免疫比濁法測(cè)C反應(yīng)蛋白

1、免疫比濁法是抗原抗體結(jié)合動(dòng)態(tài)測(cè)定方法。其基本原理是：當(dāng)抗原與抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)而且比例合適（一般規(guī)定抗體過量）時(shí)，形成的可溶性免疫復(fù)合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚劑（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出， 形成微粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)抗體濃度固定時(shí)，形成的免疫復(fù)合物的 量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度也隨之增加。通過測(cè)定 反應(yīng)液的濁度與一系列標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，即可計(jì)算出檢樣中抗原的含量?？贵w（Ab）與可溶性抗原（Ag）反應(yīng)，形成一定結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物，成為 懸浮丁反應(yīng)溶液中的微粒。在沉淀反應(yīng)中形成的復(fù)合物微粒具有特殊的光 學(xué)性質(zhì)，可用儀器檢測(cè)，提高了檢測(cè)的速度、靈敏度和易操作性。免疫比濁測(cè)定注

2、意事項(xiàng)：1、抗原或抗體量大大過剩，可出現(xiàn)可溶性復(fù)合物，造成誤差。2、應(yīng)維持反應(yīng)管中抗體蛋白始終過剩。3、易受到脂血的影響。分類1. 免疫透射比濁法 抗原抗體結(jié)合后，形成免疫復(fù)合物，在一定時(shí)間內(nèi) 復(fù)合物聚合出現(xiàn)濁度。當(dāng)光線通過溶液時(shí)，可被免疫復(fù)合物吸收。免疫復(fù) 合物量越多，光線吸收越多。光線被吸收的量在一定范圍內(nèi)與免疫復(fù)合物 的量成正比。利用比濁計(jì)測(cè)定光密度值，復(fù)合物的含量與光密度值成正比，同樣當(dāng)抗體量一定時(shí)，光密度值也與抗原含量成正比。本法較單向瓊脂擴(kuò) 散試驗(yàn)和火箭電泳等一般免疫化學(xué)定量方法敏感、快速簡(jiǎn)便，但要求免疫 復(fù)合物的數(shù)量和分子量達(dá)到一定高度，否則就難以測(cè)出。2. 免疫散射比濁法 一定

3、波長(zhǎng)的光沿水平軸照射，通過溶液使遇到抗原 抗體復(fù)合物粒子，光線被粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)和抗原抗體復(fù)合物顆粒大小和多少密切相關(guān)。散射光的強(qiáng)度與 復(fù)合物的含量成正比，即待測(cè)抗原越多，形成的復(fù)合物也越多，散射光也 越強(qiáng)。散射光的強(qiáng)度還與各種物理因素，如加入抗原或抗體的時(shí)間、光源 的強(qiáng)弱和波長(zhǎng)、測(cè)量角度等密切相關(guān)。散射比濁法乂分為速率散射比濁法 和終點(diǎn)散射比濁法。3. 免疫膠乳比濁法 膠乳比濁法即是將待測(cè)物質(zhì)相對(duì)應(yīng)的抗體包被在 直徑為15- 60nm的膠乳顆粒上，使抗原抗體結(jié)合物的體積增大，光通過之 后，透射光和散射光的強(qiáng)度變化更為顯著，從而提高試驗(yàn)的敏感性。實(shí)驗(yàn)八 免疫

4、比濁法測(cè)定C-反應(yīng)蛋白【原理】血活C反應(yīng)蛋白（CRI?與試劑中抗人CRFB體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，一 起吸光度增加，在波長(zhǎng)340nm和700nm處測(cè)定免疫復(fù)合物濁度。根據(jù)吸光度增加量，即可定量檢測(cè)血活中CRP勺含量【試劑】1. 0.1 mol/L 的 Tris 緩沖液。2. 羊抗人CRFB血活。3. CRRS標(biāo)液。加入匕物空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管血清彳示本（l）一一15表8-1免疫比濁法測(cè)定C反應(yīng)蛋白操作步驟CR昵標(biāo)液（1）15生理鹽水（1）15一【操作步驟】見表8-1。緩沖液（1）350350350混合，丁 37 C 保溫 5 min，在波長(zhǎng) 340nmffi 700nmft讀各管吸光度（A1 3

5、40、A1700）抗人CRP抗血活（505050l）混合，丁 37 C 保溫 5 min，在波長(zhǎng) 340nmffi 700nmft讀各管吸光度（A23" A&0）【計(jì)算】HDL-C含量（mmol/L） =X 標(biāo)準(zhǔn)液濃度/ A= （A2340 A200） （A1 340- A1700）【參考范圍】血活C反應(yīng)蛋白 4mg/L（各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有自己的參考范圍）【注意事項(xiàng)】1.使用新鮮血活，并盡可能快地檢測(cè)。2 .試劑不能冷凍保存。【臨床意義】CRPI一種急性相蛋白，肝臟是其主要的合成器官。最近研究表明，人體其 他部位如冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、腎小管 上皮

6、細(xì)胞等在炎癥刺激或病理狀態(tài)下都能合成和分泌CRP正常情況下，CRPZ微量存在丁健康人的血活中，但在機(jī)體有細(xì)菌感染、組織損傷、腫瘤形成等急性 相刺激時(shí),CR冰平可升至正常的100倍甚至更高。測(cè)定CRPM丁鑒別感染、監(jiān) 測(cè)疾病活動(dòng)情況及嚴(yán)重程度、器質(zhì)性疾病的篩檢、監(jiān)測(cè)器官移植受體排斥反應(yīng)及 療效觀察、冠心病等急性血管意外事件的預(yù)測(cè)與診治等有很好的導(dǎo)向作用?！驹u(píng)價(jià)】CRP勺檢測(cè)方法從靈敏度較低的免疫擴(kuò)散法、火箭電泳法、膠乳凝集試驗(yàn)到 高靈敏度、高精密度的放射免疫、酶免疫、免疫比濁等定量試驗(yàn)。多數(shù)情況下，半定量的膠乳凝集試驗(yàn)適合于篩查，但其影響因素多、靈敏度較差和不能精確定 量。對(duì)于需作較精確的CRP

7、量測(cè)定，免疫濁度法較為合適。其他方法如ELISA、 免疫發(fā)光法和化學(xué)發(fā)光法雖然靈敏度和精確度都較高，但其成本也較高，故不是理想的臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法。1材料與方法1.1兔抗人白蛋白免疫毯化膠乳的制備1.1.1兔抗人白蛋白抗體的制備采用 25%人血漿白蛋白注射液，按常規(guī)免疫 新西蘭純種白兔，獲得兔抗人白蛋白免疫血活（效價(jià) 1:32）,經(jīng)飽和硫酸鉉沉淀 后，過DE 52層析柱，IgG峰部洗脫液用Follin酚法于540nm處定量測(cè)定IgG 蛋白含量，并用聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳鑒定，僅出現(xiàn)一條區(qū)帶。1.1.2兔抗人白蛋白免疫毯化膠乳的制備取 10%毯化聚苯乙烯膠乳懸:液（軍 事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心產(chǎn)品

8、，=0.6 m）,用pH8.2甘氨酸緩沖液（GBS）稀釋 成1 %濃度，將其于兔抗人白蛋白IgG按適當(dāng)比例混合，以常規(guī)物理吸附法致敏 膠乳2。1.2敏感性試驗(yàn)取25%人血漿白蛋白20 I,加入生理鹽水180 I,再經(jīng)系列稀釋成10個(gè) 濃度，其濃度范圍在25mg/ml3.125ng/ml之間，用兔抗人免疫毯化膠乳做 3次 重復(fù)檢測(cè)。1.3特異性試驗(yàn)將牛、馬、羊、豚鼠血活分別稀釋至5%、2.5%和1.25%,用兔抗人白蛋白免疫毯化膠乳檢測(cè)。1.4重復(fù)性試驗(yàn)用四批兔抗人白蛋白免疫毯化膠乳，對(duì)5份糞微量白蛋白陽性糞便標(biāo)本和 2 份已知濃度白蛋白溶液平行檢測(cè)，并在有效期內(nèi)用同一批免疫毯化膠乳先后7次重復(fù)

9、檢測(cè)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。3討論兔抗人白蛋白免疫毯化膠乳試劑對(duì)糞微量白蛋白的檢測(cè)，是針對(duì)糞便中由 于病變部位出血后的血漿蛋白，或組織滲出液中的白蛋白。而檢測(cè)糞微量白蛋白 作為大腸腫瘤的篩檢手段之一，最早是在1987年，日本中山拓郎等曾用ELISA法對(duì)糞潛白蛋白(Occultalbmin)進(jìn)行定量檢測(cè)，并認(rèn)為其敏感性優(yōu)丁便潛血。 1993年，我們制備和建立了兔抗人白蛋白免疫埃化膠乳試劑和反向膠乳凝集試 驗(yàn)，檢測(cè)了 378例已知患者和正常人糞便標(biāo)本，其臨床結(jié)果顯示： 56例大腸癌 診斷敏感性55.4%，特異性82.6%; 132例正常人陽性率17.4%。近來我們?cè)黾?了已知患者數(shù)量，重新檢測(cè)了 161

10、例正常人糞微量白蛋白，結(jié)果表明：在增加受 檢人數(shù)后，提高了大腸癌的診斷敏感性(76.8%),而特異性則無顯著差別(80.0%); 161例正常人陽性率為19.2%,比原來的132例正常人陽性率高1.8%。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在受檢人數(shù)增多的情況下，用該試劑檢測(cè)糞微量白蛋白可能會(huì)達(dá) 到提高診斷敏感性，保持特異性的良好效果。C-反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑盒(全量程)試制工作總結(jié)一、概述C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein )是一種能與肺炎鏈球菌C多糖體反應(yīng)形成 復(fù)合物的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，半衰期 19小時(shí)；血活CRP由肝臟合成，白細(xì)胞 介素1b、6以及腫瘤壞死因子是其合成的最重要的調(diào)節(jié)因子；CRP的分

11、子量為105 500 ,由含有五個(gè)相同的未糖基化的多肽業(yè)單位組成，每個(gè)業(yè)單位含有187個(gè)氨基酸，這些業(yè)單位問通過非共價(jià)鍵連結(jié)成環(huán)狀的五聚體，并有一個(gè)鏈問二硫 鍵。1930年，Tillett和Francis首次在急性大葉性肺炎患者的血活中發(fā)現(xiàn)一種能在Ca2+存在時(shí)與肺炎球菌細(xì)胞壁中的 C 一多糖發(fā)生特異性沉淀反應(yīng)的物質(zhì)。1941 年，Avery等測(cè)知它是一種蛋白質(zhì)，故稱為 C反應(yīng)蛋白(CRP)。1944年，Jones 將其作為臨床風(fēng)濕熱診斷標(biāo)準(zhǔn)的次要指標(biāo)之一。后來，人們?cè)诜歉腥拘约膊『透?染性疾病患者的急性期血活中都測(cè)到了 CRP,于是人們認(rèn)為，CRP是組織損傷 的一種非特異性反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)

12、現(xiàn)：病蠹或細(xì)菌感染、梗塞、免疫復(fù)合物沉 積等因素都可導(dǎo)致組織損傷。在組織損傷的急性期，肝臟合成的一些血漿蛋白顯 著增加，這些蛋白質(zhì)通稱為急性時(shí)相蛋白，其中CRP是急性時(shí)相蛋白中變化最顯著的一種。CRP在正常人血活中其含量極微；在組織受到損傷、炎癥、感染 或腫瘤破壞時(shí)CRP可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)急劇上升，可增高數(shù)倍或數(shù)白倍，2-3天達(dá)峰值，待病情改善時(shí)逐漸下降，恢復(fù)正常。CRP被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的早期診斷及鑒別診斷，其升高可見于：1、組織損傷、感染、腫瘤、心肌梗塞及一系 列急慢性炎癥性疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性血管炎、多肌癰風(fēng)濕??；2、術(shù)后感染及并發(fā)癥的指標(biāo)：手術(shù)后病人 CRP升高，術(shù)后7-10天C

13、RP水平應(yīng)下 降，如CRP不降低或再次升高，提示可能并發(fā)感染或血栓栓塞；3、可作為細(xì)菌性感染和病蠹性感染的鑒別診斷：大多數(shù)細(xì)菌性感染會(huì)引起患者血活CRP升局,而病蠹性感染則多數(shù)不升局0超敏 C 反應(yīng)蛋白(High sensitivity C-reactive protein )與 CRP 并不是兩種 蛋白，只是從靈敏度上加以區(qū)分，超敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)最低檢測(cè)限達(dá)0.1 mg/l;原先認(rèn)為CRP是正常的血活卻發(fā)現(xiàn)同未來發(fā)生心血管疾病密切相關(guān)，大量 研究資料表明，動(dòng)脈粥樣化的血栓去除了是脂肪堆積的過程外也是一個(gè)慢性炎癥 MHHIIHH 立的危險(xiǎn)因素；HS-CRP已被證實(shí)是由慢性炎癥引發(fā)心

14、血有較高的靈敏度但線 性較低，這樣就出現(xiàn)了一種試劑兩種名稱，用途也有所區(qū)別；近幾年來，隨著檢 驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，開始出現(xiàn)了一種全量程CRP,這種CRP即能滿足較高的靈敏度， 乂能滿足較高的線性，如日本一化，申索佑福等，我公司通過與中科院上海生物 研究所合作，近期已完成全量程 CRP的試制，經(jīng)公司自檢與醫(yī)院試用，結(jié)果表 明與免疫散射比濁法一致性好；公司已計(jì)劃于近期完成臨床與注冊(cè)，正式推向市 場(chǎng)；二、國內(nèi)外研究情況2.1臨床研究CRP作為一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，被廣泛應(yīng)用于臨床。2.1.1用于細(xì)菌和病蠹感染的鑒別診斷當(dāng)細(xì)菌感染引發(fā)炎癥，在炎癥進(jìn)程開始 47小時(shí)就可開始升高，且升高的 幅度與細(xì)菌感染的嚴(yán)重

15、程度相一致，病蠹感染時(shí) CRP不增高，以此鑒別感染的 性質(zhì)，指導(dǎo)臨床治療，減少不管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，檢測(cè)其濃度對(duì)心血管疾病 的干預(yù)及預(yù)后起重要作用而被臨床重視。流行病學(xué)調(diào)查也顯示，hs-CRP水平升高者發(fā)生急性腦卒中的幾率是正常健康人的 2倍，發(fā)生心肌梗死的幾率是正常 者的3倍。2003年歐洲高血壓防治指南（ESH/ESC）正式推薦，高血壓患者 需檢測(cè)hs-CRP水平。目前國內(nèi)用于全自動(dòng)生化儀的免疫透射比濁法試劑CRP出現(xiàn)了兩種（普通CRP與超敏CRP ），普通CRP有較高的線性但靈敏度不好，超敏 CRP必要 的抗生素治療，有效防止抗生素的濫用。這些感染臨床上常見于肺炎、支氣管炎、 咽喉炎、

16、細(xì)菌性腦膜炎、傷寒、化膿性關(guān)節(jié)炎、尿路感染、骨盆炎、闌尾炎等等。 在鑒別細(xì)菌或病蠹感染方面，比白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)更準(zhǔn)確，特別是老年人， 免疫系統(tǒng)反應(yīng)順應(yīng)性下降，可能有感染發(fā)生但臨床上并無發(fā)熱、白細(xì)胞升高等情 況，此時(shí)檢測(cè)CRP有助于檢出細(xì)菌感染。2.1.2腫瘤監(jiān)測(cè)CRP的測(cè)定用于腫瘤的治療和預(yù)后：CRP術(shù)前上升，術(shù)后下降，不受放療、 化療和皮質(zhì)激素治療的影響，有助于臨床評(píng)估腫瘤的進(jìn)程。2.1.3監(jiān)控病情變化及術(shù)后感染，并用于抗生素療效觀察CRP在血中升高的幅度與感染的程度正相關(guān)。有研究表明，術(shù)后 6小時(shí)左 右，CRP開始升高，如無并發(fā)癥應(yīng)在術(shù)后三天下降直至正常，如術(shù)后出現(xiàn)感染， 則CRP長(zhǎng)時(shí)

17、間不下降；術(shù)前CRP升高者，術(shù)后感染率也遠(yuǎn)高于術(shù)前 CRP不高 者。對(duì)于燒傷病人，可檢測(cè) CRP以警示是否發(fā)生敗血癥，以便及時(shí)應(yīng)對(duì)治療。 對(duì)疑有敗血癥的新生兒，在 2448小時(shí)內(nèi)作CRP的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可作為是否停 止抗生素治療的可靠依據(jù)，而血培養(yǎng)的時(shí)間則需更長(zhǎng)，培養(yǎng)結(jié)果出來之前無法排 除敗血癥。對(duì)細(xì)菌感染作抗生素治療時(shí)，動(dòng)態(tài)檢測(cè) CRP是必要的，它比臨床體 征更早作出并發(fā)癥警報(bào)和治療效果的判定，在粒細(xì)胞缺乏癥或機(jī)體免疫狀態(tài)抑制 時(shí)更有臨床意義。2.1.4用于評(píng)估急性胰腺炎的嚴(yán)重程度入院時(shí)CRP>110mg/l ,可能是出血性胰腺炎（臨床靈敏度8 8%,特異性9 4%）;當(dāng)CRP>25

18、0mg/l時(shí)，可提示為廣泛性壞死性胰腺炎。2.1.5風(fēng)濕病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者CRP與疾病相關(guān)性較大，比臨床癥狀出現(xiàn)要早4-6周。2.1.6肺部感染肺炎在年老人群中較難診斷，通常不大有發(fā)熱。在許多情況TCRP>100mg/l ,提示細(xì)菌感染，如肺炎或化膿性支氣管炎。典型的病蠹性肺炎不會(huì)超過 50mg/l。2.1.7兒科感染性疾?。涸趦和毙粤馨图?xì)胞白血病常發(fā)性細(xì)菌敗血癥，CRP超過100mg/ L,則視為有細(xì)菌感染；兒童CRP細(xì)菌性腦膜炎時(shí)平均195mg/L ,而病蠹性腦膜炎則低得多。2.1.8腎臟移植排異移值后8天CRP下降至正常，如發(fā)生排斥反應(yīng)則血活肌酊、尿氮、CRP皆升高。 CRP升

19、高在排斥反應(yīng)發(fā)生之前4天出現(xiàn)。但是，感染也可發(fā)生CRP升高，要注 意兩者鑒別。2.1.9心血管疾病隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，原先認(rèn)為CRP是正常的血活卻發(fā)現(xiàn)同未來發(fā)生心血 管疾病密切相關(guān)，大量研究資料表明，動(dòng)脈粥樣化的血栓去除了是脂肪堆積的過程 外也是一個(gè)慢性炎癥過程，；CRP輕度升高與冠狀動(dòng)脈事件、中風(fēng)及周圍血管病 相關(guān)，是一項(xiàng)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素； 未來發(fā)生心血管疾病發(fā)病率和死亡率的預(yù)測(cè)指標(biāo)Hs-CRP是健康人未來發(fā)生心血管事件一個(gè)有價(jià)值的預(yù)測(cè)指標(biāo)，許多研究證 實(shí)Hs-CRP能預(yù)測(cè)首次心肌梗死和疾病的發(fā)作，內(nèi)科健康研究（ PHS）顯示， Hs-CRP位于最高四分位數(shù)的病人未來發(fā)生卒中危險(xiǎn)增加 2倍，未

20、來發(fā)生心肌梗 死危險(xiǎn)增加3倍，未來發(fā)生周圍血管疾病的危險(xiǎn)增加 4倍。這種預(yù)測(cè)作用長(zhǎng)期 穩(wěn)定存在于吸煙和非吸煙者中，且獨(dú)立于其他危險(xiǎn)因素。Hs-CRP是已知CHD病人未來心血管病發(fā)病和死亡的預(yù)測(cè)指標(biāo)，歐洲ECTA研究組的資料顯示，穩(wěn)定 性心絞癰（SAP）和不穩(wěn)定性心絞癰（UAP）病人Hs-CRP濃度每升高一個(gè)標(biāo) 準(zhǔn)差，非致命性心肌梗死或心臟性猝死的相對(duì)危險(xiǎn)增加45%。 急性冠脈綜合癥（ACS）的預(yù)后指標(biāo)Hs-CRP測(cè)定對(duì)ACS的預(yù)后價(jià)值，首先是在急性局部缺血和不穩(wěn)定心絞癰 的病人中提出的，重度不穩(wěn)定型心絞癰（UAP ）病人入院時(shí)若Hs-CRA 3mg/l比Hs-CRP < 3mg/l者心絞

21、癰復(fù)發(fā)、冠狀動(dòng)脈血管置換術(shù)、心肌梗死和心血管疾病致死等心血 管事件發(fā)生率高；出院時(shí)測(cè) Hs-CRP比入院時(shí)測(cè)能更好的預(yù)測(cè)90天的不良后 果；檢測(cè)Hs-CRP有助于鑒別心肌鈣蛋白（cTn）陰性而病死率增高的病人，應(yīng) 聯(lián)合合使用cTn與Hs-CRP來評(píng)估ACS危險(xiǎn)程度，ACS病人入院時(shí)Hs-CRa 5mg/l與半年內(nèi)嚴(yán)重心臟病發(fā)病率升高相關(guān)，而不管cTn值如何。 與TC/HDL-C聯(lián)合預(yù)測(cè)冠心病危險(xiǎn)在冠心病的危險(xiǎn)性研究評(píng)估時(shí)，Hs-CRP與血脂指標(biāo)是獨(dú)立的變量，將兩者同 時(shí)檢測(cè)并聯(lián)合分析，在諸多變量分析過程中，記錄諸多冠心病危險(xiǎn)因素如肥胖 高 血壓糖尿病冠心病家族史等，各種生化指標(biāo)中僅Hs-CRP

22、與TC/HDL-C有單獨(dú) 的預(yù)測(cè)價(jià)值，兩者聯(lián)合意義更大。2.2國內(nèi)外試劑盒發(fā)展CRP的測(cè)定方法較多，一般分為定性與定量?jī)煞N。定性方法有：用純化了的肺炎球菌C-組分與病人血活反應(yīng)的沉淀法、肺炎球菌莢膜腫脹試驗(yàn)、特異性抗血活與CRP反應(yīng)的毛細(xì)管沉淀試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、乳膠擴(kuò)散沉淀試驗(yàn)等，但它們的靈敏度低，只用于定性檢測(cè)。定量檢測(cè)的有：放射免疫（RIA）、熒光免疫（FIA）、酶標(biāo)免疫（ELISA）、速率散射比濁法（INA）、膠乳增強(qiáng)透 射比濁法（ITA）;定性與定量相結(jié)合的方法有：快速檢測(cè)卡結(jié)合儀器法；其中放射法對(duì)人傷輻射傷害較大，已較少使用，熒光免疫 （FIA）或化學(xué)發(fā)光需專用儀 器

23、且成本高，ELISA法多數(shù)為半自動(dòng)操作，出結(jié)果慢，不適合批量檢測(cè)；速率散 射比濁法（INA）需與比濁儀搭配使用，增加了儀器成本；快速檢測(cè)卡結(jié)合儀器法只是半定量試劑，不能準(zhǔn)確定量；膠乳增強(qiáng)透射比濁法（ITA）是目前醫(yī)院較 多使用的方法之一。目前國內(nèi)有兩種試劑，即普通CRP與超敏CRP, 一個(gè)項(xiàng)目， 兩種試劑，給用戶帶來了不便；隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，近幾年已出現(xiàn)了一種即有局線性乂有高靈敏度的試劑，即全量程 CRP,目前國外已有Orion公司、日本 一化，申索佑福等公司推出了此種試劑，我公司通過與中科院上海生物研究所合作，近期已完成全量程CRP的試制，經(jīng)公司自檢與醫(yī)院試用，結(jié)果表明與免疫散射比濁法一致

24、性好；公司已計(jì)劃于近期完成臨床與注冊(cè)，正式推向市場(chǎng)；全 量程CRP即有普通CRP的高線性，乂有超敏CRP的高靈活敏度，因此，CRP 即可作炎癥標(biāo)志物，也可用作Hs-CRP用于心血管疾病的預(yù)測(cè)與預(yù)后。三、試制過程目前，測(cè)定CRP的方法有很多，定性或半定量方法由于不是準(zhǔn)確定量，已 較少使用；定量方法放射免疫（RIA）、熒光免疫（FIA）、酶標(biāo)免疫（ELISA）、速率 散射比濁法（INA）、膠乳增強(qiáng)透射比濁法（ITA）等中以后兩種使用較多；目前國外已有Orion公司、日本一化，申索佑福等推出了膠乳增強(qiáng)透射比濁 法試劑，國內(nèi)大多為進(jìn)口試劑，我公司通過與中科院上海生研所合作，已完成小 樣制備，并計(jì)劃于近

25、期報(bào)批上市。3.1原理與試劑成份血漿中的CRP與試劑中膠乳包被的特異性抗體相結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合 物產(chǎn)生混濁；在一定的抗體濃度范圍內(nèi)，其濁度高低與血活CRP含量成正比。通 過測(cè)定特定波長(zhǎng)的吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出血活中CRP的含量。試劑成份： 磷酸鹽100mM表面活性劑復(fù)合抗體當(dāng)光線通過個(gè)渾濁介質(zhì)溶液時(shí)，由于溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收了一部 分,吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測(cè)定光吸收量的方法稱為透射比濁 法。因有抗原抗體反應(yīng)，固稱為免疫透射比濁法，為增強(qiáng)靈敏度，采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法?？乖c抗體在一定條件下才能形成復(fù)合物，一定條件包括： 抗體的要求抗體要求效價(jià)高（保持高線性）

26、，純度高（如不純，則有可能含其它抗體而 有非特反應(yīng)從而導(dǎo)致結(jié)果偏高），親和力要強(qiáng)（親和力強(qiáng)生成的抗原抗體復(fù)合物才穩(wěn)定，不易解離） 抗原抗體比例要求免疫復(fù)合物形成有三個(gè)階段，第一階段是形成抗原抗體復(fù)體物，第二階段是 復(fù)合物交聯(lián)形成大網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，第三階段是復(fù)合物聚合而形成沉淀。只有在抗體過 量時(shí)，其濁度才會(huì)隨著CRP的增加面增加，若抗原過剩則會(huì)出現(xiàn) HOOK效應(yīng)而導(dǎo)致結(jié)果偏低而不準(zhǔn)； 促進(jìn)劑與穩(wěn)定劑一般要求溶液中有非離子性親水性多聚體促進(jìn)免疫復(fù)合物的形成，如PEG6000，含量 3-4%。 PH 一般在6.5-8.0之間,過酸過堿均會(huì)破壞試劑中抗體與樣本中的抗原。3.2膠乳的選擇與制備由于測(cè)定用的波

27、長(zhǎng)與粒徑大小有關(guān)，因此粒徑的均一性是影響測(cè)量精密 度與均確度的一個(gè)重要因素。公司選用聚苯乙烯膠乳，聚苯乙烯膠乳用乳液聚合 法制備小分子納米（25-50nm ）,采用微孔過濾技術(shù)，保證顆粒大小的一致性， 小分子納米顆粒較一股顆粒（100-300nm ）顆粒更小，不易發(fā)生自沉；過濾后的 膠乳進(jìn)行毯化，使毯基均勻分布于膠乳的表面。再把毯化的膠乳與D-二聚體抗體結(jié)合，結(jié)合方式包含物理吸附與化學(xué)交聯(lián)兩種，以增強(qiáng)抗原捕獲能力，縮短反 應(yīng)時(shí)間，整過反應(yīng)過程在3-5分鐘內(nèi)結(jié)束，且化學(xué)交聯(lián)后形成的抗原抗體復(fù)合物 更緊密，不易解離，結(jié)果更準(zhǔn)確，精密度更好。表一、小分子納米技術(shù)與化學(xué)交聯(lián)技術(shù)應(yīng)用后的D-二聚體的精密

28、度與準(zhǔn)確度XSDCv(%)批內(nèi)（n=20）1.50.064.0012322.44批問(n=20)1.40.053.571231.61.30靶值測(cè)量值偏差相對(duì)偏 差質(zhì)控12.02.150.157.5%質(zhì)控2109.620.383.8%質(zhì)控3136138.52.51.84%膠乳粒子在100-300nm時(shí)，膠乳顆粒易自沉，造成瓶間差批問差過大，而 且由于粒徑過大，造成反應(yīng)為非均相反應(yīng)，CV變異較大，我公司采用創(chuàng)新的小分子納米技術(shù)，大大的延長(zhǎng)了定標(biāo)有效期，縮小了瓶問差與批問差，為真正意義 上的均相反應(yīng)。表二、膠乳粒徑與定標(biāo)有效期、瓶問 CV、批問CV等關(guān)系膠乳粒徑（nm）定標(biāo)有效期（天）是否均相反應(yīng)是

29、否自沉100-3007-14非均相自沉25-5028均相均相分布，不自 機(jī)批內(nèi)CV (%),N=20瓶問CV (%),N=20批問CV (%),N=20100-3004.55.56.825-502.83.04.1普通膠乳只通過物理吸附抗體，形成共價(jià)交聯(lián)，共價(jià)交聯(lián)結(jié)合相對(duì)不牢靠， 而且吸附的抗體較少，會(huì)造成試劑線性偏或靈敏度低；我公司采用物理吸附的共 價(jià)交聯(lián)與化學(xué)交聯(lián)相結(jié)合技術(shù)（化學(xué)交聯(lián)通過縮合劑炭化二業(yè)胺將膠乳上的毯基依聯(lián)物上的氨基縮合在F）,大大提高了試劑的穩(wěn)定性與靈敏度；表三、同交聯(lián)膠乳試劑靈敏度與試劑穩(wěn)定性共價(jià)交聯(lián)穩(wěn)定6個(gè)月靈敏度較低反應(yīng)慢，復(fù)合物不太穩(wěn) 定化學(xué)交聯(lián)穩(wěn)定9個(gè)月靈敏度局反應(yīng)

30、快，復(fù)合物穩(wěn)定共價(jià)+化學(xué)交 聯(lián)穩(wěn)定12個(gè) 月靈敏度局反應(yīng)快，復(fù)合物很穩(wěn)定3.3抗體的選擇與純化抗體的純度對(duì)測(cè)定的特異性有直接影響。不純的抗體將導(dǎo)致非特異反應(yīng)，引起結(jié)果假性升高，測(cè)量值不準(zhǔn)等情況。因此必須采用單克隆抗體與親和層析技術(shù)純化的抗體，并用SDS-PAGE鑒定純度，如出現(xiàn)多條電泳帶，則多明雜蛋白較多，需更進(jìn)一步純化；公司CRP抗體采用羊抗人多克克隆抗體與鼠抗人單克隆抗體的復(fù)合抗體，采用山羊或鼠體內(nèi)誘生法產(chǎn)生,產(chǎn)生的腹水用濾紙過濾,去除脂質(zhì)與大顆粒,再用離心的方法去除細(xì)胞碎片和大的蛋白質(zhì)，制成粗抗體；將粗抗原或純化抗原交聯(lián)到瓊脂糖珠SEPHAROSE 4B制成親和層析柱，將粗抗體通過親和層

31、析柱洗去未結(jié)合的非特異性蛋白，再用硫割酸鉀洗脫，洗脫流出液即為純的多克隆抗體?？贵w的效價(jià)：要求效價(jià)至少大于1: 16,效價(jià)為抗體能引起濁度變化的最大 稀釋倍數(shù)，公司采用的復(fù)合抗體中羊抗人多克克隆抗體效價(jià)大于1:16,鼠抗人單克隆抗體效價(jià)大于1:128;多抗保證線性與高值，單抗保證靈敏度與低值；抗體的保存：凍十抗體具有穩(wěn)定性好，保質(zhì)期長(zhǎng)等特點(diǎn)，適合于長(zhǎng)期保存，配成試劑后可加適量甘油與BSA作穩(wěn)定劑；多克隆抗體、單克隆抗體等復(fù)合抗體技術(shù)即保證了靈敏度與高線性，與普通 CRP與超敏CRP兩種試劑等效，方便了醫(yī)院操作；親和層析技術(shù)的應(yīng)用，大大 提高了抗體的純度與效價(jià)，最大限度避免了非特異性反應(yīng)，使結(jié)果

32、準(zhǔn)確性有了較大提高，精密度更好；表四、親和層析與復(fù)合抗體技術(shù)應(yīng)用后 D-二聚體的精密度與準(zhǔn)確度XSDCv(%)批內(nèi)（n=20）1.50.053.331232.62.11批問(n=20)1.40.064.01253.02.4靶值測(cè)量值偏差相對(duì)偏 差質(zhì)控122.080.084%質(zhì)控21010.30.33%質(zhì)控3136134-21.5%3.4微孔濾膜孔徑的選擇試劑的穩(wěn)定性因素主要有膠乳抗體的純度，緩沖液的品質(zhì)，試劑中的懸浮 小顆粒，此小顆粒肉眼看不到，漂浮于試劑中，影響光的吸收，且用常規(guī)過濾無法去 除,其主要成份為雜質(zhì)、短纖維和細(xì)菌，這是導(dǎo)致瓶間與批問差大的原因之一。由于普通膠乳顆粒采用100-30

33、0nm，所以只能用常規(guī)過濾，無法去除雜質(zhì), 我公司由于采用小分子納米（20-50nm）技術(shù)，可以采用特殊微膜過濾，通過過 濾膜孔徑的研究發(fā)現(xiàn)，小孔徑過濾可以顯著改善試劑的精密度，延長(zhǎng)定標(biāo)穩(wěn)定期，縮小批問差；表五、濾膜孔徑與變異系數(shù)，定標(biāo)有效期的關(guān)系（n=20）孔徑（im）0.250.450.60.81.01.2CV (%)3.24.55.15.67.58.2定標(biāo)有效期（天）281410875當(dāng)孔徑在1四m時(shí)，基本可以除去一般的雜質(zhì)微粒，當(dāng)孔徑在 0.45四m時(shí)， 基本可以除去短小纖維，當(dāng)孔徑在0.25四m時(shí)，基本可以除細(xì)菌等微生物；實(shí)驗(yàn)表 明當(dāng)孔徑在0.22叩時(shí)延長(zhǎng)定標(biāo)穩(wěn)定期,縮小批問差，可能與去除細(xì)菌有關(guān)，試劑更穩(wěn)定；3.5穩(wěn)定劑、保護(hù)劑的選擇與優(yōu)化膠乳溶液介于小分子離子溶液與粗分散體系之間，膠乳抗體顆粒作布朗運(yùn) 動(dòng),不易受重力影響而下沉。但膠乳抗體溶液不是穩(wěn)定體系，當(dāng)顆粒相互碰撞時(shí)，有時(shí)會(huì)自動(dòng)合并為較大、較重顆粒而引起自沉；影響自沉的原因如下：膠乳顆粒間的相互引力，可能引起合并變成大顆粒； 膠粒帶電情況，一種膠乳的粒子都帶有相同電荷，同性相斥，膠粒帶電量越大，排斥越大，越不易自沉； 膠粒之間的溶劑膜，這種液膜有反抗二固體接近的排斥力，這種排斥力與緩沖液、合適的PH,穩(wěn)定劑等相關(guān)；我公司選擇CC+PEG作為促進(jìn)劑與穩(wěn)定劑