中級論文-拉呋替丁

1、申報論文（中 級）題目：拉呋替丁的合成工藝及質(zhì)量研究單 位：華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司 姓 名：馬昕艷 申報專業(yè)：（西藥）藥品分析2015年08月05日摘 要拉呋替丁是由日本Fujirebio和Taiho公司聯(lián)合開發(fā)的第二代長效組胺H2受體拮抗劑，具有持續(xù)的抗分泌作用和潛在的胃黏膜保護作用，2000年首次在日本上市。主要用于消化性潰瘍、胃炎、反流性食管炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍及其它相關(guān)癥狀的治療。為了確保合成工藝能夠得到合格的原料藥，對合成中的中間體進行質(zhì)量研究，采用適當?shù)姆治龇椒ê秃线m的質(zhì)控限度顯得尤為重要。根據(jù)對CTD格式申報資料的要求，對關(guān)鍵步驟的中間體的分析方法需提供驗證資料，在項目研究

2、方案制定時就設(shè)計了較全面的中間體的質(zhì)量研究工作，本文詳述了拉呋替丁的合成和質(zhì)量研究工作。為了解決原工藝拉呋替丁工藝步驟長、雜質(zhì)較多的問題，我公司對拉呋替丁采用市售中間體作為起始原料，縮短了工藝，解決了原工藝相應(yīng)中間產(chǎn)物雜質(zhì)較多影響產(chǎn)品質(zhì)量的問題。同時，為考察變更工藝后拉呋替丁質(zhì)量變化情況，按照“已上市化學(xué)藥品變更的技術(shù)指導(dǎo)原則”對拉呋替丁進行質(zhì)量研究。經(jīng)過液相條件的摸索和雜質(zhì)的分析將液相條件優(yōu)化為梯度洗脫的HPLC法，保證了有關(guān)雜質(zhì)的有效分離析。對選用的液相法進行了方法學(xué)研究，結(jié)果表明，該方法準確度和精密度均符合要求，專屬性良好，可以作為拉呋替丁的有關(guān)物質(zhì)檢查方法。優(yōu)化后的分析方法及限度經(jīng)多批

3、實驗數(shù)據(jù)證實能對該中間體進行有效的控制，以保證得到合格的原料藥。關(guān)鍵詞：拉呋替??；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜法 I目 錄摘 要I目 錄2前 言11. 合成工藝試驗部分11.1 反應(yīng)式11.2 具體工藝流程22. 質(zhì)量研究部分32.1 有關(guān)物質(zhì)的研究32.2 有關(guān)物質(zhì)分析方法的選擇與驗證42.3對硝基苯酚測定方法驗證94.分析與結(jié)論12前 言拉呋替?。↙afutidine）化學(xué)名為（(Z)-2-(2-呋喃基甲基)亞磺酰基-N-4-4-9(哌啶基甲基)-2-吡啶基-氧基-2-丁烯基乙酰胺），是由日本Fujirebio和Taiho公司聯(lián)合開發(fā)的第二代長效組胺H2受體拮抗劑。具有持續(xù)的抗分泌作用和潛在的胃

4、黏膜保護作用，2000年首次在日本上市。主要用于消化性潰瘍、胃炎、反流性食管炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍及其它相關(guān)癥狀的治療1。在拉呋替丁的合成工藝中，原料藥的有關(guān)物質(zhì)控制是關(guān)鍵，因此在中間體的質(zhì)量研究中主要是對有關(guān)物質(zhì)建立合適的分析方法。當前的法規(guī)對CTD申報資料要求列出已分離的中間體的質(zhì)量標準，并提供必要的方法學(xué)驗證資料。與之前對申報資料的要求相比，更加明確了中間體質(zhì)量研究的重要性，為使該品種順利申報，在對中間體研究的方案設(shè)計時就加大了質(zhì)量研究工作，明確了中間體方法驗證的必要性。根據(jù)化學(xué)藥物原料藥制備和結(jié)果確證研究技術(shù)指導(dǎo)原則化學(xué)藥物治療控制分析方法驗證技術(shù)指導(dǎo)原則等相關(guān)法規(guī)，我們對中間體的質(zhì)

5、量控制方法及限度進行了研究。本文主要總結(jié)了拉呋替丁的中間體的質(zhì)量分析方法的研究工作。1. 合成工藝試驗部分1.1 反應(yīng)式1.2 具體工藝流程1.2.1 N-4-4-（哌啶基甲基）吡啶基-2-氧代-順-2-烯丁基鄰苯二甲酰亞胺（LF-08）的制備將5Kg馬來酸鹽投入到50L反應(yīng)釜中，倒入乙酸乙酯20L，機械攪拌，使其懸浮。降溫至0-10，滴加10%NaOH溶液攪拌5小時至固體完全溶解。分出水層，有機層用飽和食鹽水洗。減壓蒸干溶劑，直接用于下一步反應(yīng)。1.2.2 4-4-（哌啶基甲基）吡啶基-2-氧代-順-2-烯丁胺（LF-09）的制備50下用20L乙醇將LF-08溶解，降溫至0-15倒入甲胺10

6、L，自然升至室溫（20-30）反應(yīng)5小時。降溫至0-15緩慢倒入10%NaOH溶液（0.5Kg溶解到3L水中），反應(yīng)1hr。減壓濃縮溶劑，至基本不再滴出。向反應(yīng)罐中加入3L飽和氯化鈉溶液和20L乙酸乙酯溶液，攪拌10min，靜置，分出水層。有機層用飽和食鹽水洗，用無水硫酸鈉（1.5Kg）干燥2小時，濾除干燥劑，用1L乙酸乙酯洗濾餅。滴定測得LF-09 9.14mol，收率92.7% 。1.2.3 LF-10的制備將上述溶液置于50L反應(yīng)釜中，攪拌下加入活性酯2.82Kg，20-30反應(yīng)3hr。降溫至0-10滴加鹽酸溶液（0.8L溶于8L水）。分出水層，用乙酸乙酯提取。水層倒回反應(yīng)罐，加入乙酸乙

7、酯17L，冰浴0-10滴加氫氧化鈉溶液（0.72Kg溶于5L水中）。滴加完反應(yīng)20min，分出水層，有機層用飽和食鹽水洗。50，2Kg無水硫酸鎂干燥2hr，過濾，干燥劑用2L乙酸乙酯洗。滴定得8.4mol，3.62Kg，收率92%。0-15攪拌析晶5hr。過濾，濾餅用乙酸乙酯（3L、2L）洗。得粗品3.4Kg。母液濃縮至2L，0-15攪拌析晶5hr，回收產(chǎn)品0.2Kg。1.2.4 重結(jié)晶將3.4Kg拉呋替丁粗品用16L乙酸乙酯回流溶解，加入0.17Kg活性炭脫色20min熱過濾，用1L乙酸乙酯洗濾餅，濾液倒回20L反應(yīng)罐，降至0-10析晶5hr，過濾，用2L乙酸乙酯洗濾餅，得3.06KgII型

8、拉呋替丁，精制率90%，母液濃縮至2L，回收產(chǎn)品0.27Kg，待與其他批合并處理。1.2.4 轉(zhuǎn)晶將3.4Kg拉呋替丁粗品用16L乙酸乙酯回流溶解，加入0.17Kg活性炭脫色20min熱過濾，用1L乙酸乙酯洗濾餅，濾液倒回20L反應(yīng)罐，降至0-10析晶5hr，過濾，用2L乙酸乙酯洗濾餅，得3.06KgII型拉呋替丁，精制率90% 。2. 質(zhì)量研究部分2.1 有關(guān)物質(zhì)的研究我公司選定的工藝路線是以市售的馬來酸鹽和活性酯為起始原料，其中關(guān)鍵反應(yīng)步驟，為胺解步驟。我們對胺解過程反應(yīng)生成的兩個中間體（LF08和LF09）進行了分離純化，并通過核磁共振氫譜、碳譜和質(zhì)譜進行了結(jié)構(gòu)確證為順-N-甲基-N-

9、(4-(4-哌啶基甲基)吡啶基-2-氧代)-2-烯丁基)鄰苯二甲酰胺（LA）和鄰苯二甲酰胺二甲胺。從而推測胺解反應(yīng)按如下機理進行：縮合步驟的反應(yīng)過程如下：綜上所述，合成中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)如表1所示。表1拉呋替丁生產(chǎn)工藝過程中可能產(chǎn)生的所有雜質(zhì)雜質(zhì)名稱雜質(zhì)結(jié)構(gòu)雜質(zhì)來源馬來酸鹽起始原料活性酯（LF-14）起始原料LF-08胺解步產(chǎn)物LA胺解步中間產(chǎn)物鄰苯二甲酰胺二甲胺胺解步中間產(chǎn)物N甲基鄰苯二甲酰亞胺可能雜質(zhì)鄰苯二甲酸C8H6O4胺解步產(chǎn)物對硝基苯酚縮合步產(chǎn)物拉呋替丁在合成工藝變更后，其雜質(zhì)的情況發(fā)生了一些變化。為了能對新工藝中存在的雜質(zhì)進行全面的檢查，需要對有關(guān)物質(zhì)檢查的方法進行全面的研究。通過研

10、究驗證，采用了梯度洗脫的HPLC法對本品進行有關(guān)物質(zhì)的測定。另外，在這些雜質(zhì)中，由于對硝基苯酚具有對皮膚有強烈刺激作用和可引起高鐵血紅蛋白血癥等毒害作用，應(yīng)該進行嚴格控制。為了能對其進行準確測定，另行研究了對硝基苯酚HPLC的測定方法。2.2 有關(guān)物質(zhì)分析方法的選擇與驗證2.2.1試驗儀器及試劑試驗儀器：Waters e2695，2489檢測器，2998進樣器 安捷倫液相色譜儀 1200試劑：磷酸二氫鉀 分析純甲醇 色譜純乙腈 色譜純2.2.2色譜條件的選擇（1）檢測波長的選擇分別稱取LA、LF09、LF08馬來酸鹽和拉呋替丁，用流動相（0.02M磷酸緩沖鹽-乙腈（8020）溶解并稀釋制成0.

11、1mg/ml的溶液，進行紫外全波掃描，各溶液的最大吸收波長見表2。表2 不同溶液的紫外光譜測定結(jié)果樣品及雜質(zhì)最大吸收波長LA194，217，277LF09193，217，278馬來酸鹽191，221，280拉呋替丁192，217，278由表2可見，拉呋替丁及相關(guān)物質(zhì)的最大吸收峰比較接近，均約為193nm、217220nm和278nm附近。根據(jù)測定吸收峰應(yīng)避開流動相中溶劑的末端吸收峰，并應(yīng)有較高的吸收值的原則，選擇檢測波長為220nm。（2）流動相選擇以流動相為溶劑，分別配制LA、LF09、馬來酸鹽、拉呋替丁粗品及拉呋替丁樣品的試驗溶液，溶液濃度約為0.10.2mg/ml，采用不同的流動相條件，

12、在220nm波長下進行測定，其試驗結(jié)果如下：A采用流動相A為甲醇-乙腈-0.2mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至 6.0）(251560)，進行各試驗溶液的測定。試驗結(jié)果見表3。表3 采用流動相為甲醇-乙腈-0.2mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液的測定結(jié)果樣品及雜質(zhì)主峰保留時間（分）溶劑空白3.33，4.6LA14.4LF094.68馬來酸鹽3.67（實際主峰未檢出）拉呋替丁18.3拉呋替丁粗品9.74（0.52），10.62（0.18）B流動相改變緩沖液濃度和流動相比例，緩沖液（0.02mol/LKH2PO4）乙腈（8020），測定結(jié)果見表4。表4 改變流動相測定結(jié)果樣品及雜質(zhì)保

13、留時間（分）溶劑空白2.169，2.364LA5.07（95.7）LF092.26（98.5）馬來酸鹽2.49（實際主峰未檢出）拉呋替丁7.188（99.8）拉呋替丁粗品7.229（97.2），2.198（1.4），34.3（0.4）由于起始原料LF8馬來酸鹽與中間體LF09的極性相差較大，用流動相為等度的色譜條件進行測定，在流動相中乙腈比例較少時，可檢測到中間體LF09，但LF8馬來酸鹽需超過1小時的檢測時間才可檢測到；而當加大流動相中乙腈比例時，在拉呋替丁主峰前的雜質(zhì)不易分離，故對本品的有關(guān)物質(zhì)檢查，宜采用梯度的測定方法。C梯度測定方法參考有關(guān)文獻2并經(jīng)多種不同的梯度方法進行比較，最后確定

14、采用表5所示梯度測定方法：表5、拉呋替丁有關(guān)物質(zhì)測定流動相梯度時間流動相A(%)流動相B（）087138871320604020.018713258713分別對各雜質(zhì)及起始原料按上述梯度方法進行測定，對含有馬來酸鹽、活性酯、拉呋替丁、LA、LF09、鄰苯二甲酰亞胺、鄰苯二甲酰甲胺、鄰苯二甲酸和對硝基苯酚的混合雜質(zhì)對照品溶液進行測定，并對拉呋替丁粗品（未經(jīng)精制的樣品）進行測定，其結(jié)果見表6。表6 梯度測定結(jié)果拉呋替丁及相關(guān)物質(zhì)保留時間（分）（歸一化%）溶劑空白3.09，3.7LA4.35(94%)鄰苯二甲酰胺二甲胺3.66(97%)N甲基鄰苯二甲酰亞胺19.8(99.88%)LF092.08(8

15、2.9%)活性酯3.37（59.55）19.99（39.3%）馬來酸鹽3.35（14.6%）19.0（70.8%）拉呋替丁5.46鄰苯二甲酸5.11（99.3%）對硝基苯酚19.98（98.9%）粗品2.23（0.35%），3.09（溶劑），3.35（0.05%），3.67（0.56%）,5.77（拉呋替丁98.29%），15.74（0.34%），19.07（0.28%），19.87（0.01%）從表6可以看出，采用梯度測定方法，拉呋替丁與起始原料及中間體可較好的分離；對粗品的測定結(jié)果表明，該方法可以檢出各種原料和中間體、副產(chǎn)物雜質(zhì)。2.2.3專屬性按照上述確定的梯度測定的色譜條件，進行專屬性

16、試驗。取流動相A、LA、鄰苯二甲酰胺二甲胺、N甲基鄰苯二甲酰亞胺、 LF09、活性酯、LF08馬來酸鹽，鄰苯二甲酸、對硝基苯酚和拉呋替丁各適量，以流動相A為溶劑，分別配制各被測物試驗溶液（除拉呋替丁溶液濃度為0.2mg/ml外，其余均約為0.02mg/ml），進行測定。由所測色譜圖可見，流動相A作為空白溶劑，出峰時間為3.09分和3.66分，LA的保留時間為4.35分，鄰苯二甲酰甲胺的保留時間為3.66分，鄰苯二甲酰亞胺的保留時間為19.86分，LF09的保留時間為2.08分，活性酯為3.37分和19.99分（主峰），LF08馬來酸鹽的保留時間為3.38分和19.07分（主峰），鄰苯二甲酸為5

17、.12分，對硝基苯酚為19.99分，拉呋替丁主峰為5.77分，拉呋替丁與各雜質(zhì)峰均可較好的分離，各雜質(zhì)之間也可分離。試驗表明，確定的HPLC色譜條件，可以分離各原料及中間體雜質(zhì)，各雜質(zhì)與拉呋替丁主峰之間沒有干擾。2.2.4最小檢出稱取拉呋替丁對照品1.9mg置10ml量瓶中，用流動相A溶解并稀釋至10ml，將此溶液稀釋100倍，分別進樣10l、5l和3l，測定。經(jīng)對圖譜分析，進樣3l時，信噪比為3，最小檢出量為5.7g。2.2.5不同測定方法的比較分別采用等度和梯度兩種不同檢測方法，對同一樣品進行檢測比較。取同批拉呋替丁樣品（試驗樣品為130902批穩(wěn)定性加速6個月，分別用兩種不同的測定方法進

18、行測定，測定結(jié)果見表7和表8。表7 等度法有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果雜質(zhì)1雜質(zhì)2總雜質(zhì)（%）拉呋替丁主峰保留時間（分）17.6729.3318.66雜質(zhì)含量（%）0.0350.0660.07-表8梯度法有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果雜質(zhì)1雜質(zhì)2雜質(zhì)3總雜質(zhì)（%）拉呋替丁主峰保留時間（分）5.1110.3719.2418.66雜質(zhì)含量（%）0.020.070.070.13-由測定結(jié)果的比較可以看出，采用修訂后的測定方法，主峰前的雜質(zhì)與主峰的分離度比原標準更好；另外，采用等度方法，不能將易溶于有機相的雜質(zhì)檢出，在主峰后只檢出1個雜質(zhì)，而采用梯度的方法，可以測定不同極性的化合物，在主峰后，可檢出更多的雜質(zhì)，梯度測定的方法更

19、為靈敏和準確。2.3對硝基苯酚測定方法驗證2.3.1檢測波長的確定溶液配制：稱取對硝基苯酚5mg，置50ml量瓶中，加乙腈-水（4060）溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml至10ml量瓶中，加乙腈-水（4060）稀釋至刻度，搖勻。取此對硝基苯酚溶液，在190nm700nm波長處進行紫外-可見光譜掃描。試驗結(jié)果表明，對硝基苯酚的最大吸收波長為316.2nm。2.3.2專屬性試驗取0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈（91）溶液為空白溶液，分別取空白溶液、對照品溶液和供試品溶液，注入色譜儀，照上述測定方法進行測定。由色譜圖可見，空白溶液對對硝基苯酚的測定沒有干擾。2.3.3系統(tǒng)適用性試驗量取

20、對照品溶液10l，連續(xù)注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以最后6針峰面積計算，RSD應(yīng)不大于5.0%。測定結(jié)果見下表9：表9系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果序號123456平均峰面積1952185319291947185319451913RSD%=2.47系統(tǒng)適用性符合要求。2.3.4線性取對照品貯備液，按下表進行稀釋，制備線性測定的各對照品溶液。表10 線性溶液配制列表序號123456取對照品儲備液體積（ml）4445440稀釋體積（ml）20010050502520濃度（g/ml）0.010320.020640.041280.05160.082560.1032按測定方法進行測定。測定結(jié)果見表11。表11 線性

21、測定結(jié)果序號123456濃度（g/ml）0.010320.020640.041280.05160.082560.1032平均峰面積3677081504184131354130試驗結(jié)果：對硝基苯酚線性范圍為0.01mg/ml0.1mg/ml，線性方程為y =40308x 132.58，相關(guān)系數(shù)r0.9984試驗表明，對硝基苯酚溶液濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。2.3.5穩(wěn)定性試驗取對硝基苯酚對照品溶液，分別在0、2、5、22、23、24小時進行測定，測定結(jié)果見表12。表12溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果時間（小時）峰面積相對零時回收率（%）019521002185294.885183293.852219159

22、8.16232026103.824186895.70穩(wěn)定性試驗表明，對照品溶液在24小時內(nèi)測定，測定結(jié)果未見明顯變化，表明溶液在24小時內(nèi)是穩(wěn)定的。2.3.6最小定量限和最小檢出限定量限的測定：取對照品溶液稀釋10倍，按測定方法進行測定，信噪比約為10。檢測限測定：取對照品溶液稀釋20倍，按測定方法進行測定，信噪比約為3。測定結(jié)果見表13。表13定量限和檢測限試驗結(jié)果定量限檢測限峰面積濃度信噪比峰面積濃度信噪比18610ng/ml9.61135ng/ml3.22.3.7重復(fù)性試驗取同一批拉呋替丁樣品（130901批），按檢驗方法，同時測定6份，測定結(jié)果見表14。重復(fù)性試驗結(jié)果，對硝基苯酚含量測定的平均值為0.0012%，RSD為13.1%，重復(fù)性良好