全基因組重測序數(shù)據(jù)分析

1、全基因組重測序數(shù)據(jù)分析1. 簡介(Introduction)通過高通量測序識別發(fā)現(xiàn)de novo的somatic和germ line 突變，結(jié)構(gòu)變異-SNV，包括重排突變(deletioin, duplication以及 copy number variation )以及 SNP 的座位；針對重排突變和SNP的功能性進行綜合分析；我們將分析基因功能(包括 miRNA )，重組率(Recomb in ation )情況，雜合性缺失(LOH )以及進化選擇與 mutation之間的關(guān)系；以及這些關(guān)系將怎樣使得在disease ( cancer)genome中的mutation產(chǎn)生對應的易感機制和功

2、能。我們將在基因組學以及比較基因組學，群體遺傳學綜合層面上深入探索疾病基因組和 癌癥基因組。Sequence VariKtionStrucnmJVariatkiDChrciucsoiniltD ivb ole gtn oitie2 bp la 1 kb* Btw- peint n-vlitba* fliimrrhii - drriiaiB Ci«4rb')* SSTi-ti|SWi* M ic nruEdhTM. aiiBBireliiH* Ifrdeh Inienbat* SSTi - atSFi* anfui« vCfifiy Duabfr t ir utaii

3、 (CM)* SefnfWfe Maplittib* I nt itin血tri m Ik hoi* Cyi riftaiiMCWRrt* IcrMiirplitllkrnl* Chr«ai«54aiAl dd«Uai b丄t* £、2砂1 in応也-* lairiehrtnUBtl+Clr«n«M!HAl iAilifrriaallYi* HtiereafrrfijiL&mt* FrAilc laErs iBWchrflaoKiHfel insiibcMiABi cli r4M 4i4Mtk S«lir«

4、k4Kfiirft MArkrr c hrtratwaei-AwafikiiidYAotattaitdetectionCytogeoHicMolecular geaetic detectioEi實驗設計與樣本(1) Case-Control 對照組設計(2 )家庭成員組設計：父母-子女組(4人、3人組或多人)；初級數(shù)據(jù)分析1.數(shù)據(jù)量產(chǎn)出：總堿基數(shù)量、Total Mapping Reads 、Uniquely Mapping Reads 統(tǒng)計，測序深度分析。2 .一致性序列組裝：與參考基因組序列(Refere nee gen ome seque nee)的比對分析，禾U用貝葉斯統(tǒng)計模型檢測出每個

5、堿基位點的最大可能性基因型，并組裝出該個體基因組的一致序列。3. SNP檢測及在基因組中的分布：提取全基因組中所有多態(tài)性位點，結(jié)合質(zhì)量值、測序深度、重復性等因素作進一步的過濾篩選，最終得到可信度高的SNP數(shù)據(jù)集。并根據(jù)參考基因組信息對檢測到的變異進行注釋。4 .In Del檢測及在基因組的分布：在進行mappi ng的過程中，進行容 gap的比對并檢測可 信的short In Del。在檢測過程中，gap的長度為15個堿基。對于每個In Del的檢測，至少 需要3個Paired-End 序列的支持。5. Structure Variation 檢測及在基因組中的分布：能夠檢測到的結(jié)構(gòu)變異類型主

6、要有：插入、缺失、復制、倒位、易位等。根據(jù)測序個體序列與參考基因組序列比對分析結(jié)果，檢測全基 因組水平的結(jié)構(gòu)變異并對檢測到的變異進行注釋。高級數(shù)據(jù)分析1.測序短序列匹配(Read Mapping )（1） 屏蔽掉 Y染色體上假體染色體區(qū)域（pseudo-autosomal region ）,將Read與參考序 列NCBI36進行匹配（包括所有染色體，未定位的con tig，以及線粒體序列 mtDNA （將用校正的劍橋參考序列做替代）。采用標準序列匹配處理對原始序列文件進行基因組匹配，將Read與參考基因組進行初始匹配；給出匹配的平均質(zhì)量得分分布；（2） 堿基質(zhì)量得分的校準。我們采用堿基質(zhì)量校準

7、算法對每個Read中每個堿基的質(zhì)量進 行評分，并校準一些顯著性誤差，包括來自測序循環(huán)和雙核苷酸結(jié)構(gòu)導致的誤差。（3） 測序誤差率估計。pseudoautosomal con tigs ，short repeat regions （包括 segme ntal duplicati on ， simple repeat seque nee- 通過 tandem repeat 識另 U算法識另 U） 將被過濾；2. SNP Calling 計算 （SNP Calling ）我們可以采用整合多種 SNP探測算法的結(jié)果，綜合地，更準確地識別出SNP。通過對多種算法各自識別的 SNP進行一致性分析，保留具有

8、高度一致性的SNP作為最終SNP結(jié)果。這些具有高度一致性的 SNP同時具有非常高的可信度。在分析中使用到的SNP識別算法包括基于貝葉斯和基因型似然值計算的方法，以及使用連鎖不平衡 LD或推斷技術(shù)用于優(yōu)化SNP識別檢出的準確性。統(tǒng)計SNV的等位基因頻率在全基因組上的分布稀有等位基因數(shù)目在不同類別的 SNV中的比率分布（a） ; SNV的類別主要考慮：（1）無 義（nonsense ） , （2）化學結(jié)構(gòu)中非同義，（3）所有非同義，（4）保守的非同義，（5） 非編碼，（6）同義，等類型SNV ;另外，針對保守性的討論， 我們將分析非編碼區(qū)域 SNV 的保守型情況及其分布（圖 a, b ）a93 A

9、NS sffoUOAufiIL. NonsensA231567h； M'i'i 冷胡”小won亡Mng (ptidstCon- T = _ 504S403S30SS2015. o.ao.oao.oa- b >5 Bo 3. 短插入 / 缺失探測(Short In sertio n /Deletion (In del ) Call)(1) .計算全基因組的in del變異和基因型檢出值的過程計算過程主要包含3步：(1)潛在的in del的探測；(2)通過局部重匹配計算基因型的似然值；(3)基于LD連鎖不平衡的基因型推斷和檢出識別。In del在X，Y染色體上沒有檢出值得出。

10、(2) . I ndel過濾處理4.融合基因的發(fā)現(xiàn)Fusi on gene Discovery )選擇注釋的基因信息來自于當前最新版本的Ensemble Gene數(shù)據(jù)庫，RefSeq數(shù)據(jù)庫和Vega Gene數(shù)據(jù)庫。下面圖例給出的是融合基因的形成，即來自不同染色體的各自外顯子 經(jīng)過重組形成融合基因的模式圖。IP'Chr 坨1502.002.252.50*:Goncmic kxatwo (Mt>)丿 ” Lhr 12上 列rand) Ow 2 2 蟲的).,CMCAGTCACNA2D428期了嗣曰ton 361775177Intron 3£三工上5. 結(jié)構(gòu)變異(Struc

11、ture Variation )結(jié)構(gòu)變異(Structure Variation SV)是基因組變異的一類主要來源，主要由大片段序列(一般1kb )的拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV )以及非平衡倒位(unbalaneein version )事件構(gòu)成。目前主要一些基因組研究探測識別的SV大約有20,000個(DGV數(shù)據(jù)庫)。在某些區(qū)域上，甚至 SV形成的速率要大于 SNP的速率，并與疾病臨床表型具有很大關(guān)聯(lián)。我們不僅可以通過測序方式識別公共的SV，也可以識別全新的 SV。全新的SV的生成一般在germ line和突變機制方面都具有所報道。然而，當前對SV的精確

12、解析需要更好的算法實現(xiàn)。同時，我們也需要對SV的形成機制要有更重要的認知，尤其是 SV否起始于祖先基因組座位的插入或缺失，而不簡單的根據(jù)等位基因頻率或則與參考基因組序列比對判斷。SV的功能性也結(jié)合群體遺傳學和進化生物學結(jié)合起來，我們綜合的考察SV的形成機制類別。SV形成機制分析，包括以下幾種可能存在的主要機制的識別發(fā)現(xiàn)：(A)同源性介導的直系同源序列區(qū)段重組(NAHR );（B ）與DNA雙鏈斷裂修復或復制叉停頓修復相關(guān)的非同源重組（NHR ）;（C） 通過擴展和壓縮機制形成可變數(shù)量的串聯(lián)重復序列（VNTR）；（D） 轉(zhuǎn)座元件插入（一般主要是長/短間隔序列元件LINE/SINE或者伴隨TEI相

13、關(guān)事件 的兩者的組合）。結(jié)構(gòu)變異探測和擴增子（Amplicon ）的探測與識別分析：如下圖所示» -0-W#o CKMNAG 00X1 MVCWFAM9A并識別出SV。6. 測序深度分析測序深度分析就是指根據(jù)基因組框內(nèi)覆蓋度深度與期望覆蓋度深度進行關(guān)聯(lián),我們也將采用不同算法識別原始測序數(shù)據(jù)中的缺失片段（deletion ）和重復片段（duplicati on ）。7. SV探測識別結(jié)果的整合與FDR推斷（可選步驟）（1）. PCR或者芯片方式驗證 SV（2）.計算FDR-錯誤發(fā)現(xiàn)率（配合驗證試驗由客戶指定）篩選SV檢出結(jié)果用于SV的合并和后續(xù)分析：我們通過不同方式探測識別SV的目的極

14、大程度的檢出 SV，并且降低其FDR （ <=10% ）。通過下屬篩選方法決定后續(xù)分析所使 用到的SV集合。每種SV探測識別算法得到的 SV的FDR要求小于10%，并將各自符合 條件的SV合并；對于FDR大于10%的算法計算識別的 SV結(jié)果，如果有PCR和芯片平 臺驗證數(shù)據(jù)，同樣可以納入后續(xù)SV分析中。最后，針對不同算法得到的SV，整合處理根據(jù)breakpoint斷點左右重合覆蓋度的置信區(qū)間來評定；8. 變異屬性分析（1） n eutral coalesce nt 分析測序數(shù)據(jù)可以探測到低頻率的變異體（MAF<=5% ）。根據(jù)來自群體遺傳學理論（ neutralcoalesce n

15、t理論）的期望值可以計算低頻度變異的分布。我們用不同等位基因頻率下每Mb變異數(shù)目與n eutral coalesce nt選擇下的期望值比值，即每Mb基因組win dows內(nèi)的theta觀測值，來刻畫和反映自然純化選擇與種群（cancer cell-line可以特定的認為是可以區(qū)分的種群）增長速率。該分布分別考察SNP （藍色線），In del （紅色線），具有基因型的大片段缺失（黑色線），以及外顯子區(qū)域上的SNP （綠色線）在不同等位基因頻率區(qū)間上的theta情況（參見下圖）。(2).全新變異體(novel variant)的等位基因頻率和數(shù)量分布分析對象包括全新預測的SNP，indel，l

16、arge deletion,以及外顯子 SNP在每個等位基因頻qs冷d 衛(wèi)上 口 QEaJgqo0.0 0.2 0X 0.6 0.3 1.0Variant frequencydbSNP （當率類別下的數(shù)目比率(fraction )(參見下圖)；全新預測是指預測分析結(jié)果與前版本129 )以及deletion數(shù)據(jù)庫dbVar ( 2010年6月份版本)和已經(jīng)發(fā)表的有關(guān)in dels研究的基因組數(shù)據(jù)經(jīng)過比較后識別確定的全新的SNP，in del以及deletion。dbSNP包含SNP 和 in dels; dbVAR 包含有 deletio n, duplicatio n, 以及 mobile e

17、leme nt in sertio n。dbRIP以及其他基因組學研究（JC Ventrer以及 Watson基因組，炎黃計劃亞洲人基因組）結(jié)果提供的 short in dels 禾口 large deletio n 。0 8 6 4 2 T IF1 o o o O 一 aoucooett0.0-0,0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0Variant allele frequency計算 SNP , Deletion，以及 Insertion 大小分布；計算 SNP , Deletion，以及 Insertion 中屬 于全新預測結(jié)果的數(shù)目占已有各自參考數(shù)據(jù)庫數(shù)目的比例（相對于dbSNP

18、數(shù)據(jù)庫；dbSNP包含 SNP 和 indels;dbVAR 包含有 deletion,duplication, 以及 mobile element insertion 。dbRIP以及其他基因組學研究（JC Ventrer以及 Watson基因組，炎黃計劃亞洲人基因組）結(jié)果提供的short in dels和large deletion ）其中，可以給出 LINE，Alu的特征位置。Q直 Enu 二 Loo9Lo10 (size)lfl-al 0 9 8 7 6 5日 a4 3 2 10匚 -CLIl EHJE匸EAjL(4).結(jié)構(gòu)變異SV的斷點聯(lián)結(jié)點(BreakPoint Junction)

19、 分析根據(jù)SV不同檢出結(jié)果經(jīng)過一些列篩選步驟構(gòu)建所有結(jié)構(gòu)變異SV的斷點聯(lián)結(jié)點數(shù)據(jù)庫， 保留長度大于等于 50bp的SV ;分析斷點聯(lián)結(jié)點處具有 homology或者microhomology的SV ； 并將同一染色體，起始和終止位置坐標下的不同SV進行去冗余處理。分析識別SV的斷點聯(lián)結(jié)點(Breakpoint):將Breakpoint按照可能形成的方式可以分類為 以下幾類：(a) 非等位基因同源重組型(non-allelic homologous recombination-NAHR );(b) 非同源重組 (non homologous recomb in atio n-NHR)，包括 no

20、n homologous en d-jo ining(NHEJ)和 fork stalling /template switching( FoSTeS/MMBIR )；(c) 可變串聯(lián)重復(VNTR)(d) 轉(zhuǎn)座插入元件(TEI )。ChromosomenumberFomnationDhromoecmal Ideogrammechanism stacked histogram NAHR QNHRTEIVNTRInsertion trace分析SV形成機制與斷裂點臨近區(qū)域序列的關(guān)系，包括染色質(zhì)界標(端粒，中心粒)，重組 高發(fā)熱點區(qū)域，重復序列以及GC含量，短DNA motif和微同源區(qū)域(mic

21、rohomologyregion )。_Disianoe Io Selomer&s1.29+081.5e+0&-O.OeOOR，：IVWIR hlAHR NHR TEI11 -r-i.0e*08-0B0Me+07o.o#+oo -VNTR IMAHR NHR TEIDi$lanc« to synlQ叩 boundari斡b nolO.d2.M1.9SNAHR佔曲1期HHR llauhlflyNAHFlvMMJftyHHR stabibly；/CAEBAB 花 tlooe.!丄 iK st a 嗣 觸 血 血 aaM艇De4eE»on1Q0+ NHR-*- B

22、ackgroundExpectation32打 J .畔；0 1 2 3 4 i >5 Base paiFB9. 突變率估計針對以家庭成員為單位的測序方案，我們主要探測de novo的突變(DNM );通過采用不同的方法/算法，我們給出每個家庭一份推斷的DNM報表；(1) 根據(jù)基因型推斷結(jié)果，分別對每人每堿基位置上的de novo突變進行綜合度量；(2) 采用貝葉斯方法計算家庭組設計中DNM的后驗概率10. SNP，SNV功能分析與注釋(1).祖先等位基因的注釋通過將人類(NCBI36)，黑猩猩(chimpanzee2.1 )，猩猩(PPYG2)以及恒河猴(MMUL1)4種基因組進行基因

23、組比對，發(fā)現(xiàn)保守的序列區(qū)域，計算祖先等位基因；以及duplicatio n/deleti on事件的進化分析。(2).分析基因結(jié)構(gòu)序列上不同區(qū)域的多樣性( Diversity )與分歧進化(diverge nee )根據(jù)基因型分析結(jié)果計算基因結(jié)構(gòu)序列上的多樣性程度，即雜合度(heterozygosity);雜合度指標可以說明選擇效應的存在以及局部變異的結(jié)構(gòu)分布特征模式。我們將考慮基因5 'UTR上游200bp，5'UTR，第一個外顯子，第一個內(nèi)含子，中間外顯子，中間內(nèi)含子，最末外0 0012000060.00000302500O.O.O.O.0.016-0.012-0.008-

24、0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4cM from tr呂nscription start/stop顯子和內(nèi)含子，以及3'UTR及其下游200bp區(qū)域左右考察的范圍(參見下圖a)。 分析編碼 轉(zhuǎn)錄本的起始/終止位置臨近區(qū)域的多樣性和進化分歧度(參見下圖b)。(3).疾病變異體探測將樣本測序中分析得到 SV與HGMD疾病變異體數(shù)據(jù)進行比對，得到交叉記錄的錯義和無義的SNP ;通過將HGMD疾病關(guān)聯(lián)突變與 CUI (疾病概念分類標識數(shù)據(jù)庫) 比對獲得HGMD 中所有SV的疾病表型，并獲得HGMD與測序數(shù)據(jù)分析得到的 SV的疾病表型；并通過Fisher 檢驗和Bonferroni多重假設

25、檢驗校正計算樣本 SV所富集的疾病表型。亡 It wt bi HCUiD A 1W0刪1*>沖g i5 0MmH e逼評曲*1If“rtdw卄vtaafw Tta M hQUD 1 1» CMWt mirtlBl4nwwPvrohurinc J|ftffI»I*-16皐診00QS1A19tatfiAJEihw(4).拷貝數(shù)變異CNV所含基因的功能注釋將CNV是否覆蓋區(qū)段重復 SD區(qū)域分類為2大類，每類CNV的所含基因的功能富集情況計算，顯著性在橫軸表示；各種顯著性功能在縱軸表示。 CWiwt ninThmhg 8151024e01042 Id"LcajPwi

26、ut)(5).變異的功能性分析與注釋(a) . SNP, Indels以及大的結(jié)構(gòu)變異 SV的功能注釋；(b) .對包含翻譯起始注釋信息的轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)上的SNP分類為：同義SNP ,非同義SNP 和無義SNP (引入終止子)，干擾終止子的 SNP，以及干擾剪接位點的 SNP ;為了降低假 陽性，我們采用嚴格的篩選方式過濾來自 in dels的錯誤；(c) 對錯義編碼區(qū)突變的功能性分析：通過信息學分析算法評估相對于生殖系變異的體細胞突變對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的影響效應。(6). SNV，SNP與miRNA研究之間的關(guān)聯(lián)分析miRNA是起重要的調(diào)控作用的小分子，我們將對miRNA的pri-mRNA

27、，pre-miRNA 以及miRNA靶基因序列進行分析，識別潛在的SNP功能位點。據(jù)文獻研究提供證據(jù)表明Humanpre-miRNA的二級結(jié)構(gòu)中存在不同位置上的SNP，我們將通過熱力學穩(wěn)定性分析方法評估SNP對pre-miRNA結(jié)構(gòu)的影響；另外，我們也將對miRNA-Target靶基因相互作用位點做分析，評估對SNP對靶基因靶向性的影響。MIR(7). SNV , SNP與GWAS研究之間的關(guān)聯(lián)分析分析GWAS研究中得到的易感基因在基因組上不同坐標上的OR值分布情況；將當前已知的GWAS研究成果與SNP進行比較；根據(jù) LD連鎖不平衡將 SNP與易感基因的關(guān)系進 行深入討論；直接與間接關(guān)聯(lián)方法可

28、以分別識別與表型相關(guān)的SNP，對于不易獲得(missing)和定位的SNP，通過LD連鎖不平衡推斷疾病易感基因突變座位。(8)生物學通路(代謝通路，信號通路)分析生物學通路(Biological pathway )，包括代謝通路和信號轉(zhuǎn)導通路是生物功能的重要組成 部分，我們將各種形式的突變、變異，包括SNV和SNP，的對應基因放到生物學通路中進行綜合分析，考察功能性突變對pathway的影響程度和影響的規(guī)律。通過GSEA (配合芯片表達譜數(shù)據(jù))，KS檢驗，超幾何分布檢驗等方法對變異基因在某些pathway的富集程度進行排序，識別發(fā)生功能改變的潛在通路。GrowthGrowth prolrtaf

29、ation(9).蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI )網(wǎng)絡分析蛋白質(zhì)相互作用也是生物分子功能增益和缺失的重要途徑，因此我們針對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡中的突變的蛋白及其收到影響的網(wǎng)絡節(jié)點蛋白進行系統(tǒng)分析，并對收到影響的網(wǎng)絡子結(jié)構(gòu) 進行功能注釋分析和聚類富分析。我們采用網(wǎng)絡分析算法對由于各種突變所受到影響的子網(wǎng)絡(sub network )進行功能富集度的分析;(10).順式基因調(diào)控網(wǎng)絡模塊(CRM )分析(a) 啟動子序列分析包括動子區(qū)域上的 Motif預測，并與已知轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫TRANSFAC 和JASPAR中的TFBS結(jié)合位點進行比對；啟動子區(qū)域上保守性分析，分析突變位置和保守性區(qū)域的關(guān)聯(lián)；(b

30、)計算全基因組保守性。確定TFBS的保守性以及 mutation位置的保守性；(11 )重排(arrangements )與突變(mutation )的全基因組統(tǒng)計(a).體細胞(somatic)和生殖系(germline )重排(arrangements )體細胞突變是相對于germ line突變的一類需要重要分析的內(nèi)容，我們針對Case-co ntrol設計的測序方案可以分別分析突變的情況，包括SNV , in del，以及CNV ;如果僅在tumor/disease(Case組)出現(xiàn)而不在normal (對照組)出現(xiàn)的突變我們可以認為是somatic體細胞突變。將somatic muta

31、tion 與dbSNP數(shù)據(jù)庫比對可以發(fā)現(xiàn)潛在的全新的突變和有記 錄的突變位置。然后，將突變分別比對到基因區(qū)域和非基因區(qū)域?；騾^(qū)域具體包括：內(nèi)含子區(qū)，UTR，剪接位點區(qū)和外顯子區(qū)。其中外顯子區(qū)分別統(tǒng)計：同義(synonymous )，缺失( deletion )，閱讀框移位 (frameshift )，插入(insertion ),錯義(missense )，無義(nonsense ) 以及非編碼蛋白外顯子(non-protein codi ng exon )等不同類型。綜合不同方面分析的結(jié)果，并按照突變分類給出各重排(arrangements)類型：SNV，CNV的數(shù)目統(tǒng)計數(shù)據(jù)表(參見下圖)。對每一測序樣本分別進行標注，包括體細胞突變和生