優(yōu)點優(yōu)點n雞胚來源充足，操作簡便，有多種接種途徑雞胚來源充足，操作簡便，有多種接種途徑n病毒增殖快，可收獲大量病毒病毒增殖快，可收獲大量病毒n雞胚本身是無菌的，對接種的病毒不產生抗雞胚本身是無菌的，對接種的病毒不產生抗體體缺點缺點n易感病毒少，目前主要易感病毒少，目前主要用于流感病毒、腮腺用于流感病毒、腮腺炎病毒、皰疹病毒和痘類病毒的分離培養(yǎng)。炎病毒、皰疹病毒和痘類病毒的分離培養(yǎng)。n某些病毒在雞胚內傳代后，其毒力下降某些病毒在雞胚內傳代后，其毒力下降3. 動物接種動物接種n常用動物常用動物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒對動

11、物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類不同病毒對動物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類加以選擇。加以選擇。n接種途徑接種途徑 按病毒侵襲部位選擇相應的接種途徑：按病毒侵襲部位選擇相應的接種途徑：q乙型腦炎病毒及狂犬病毒乙型腦炎病毒及狂犬病毒 小鼠腦內接種小鼠腦內接種q柯薩奇病毒柯薩奇病毒 乳鼠腹腔接種乳鼠腹腔接種q乙肝病毒乙肝病毒 黑猩猩靜脈注射黑猩猩靜脈注射q流感病毒流感病毒 鼻腔滴種鼻腔滴種n用途用途 分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清優(yōu)點優(yōu)點n方法簡單、結果易于觀察方法簡單、結果易于觀察n選擇適當?shù)慕臃N途徑，可出現(xiàn)類似人類的感染選擇適當?shù)慕臃N途徑，可出現(xiàn)類似人類的感染癥狀

12、，有利于發(fā)病機制的研究癥狀，有利于發(fā)病機制的研究缺點缺點n可自然帶毒或隱性感染，干擾實驗結果可自然帶毒或隱性感染，干擾實驗結果n有個體差異有個體差異n很多病毒無敏感動物，或感染后不出現(xiàn)明顯癥很多病毒無敏感動物，或感染后不出現(xiàn)明顯癥狀狀（二）病毒的鑒定（二）病毒的鑒定病毒的初步鑒定病毒的初步鑒定n動物感染：敏感動物范圍、潛伏期及發(fā)病情況動物感染：敏感動物范圍、潛伏期及發(fā)病情況n雞胚接種：病毒對雞胚的敏感性、特殊病灶雞胚接種：病毒對雞胚的敏感性、特殊病灶（如痘皰等）（如痘皰等）n細胞培養(yǎng)：病毒在細胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)細胞培養(yǎng)：病毒在細胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)n理化性質的測定：主要用于新病毒的鑒定理化性質的測定：主

13、要用于新病毒的鑒定病毒的最后鑒定病毒的最后鑒定n血清學鑒定血清學鑒定: 中和試驗、補體結合試驗、血凝中和試驗、補體結合試驗、血凝抑制試驗等。抑制試驗等。 分離的新病毒，必須進行系統(tǒng)的全面鑒定分離的新病毒，必須進行系統(tǒng)的全面鑒定病毒在細胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)病毒在細胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)1. 細胞代謝作用改變細胞代謝作用改變（培養(yǎng)液顏色變化）（培養(yǎng)液顏色變化）n正常細胞代謝：正常細胞代謝： 培養(yǎng)液由紅變黃培養(yǎng)液由紅變黃n病毒增殖，抑制細胞代謝：培養(yǎng)液顏色不變病毒增殖，抑制細胞代謝：培養(yǎng)液顏色不變或更紅或更紅 n病毒在細胞內增殖后，使宿主細病毒在細胞內增殖后，使宿主細胞的形態(tài)發(fā)生不同程度改變，稱胞的形態(tài)發(fā)生不同程

14、度改變，稱為為細胞病變效應細胞病變效應（cytopathic cytopathic effecteffect，CPECPE）。）。2. 細胞形態(tài)改變細胞形態(tài)改變n細胞變圓、融合、腫脹、細胞空細胞變圓、融合、腫脹、細胞空泡、核濃縮、形成嗜酸性或嗜堿泡、核濃縮、形成嗜酸性或嗜堿性包涵體等。性包涵體等。n 某些病毒感染細胞某些病毒感染細胞后不出現(xiàn)后不出現(xiàn)CPE3. 干擾現(xiàn)象（干擾現(xiàn)象（interference）n當兩種不同的病毒同時或先后感染同一細胞時，當兩種不同的病毒同時或先后感染同一細胞時，其中一種病毒可抑制另一種病毒的增殖，稱為其中一種病毒可抑制另一種病毒的增殖，稱為病毒的病毒的干擾現(xiàn)象干擾現(xiàn)

15、象。n干擾現(xiàn)象也可被相應特異性抗體抑制，稱為干擾現(xiàn)象也可被相應特異性抗體抑制，稱為干干擾抑制現(xiàn)象擾抑制現(xiàn)象鼻鼻.無無CPE鼻鼻V.Poli.V無無CPEPoli.V有有CPE4. 紅細胞吸附及吸附抑制試驗紅細胞吸附及吸附抑制試驗n受感染的受感染的宿主細胞膜宿主細胞膜含含病毒抗原（血凝素），病毒抗原（血凝素），可吸附雞、豚鼠或猴紅可吸附雞、豚鼠或猴紅細胞。細胞。n 如果在培養(yǎng)瓶中加入如果在培養(yǎng)瓶中加入相應的血凝素抗血清，相應的血凝素抗血清，則不出現(xiàn)紅細胞吸附現(xiàn)則不出現(xiàn)紅細胞吸附現(xiàn)象，即紅細胞吸附抑制象，即紅細胞吸附抑制試驗陽性試驗陽性病毒的理化性質測定病毒的理化性質測定n主要用于新病毒的鑒定主要

16、用于新病毒的鑒定1. 病毒的大小及形態(tài)病毒的大小及形態(tài) ：電鏡直接觀察及測量：電鏡直接觀察及測量2. 核酸類型核酸類型: 用用RNA酶或酶或DNA酶處理病毒。酶處理病毒。3. 乙醚敏感試驗乙醚敏感試驗: 有包膜病毒對乙醚敏感，經乙有包膜病毒對乙醚敏感，經乙醚作用后，失去感染性醚作用后，失去感染性4. 耐酸試驗耐酸試驗 腸道病毒耐酸，在腸道病毒耐酸，在pH3的環(huán)境下穩(wěn)的環(huán)境下穩(wěn)定，鼻病毒不耐酸，在定，鼻病毒不耐酸，在pH3的環(huán)境下被滅活的環(huán)境下被滅活病毒的血清學鑒定病毒的血清學鑒定n對初步鑒定為陽性的標本均需要用血清學方對初步鑒定為陽性的標本均需要用血清學方法做最后鑒定。法做最后鑒定。n方法：血

17、凝抑制試驗、中和試驗、免疫熒光方法：血凝抑制試驗、中和試驗、免疫熒光試驗、試驗、ELISA等。等。四、病毒的血清學診斷四、病毒的血清學診斷n用已知病毒抗原檢測患者血清中的相應抗體，可協(xié)助用已知病毒抗原檢測患者血清中的相應抗體，可協(xié)助診斷病毒感染。診斷病毒感染。n雙份血清雙份血清IgG測定測定 4倍以上增長，有診斷意義倍以上增長，有診斷意義n單份血清單份血清IgM測定測定 可用于早期診斷，可用于早期診斷，但部分病人可但部分病人可能陰性，少數(shù)病人產生的特異性能陰性，少數(shù)病人產生的特異性IgM抗體也可抗體也可在體內持續(xù)存在在體內持續(xù)存在12年。年。病毒血清學試驗常用方法病毒血清學試驗常用方法（一）中

18、和試驗（一）中和試驗 原理原理 抗體與相應病毒結合后，能夠使病毒失去抗體與相應病毒結合后，能夠使病毒失去感染性。感染性。 V.Ab 失去感染易感細胞的能力失去感染易感細胞的能力 一定量抗體可中和一定量病毒一定量抗體可中和一定量病毒 根據(jù)抗體的效價對待測病毒液進行半定量檢測。根據(jù)抗體的效價對待測病毒液進行半定量檢測。中和試驗的必要條件：中和試驗的必要條件： 1. 活病毒活病毒 2. 敏感細胞、雞胚或動物敏感細胞、雞胚或動物中和試驗的特點：中和試驗的特點：n特異、敏感，既可檢測抗體，也可測定抗原特異、敏感，既可檢測抗體，也可測定抗原（定屬、定型）。（定屬、定型）。n既可用細胞培養(yǎng)做，也可用動物或雞

19、胚接種，既可用細胞培養(yǎng)做，也可用動物或雞胚接種，以細胞培養(yǎng)法最常用。以細胞培養(yǎng)法最常用。n檢測檢測IgGIgG，不能用于早期診斷，常用于，不能用于早期診斷，常用于流行病流行病學調查學調查。（二）補體結合試驗（二）補體結合試驗n檢測檢測IgM，常用于早期診斷。，常用于早期診斷。n不需活細胞，比中和試驗簡單，省時。不需活細胞，比中和試驗簡單，省時。（三）（三）IFIF及及ELISAELISAn方法簡單、快速、敏感性高。方法簡單、快速、敏感性高。n檢測特異性檢測特異性IgMIgM，有助于某些病毒感染的早期，有助于某些病毒感染的早期診斷，如：診斷，如：q孕婦羊水中檢測孕婦羊水中檢測IgMIgM型特異抗

20、體：胎兒先天性感染型特異抗體：胎兒先天性感染q抗抗HBc IgMHBc IgM：作為急性：作為急性HBVHBV感染的指標感染的指標（四）血凝及血凝抑制試驗（四）血凝及血凝抑制試驗含有血凝素的病毒能吸附一定種類的哺乳動物含有血凝素的病毒能吸附一定種類的哺乳動物或禽類的紅細胞，使紅細胞凝集。該現(xiàn)象可被相應或禽類的紅細胞，使紅細胞凝集。該現(xiàn)象可被相應的血凝素抗體抑制，稱為血凝抑制試驗，可用于病的血凝素抗體抑制，稱為血凝抑制試驗，可用于病毒的分型。毒的分型。五、病毒抗原檢查五、病毒抗原檢查nDFADFA、IFAIFA、IEAIEA等。等。n可檢測細胞內、外的游離病毒抗原?？蓹z測細胞內、外的游離病毒抗原

21、。n敏感、特異，簡便、快速。適用于多種病毒性敏感、特異，簡便、快速。適用于多種病毒性疾病的早期快速診斷。疾病的早期快速診斷。Influenzavirus A培養(yǎng)物DFA染色陽性 生殖道HSV-2涂片DFA染色陽性六、病毒的分子生物學檢測六、病毒的分子生物學檢測n分子生物學方法可檢測以不同形式存在的病毒分子生物學方法可檢測以不同形式存在的病毒基因片斷?；蚱瑪唷方法敏感、特異、簡便、快速。方法敏感、特異、簡便、快速。q核酸電泳技術核酸電泳技術q核酸雜交技術核酸雜交技術qPCRq基因芯片技術基因芯片技術n 特點：特點：體積微小，只能在電鏡下觀察，能通過濾菌器體積微小，只能在電鏡下觀察，能通過濾菌器無完整的細胞結構：蛋白質衣殼核酸核心無完整的細胞結構：蛋白質衣殼核酸核心只有一種類型核酸：只有一種類型核酸：RNA或或DNA有嚴格的細胞內寄生性，只能在活細胞內生長有嚴格的細胞內寄生性，只能在活細胞內生長以核酸復制的方式增殖，不能進行二分裂繁殖以核酸復制的方式增殖，不能進行二分裂繁殖抵抗力特殊：耐冷不耐熱，對化學因素的抵抗力較抵抗力特殊：耐