臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)__廖國(guó)玲

1、會(huì)計(jì)學(xué)1臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)_廖國(guó)玲廖國(guó)玲第1頁(yè)/共98頁(yè)2本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容 第一節(jié)第一節(jié) 光譜分析技術(shù)光譜分析技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù)電化學(xué)分析技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 干化學(xué)分析技術(shù)干化學(xué)分析技術(shù)第四節(jié)第四節(jié) 電泳分析技術(shù)電泳分析技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 基因擴(kuò)增技術(shù)基因擴(kuò)增技術(shù)第2頁(yè)/共98頁(yè)3n教學(xué)目標(biāo)和要求教學(xué)目標(biāo)和要求掌握掌握 1.1.光譜分析技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。光譜分析技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。 2.2.電位分析法的概念，離子選擇性電極的結(jié)構(gòu)及電位分析法的概念，離子選擇性電極的結(jié)構(gòu)及類型。類型。 3.3.基因擴(kuò)增技術(shù)的原理、反應(yīng)體系的

2、組成及注意基因擴(kuò)增技術(shù)的原理、反應(yīng)體系的組成及注意事項(xiàng)。事項(xiàng)。熟悉：熟悉： 影響光譜分析技術(shù)、電泳技術(shù)的因素影響光譜分析技術(shù)、電泳技術(shù)的因素 各種分析技術(shù)在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用。各種分析技術(shù)在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用。第3頁(yè)/共98頁(yè)4本節(jié)主要內(nèi)容本節(jié)主要內(nèi)容一、一、光譜分析技術(shù)的基本光譜分析技術(shù)的基本原理原理二、光譜分析技術(shù)在臨床二、光譜分析技術(shù)在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用生物化學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用補(bǔ)充：補(bǔ)充：分光光度計(jì)的基本分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)、操作方法結(jié)構(gòu)、操作方法第4頁(yè)/共98頁(yè)5 利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來(lái)確定物質(zhì)性質(zhì)、

3、結(jié)構(gòu)或含量。征，以此來(lái)確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。n光譜分析技術(shù)分類：光譜分析技術(shù)分類：發(fā)射光譜分析技術(shù)：發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法 吸收光譜分析技術(shù)：吸收光譜分析技術(shù)：紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光 度法和紅外光譜法度法和紅外光譜法 散射光譜分析技術(shù)：散射光譜分析技術(shù)：比濁法比濁法 第5頁(yè)/共98頁(yè)6（一）分光光度技術(shù)的基本原理（一）分光光度技術(shù)的基本原理1. 1. 吸光度與透光度吸光度與透光度 A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I 當(dāng)當(dāng) 時(shí)，一部分光被散射；時(shí)，

4、一部分光被散射； 一部份光被吸收；一部份光被吸收； 另有一部分光透過(guò)溶液。另有一部分光透過(guò)溶液。 設(shè)入射光強(qiáng)度為設(shè)入射光強(qiáng)度為I0I0，透射光強(qiáng)度為，透射光強(qiáng)度為I I，I I和和I I0 0之比稱為透光之比稱為透光度度，表示透過(guò)光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值即：表示透過(guò)光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值即：T = I/I0 T T100100為為T%T%稱為百分透光度。透光度的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度稱為百分透光度。透光度的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度即：即：光線通過(guò)溶液光線通過(guò)溶液第6頁(yè)/共98頁(yè)7完全吸收完全吸收完全透過(guò)完全透過(guò)吸收黃色光吸收黃色光光譜示意光譜示意表觀現(xiàn)象示意表觀現(xiàn)象示意復(fù)合光復(fù)合光第7頁(yè)/共98頁(yè)8J朗伯

5、朗伯- -比爾定律：比爾定律： I I0 0：入射光強(qiáng)度入射光強(qiáng)度 C:C:溶液濃度溶液濃度 b:b:液層厚度液層厚度 I:I:透射光強(qiáng)度透射光強(qiáng)度 T:T:透光度透光度 A:A:吸光度吸光度 k:k:吸光系數(shù)吸光系數(shù)kbcIIT100kbcTIIIITA1lglglglg00bI0I2. Lambert-Beer定律定律第8頁(yè)/共98頁(yè)9 Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。其表達(dá)式為：其表達(dá)式為： A = KLC 式中式中A

6、為吸光度；為吸光度；K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L為為溶液層厚度，稱為光徑；溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度為溶液濃度 （Lambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。）非散射的液體。）表示：吸光度與和溶液中吸光物質(zhì)的濃度表示：吸光度與和溶液中吸光物質(zhì)的濃度C和溶液的厚度和溶液的厚度L的乘積成正比。的乘積成正比。第9頁(yè)/共98頁(yè)10 當(dāng)溶液濃度當(dāng)溶液濃度C的單位為的單位為g/L，溶液液層厚度，溶液液層厚度L的的單位為單位為cm時(shí)，時(shí)，K叫叫“吸光系數(shù)吸光系數(shù)”，用，用表示。其單表示。其單位為位為L(zhǎng)/

7、gcm 當(dāng)溶液濃度當(dāng)溶液濃度C的單位為的單位為mol/L，溶液液層厚度，溶液液層厚度L的單位為的單位為cm時(shí)，時(shí)，K叫叫“摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)”，用，用（psilon）表示。）表示。 其單位為其單位為L(zhǎng)/molcm，此時(shí)：，此時(shí)：A= LC的意義是：當(dāng)液層厚度為的意義是：當(dāng)液層厚度為1cm，物質(zhì)濃度為，物質(zhì)濃度為1mol/L時(shí)在特定波長(zhǎng)下的吸光度值。時(shí)在特定波長(zhǎng)下的吸光度值。 第10頁(yè)/共98頁(yè)11 是物質(zhì)的特征性常數(shù)。是物質(zhì)的特征性常數(shù)。 摩爾吸光系數(shù)越大，表示物質(zhì)對(duì)波長(zhǎng)為摩爾吸光系數(shù)越大，表示物質(zhì)對(duì)波長(zhǎng)為的光的的光的吸收能力越強(qiáng)，同時(shí)在分光光度法中測(cè)定的靈敏度吸收能力越強(qiáng)，同時(shí)在分光光

8、度法中測(cè)定的靈敏度也越大。也越大。 吸光系數(shù)大小取決于吸光系數(shù)大小取決于吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光的波長(zhǎng)吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光的波長(zhǎng)及溫度。及溫度。（1）物質(zhì)不同，吸光系數(shù)不同。屬于物質(zhì)的特征常）物質(zhì)不同，吸光系數(shù)不同。屬于物質(zhì)的特征常數(shù)。數(shù)。（2）溶劑不同，同一物質(zhì)吸光系數(shù)也不同。）溶劑不同，同一物質(zhì)吸光系數(shù)也不同。（3）光波長(zhǎng)不同，吸光系數(shù)不同。）光波長(zhǎng)不同，吸光系數(shù)不同。第11頁(yè)/共98頁(yè)12吸收定律的適用條件：吸收定律的適用條件：必須是使用必須是使用單色光單色光為入射光；為入射光；溶液為溶液為稀稀溶液；溶液； 吸收定律能夠用于彼此不相互作用的吸收定律能夠用于彼此不相互作用的多組分溶液。多組

9、分溶液。吸光度的加和性：吸光度的加和性：A總總= A1+ A2+ A3+ An 溶液中有多種吸光物質(zhì)時(shí)，總吸光度溶液中有多種吸光物質(zhì)時(shí)，總吸光度等于各吸光物質(zhì)吸光度總和。等于各吸光物質(zhì)吸光度總和。第12頁(yè)/共98頁(yè)13（二）原子吸收分光光度法（二）原子吸收分光光度法（Atomic Absorption Spectrometry, AAS） 基本原理：基本原理：根據(jù)待測(cè)元素的氣態(tài)原子，能吸收同根據(jù)待測(cè)元素的氣態(tài)原子，能吸收同種原子所發(fā)射的特征光輻射，吸收特征符合種原子所發(fā)射的特征光輻射，吸收特征符合Lambert-beer定律，即一定條件下，原子的吸光度同待測(cè)元素定律，即一定條件下，原子的吸光度

10、同待測(cè)元素基態(tài)原子的濃度成正比，計(jì)算出試樣中待測(cè)元素的含基態(tài)原子的濃度成正比，計(jì)算出試樣中待測(cè)元素的含量，這種方法稱為原子吸收光譜法。量，這種方法稱為原子吸收光譜法。第13頁(yè)/共98頁(yè)14四大部分組成：光源、單色器、原子化器、檢測(cè)器。四大部分組成：光源、單色器、原子化器、檢測(cè)器。第14頁(yè)/共98頁(yè)15q1. 選擇性高，干擾少。共存元素對(duì)待測(cè)元素干擾少選擇性高，干擾少。共存元素對(duì)待測(cè)元素干擾少，一般不需分離共存元素。，一般不需分離共存元素。v原子吸收分光光度法特點(diǎn)：原子吸收分光光度法特點(diǎn)：q2. 靈敏度高?；鹧嬖踊ǎ红`敏度高?；鹧嬖踊ǎ?0-9g/mL；石墨爐：；石墨爐： 10-13g/

11、mL 。q3. 測(cè)定的范圍廣。測(cè)定測(cè)定的范圍廣。測(cè)定70多種元素。多種元素。q4. 分析速度快。分析速度快。q5. 精密度、準(zhǔn)確度高。精密度、準(zhǔn)確度高?；鹧娣ɑ鹧娣ㄕ`差誤差1% ，石墨爐法，石墨爐法3%-5。第15頁(yè)/共98頁(yè)16v原子吸收分光光度法與紫外可見吸收光度法異同點(diǎn)原子吸收分光光度法與紫外可見吸收光度法異同點(diǎn)p相同點(diǎn)：相同點(diǎn)：1）都是依據(jù)樣品對(duì)入射光的吸收進(jìn)行測(cè)量的。）都是依據(jù)樣品對(duì)入射光的吸收進(jìn)行測(cè)量的。2）兩種方法都遵循朗伯）兩種方法都遵循朗伯-比耳定律。比耳定律。3）就設(shè)備而言，均由四大部分組成，即光源、單色器）就設(shè)備而言，均由四大部分組成，即光源、單色器、吸收池（或原子化器）

12、、檢測(cè)器。、吸收池（或原子化器）、檢測(cè)器。第16頁(yè)/共98頁(yè)17 1. 在可見、紫外分光光度法中，吸光物質(zhì)是溶液在可見、紫外分光光度法中，吸光物質(zhì)是溶液中中被測(cè)物質(zhì)的分子或離子被測(cè)物質(zhì)的分子或離子對(duì)光的選擇吸收，原子吸對(duì)光的選擇吸收，原子吸收光譜法吸光物質(zhì)是待測(cè)元素的收光譜法吸光物質(zhì)是待測(cè)元素的基態(tài)原子基態(tài)原子對(duì)光的選對(duì)光的選擇吸收，這種擇吸收，這種光是由待測(cè)元素制成的空心陰極燈光是由待測(cè)元素制成的空心陰極燈( (稱元素?zé)舴Q元素?zé)? )作光源作光源。2. 單色器與吸收池的位置不同。單色器與吸收池的位置不同。紫外可見：光源紫外可見：光源單色器單色器比色皿。比色皿。原子吸收：光源原子吸收：光源原子

13、化器原子化器單色器。單色器。p異同點(diǎn)：異同點(diǎn)：第17頁(yè)/共98頁(yè)18二、光譜分析技術(shù)在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中二、光譜分析技術(shù)在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用的應(yīng)用（一）分光光度技術(shù)的定性方法（一）分光光度技術(shù)的定性方法u定性依據(jù)：定性依據(jù)：最大吸收波長(zhǎng)最大吸收波長(zhǎng)maxmax和摩爾吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù) 2.2.摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù)方法方法1.1.最大吸收波長(zhǎng)最大吸收波長(zhǎng)maxmax方法方法確定是什么物質(zhì)確定是什么物質(zhì)第18頁(yè)/共98頁(yè)19（二）分光光度技術(shù)的定量方法（二）分光光度技術(shù)的定量方法1.1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 根據(jù)根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范定律，液體的濃度在一

14、定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)本處理方法作相同處理，在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度本處理方法作相同處理，在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，按，按最小二乘法的原理，將對(duì)應(yīng)各點(diǎn)連成一條通過(guò)原點(diǎn)最小二乘法的原理，將對(duì)應(yīng)各點(diǎn)連成一條通過(guò)原點(diǎn)的直線，這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)溶液測(cè)定吸的直線，這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)溶液測(cè)定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相

15、應(yīng)的濃度。u方法：方法：確定有多少物質(zhì)（濃度確定有多少物質(zhì)（濃度）第19頁(yè)/共98頁(yè)20第20頁(yè)/共98頁(yè)21u制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：（1 1）測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新）測(cè)定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新繪制。繪制。（2 2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。（3 3）當(dāng)待測(cè)液吸光度超過(guò)線性范圍時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測(cè)定。）當(dāng)待測(cè)液吸光度超過(guò)線性范圍時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測(cè)定。（4 4）標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。）標(biāo)本測(cè)定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲

16、線制作時(shí)的條件完全一致。（5 5）標(biāo)準(zhǔn)曲線上應(yīng)標(biāo)明制作日期、制作人和名稱。）標(biāo)準(zhǔn)曲線上應(yīng)標(biāo)明制作日期、制作人和名稱。第21頁(yè)/共98頁(yè)222 2比較法比較法 C Cu u=(A=(Au uC Cs s)/A)/As s 己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為： 其中其中C Cu u和和A Au u為標(biāo)本管濃度和吸光度，為標(biāo)本管濃度和吸光度，C C

17、s s和和A As s分別為標(biāo)準(zhǔn)分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。和標(biāo)本管濃度相近。 第22頁(yè)/共98頁(yè)233 3其它分析方法其它分析方法 包括差示法、多組份混合物分析和利用包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法。摩爾吸光系數(shù)分析等方法。第23頁(yè)/共98頁(yè)241光學(xué)因素：光學(xué)因素： 要求入射光是單色光。入射光的譜帶越寬，其誤差越要求入射光是單色光。入射光的譜帶越寬，其誤差越大。大。 2化學(xué)因素：化學(xué)因素： 濃度、濃度、pH、溶劑和溫度等因素可影響化學(xué)平衡。、溶劑和溫度等因素可影響

18、化學(xué)平衡。 三、光譜分析技術(shù)的影響因素三、光譜分析技術(shù)的影響因素第24頁(yè)/共98頁(yè)25補(bǔ)充補(bǔ)充 分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)最常用的是最常用的是可見分光光度計(jì)可見分光光度計(jì)和和紫外紫外- -可見光分光光度計(jì)可見光分光光度計(jì) 光源光源單色器單色器比色杯比色杯檢測(cè)器檢測(cè)器顯示器顯示器五大部分五大部分n結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：0.575 第25頁(yè)/共98頁(yè)26第26頁(yè)/共98頁(yè)27（一）光源（一）光源u光源光源 是一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光是一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，并有足夠的強(qiáng)度和良源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，

19、并有足夠的強(qiáng)度和良好的穩(wěn)定性，在整個(gè)光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長(zhǎng)有明顯的好的穩(wěn)定性，在整個(gè)光譜區(qū)域內(nèi)光的強(qiáng)度不應(yīng)隨波長(zhǎng)有明顯的變化。變化。 u光源種類：光源種類： 可見光分光光度計(jì)常用光源是可見光分光光度計(jì)常用光源是鎢燈或鹵鎢燈，鎢燈或鹵鎢燈，可發(fā)射可發(fā)射3202500nm 。 紫外光光度計(jì)常用紫外光光度計(jì)常用氫燈和氘燈氫燈和氘燈作為光源。作為光源。 150400nm。 第27頁(yè)/共98頁(yè)28（二）單色器（二）單色器u定義：定義： 將來(lái)自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱為分將來(lái)自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱為分光系統(tǒng)或單色器。由入射狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件、光系統(tǒng)或單色器。由入射狹縫、準(zhǔn)直鏡

20、、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。u色散元件色散元件種類：種類： 濾光片濾光片棱鏡棱鏡光柵光柵 其核心部分是色散元件，起分光的作用。其核心部分是色散元件，起分光的作用。第28頁(yè)/共98頁(yè)29入射狹縫入射狹縫 準(zhǔn)直透準(zhǔn)直透鏡鏡棱棱鏡鏡聚焦透聚焦透鏡鏡出射狹縫出射狹縫白光白光紅紅紫紫1 12 2800 600 500400第29頁(yè)/共98頁(yè)30熔融石英熔融石英晶體石英晶體石英玻璃玻璃NaCl170nm3.6 m *200600nm 2 m3.5 m*360nm2.5 m*200nm15 mKClKBrCsI200nm18 m*230nm25 m 230nm

21、50 m（三）比色杯（三）比色杯又稱為吸收池或比色皿又稱為吸收池或比色皿。u材料：材料：常用無(wú)色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成常用無(wú)色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成 表表1：一些材料的有效透明區(qū)：一些材料的有效透明區(qū)第30頁(yè)/共98頁(yè)31第31頁(yè)/共98頁(yè)32（五）顯示器（五）顯示器（四）檢測(cè)器（四）檢測(cè)器 檢測(cè)器是將透過(guò)溶液的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，檢測(cè)器是將透過(guò)溶液的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并將電信號(hào)放大的裝置。常用的檢測(cè)器為光電管和并將電信號(hào)放大的裝置。常用的檢測(cè)器為光電管和光電倍增管。光電倍增管。 是將光電管或光電倍增管放大的電流通過(guò)儀表是將光電管或光電倍增管放大的電流通過(guò)

22、儀表顯示出來(lái)的裝置。顯示出來(lái)的裝置。 第32頁(yè)/共98頁(yè)33分光光度計(jì)的操作方法分光光度計(jì)的操作方法1.1.開開721-A721-A分光光度計(jì)的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電分光光度計(jì)的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電2020分分鐘使儀器預(yù)熱。鐘使儀器預(yù)熱。2.2.將波長(zhǎng)旋至測(cè)定的波長(zhǎng)。將波長(zhǎng)旋至測(cè)定的波長(zhǎng)。3.3.將空白液、校準(zhǔn)液或待測(cè)液放入比色池，將空白液置于光路中將空白液、校準(zhǔn)液或待測(cè)液放入比色池，將空白液置于光路中。4.4.將開關(guān)置于將開關(guān)置于T T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)T T為為0.0,0.0,關(guān)上比色池蓋子，關(guān)上比色池

23、蓋子，調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)T T為為100.0100.0。5.5.將開關(guān)置于將開關(guān)置于A A，用消光調(diào)零，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)A A為為0.00.06.6.重復(fù)步驟重復(fù)步驟4 4和和5 57.7.將校準(zhǔn)液或待測(cè)液推入光將校準(zhǔn)液或待測(cè)液推入光路，測(cè)量溶液的吸光度（路，測(cè)量溶液的吸光度（A A）第33頁(yè)/共98頁(yè)34（二）吸光度的校正（二）吸光度的校正 鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計(jì)的吸鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計(jì)的吸光度。在光度。在25，將，將4mg鉻酸鉀溶于鉻酸鉀溶于100ml的的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波長(zhǎng)中，放入比色池中，在不同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校

24、正表進(jìn)下測(cè)定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進(jìn)行比較，可檢測(cè)儀器吸光度的準(zhǔn)確度行比較，可檢測(cè)儀器吸光度的準(zhǔn)確度。 （三）波長(zhǎng)的校正（三）波長(zhǎng)的校正 鐠釹濾光片：鐠釹濾光片：528nm處有最大吸收峰。處有最大吸收峰。 干涉濾光片：干涉濾光片：589nm處有最大吸收峰。處有最大吸收峰。 第34頁(yè)/共98頁(yè)35本節(jié)主要內(nèi)容本節(jié)主要內(nèi)容一、一、電化學(xué)分析技術(shù)的基電化學(xué)分析技術(shù)的基本原理本原理二、二、電極分析法在臨床檢電極分析法在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用驗(yàn)中的應(yīng)用三、電極分析法的影響因三、電極分析法的影響因素素第35頁(yè)/共98頁(yè)36一、電化學(xué)分析技術(shù)的基本原理第36頁(yè)/共98頁(yè)37 第37頁(yè)/共98頁(yè)38第3

25、8頁(yè)/共98頁(yè)39電位分析法的理論依據(jù)電位分析法的理論依據(jù) 能斯特方程能斯特方程 表示電極電位與溶液中對(duì)應(yīng)離子活度之表示電極電位與溶液中對(duì)應(yīng)離子活度之間存在的定量關(guān)系。間存在的定量關(guān)系。 單個(gè)電極的電位是無(wú)法測(cè)量的，因此，由單個(gè)電極的電位是無(wú)法測(cè)量的，因此，由指指示電極示電極與與參比電極參比電極組成電池用電位計(jì)測(cè)量該電池組成電池用電位計(jì)測(cè)量該電池的電動(dòng)勢(shì)，即可得到該電極的相對(duì)電位。相對(duì)于的電動(dòng)勢(shì)，即可得到該電極的相對(duì)電位。相對(duì)于同一參比電極的的不同電極的相對(duì)電位是可以相同一參比電極的的不同電極的相對(duì)電位是可以相互比較的，并可用于計(jì)算電池的電動(dòng)勢(shì)?；ケ容^的，并可用于計(jì)算電池的電動(dòng)勢(shì)。第39頁(yè)/共

26、98頁(yè)40原電池：由指示電極和參比原電池：由指示電極和參比電極構(gòu)成電極構(gòu)成1. 指示電極指示電極 電極電位隨被測(cè)物質(zhì)活度變電極電位隨被測(cè)物質(zhì)活度變化的電極（化的電極（離子選擇性電極離子選擇性電極）。）。2. 參比電極參比電極 與被測(cè)物質(zhì)無(wú)關(guān)，提供測(cè)量電位與被測(cè)物質(zhì)無(wú)關(guān)，提供測(cè)量電位參考的電極。具有恒定電位值的電極。（參考的電極。具有恒定電位值的電極。（甘汞電極和銀甘汞電極和銀-氯氯化銀電極化銀電極）第40頁(yè)/共98頁(yè)411. 離子選擇電極基本結(jié)構(gòu)離子選擇電極基本結(jié)構(gòu)第41頁(yè)/共98頁(yè)42電極管電極管敏感膜敏感膜內(nèi)（參比）內(nèi)（參比）電極電極內(nèi)參比內(nèi)參比溶液溶液第42頁(yè)/共98頁(yè)43能斯特方程能斯

27、特方程第43頁(yè)/共98頁(yè)44第44頁(yè)/共98頁(yè)45xfxCnFRTkISEEln303. 2第45頁(yè)/共98頁(yè)46二、電化學(xué)分析法在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用第46頁(yè)/共98頁(yè)47第47頁(yè)/共98頁(yè)48第48頁(yè)/共98頁(yè)49（二）離子選擇電極的分析方法（二）離子選擇電極的分析方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法2. 標(biāo)準(zhǔn)比較法標(biāo)準(zhǔn)比較法3. 標(biāo)準(zhǔn)加入法標(biāo)準(zhǔn)加入法第49頁(yè)/共98頁(yè)50（三）樣品測(cè)定方式（三）樣品測(cè)定方式第50頁(yè)/共98頁(yè)51（四）電極分析法在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用（四）電極分析法在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用 第51頁(yè)/共98頁(yè)52第52頁(yè)/共98頁(yè)53第53頁(yè)/共98頁(yè)54第54頁(yè)/共98頁(yè)55第三節(jié)第三節(jié)

28、干化學(xué)分析技術(shù)干化學(xué)分析技術(shù)（自學(xué)）（自學(xué)）第55頁(yè)/共98頁(yè)56本節(jié)主要內(nèi)容本節(jié)主要內(nèi)容一、一、電泳的基本原理電泳的基本原理二、二、電泳技術(shù)的分類電泳技術(shù)的分類三、影響電泳的因素三、影響電泳的因素四、常用電泳技術(shù)四、常用電泳技術(shù)五、電泳區(qū)帶的測(cè)定五、電泳區(qū)帶的測(cè)定六、特殊電泳技術(shù)六、特殊電泳技術(shù)第56頁(yè)/共98頁(yè)57電泳：電泳： 指帶粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷相反的電指帶粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。極移動(dòng)的現(xiàn)象。 電泳技術(shù)（電泳技術(shù)（electrophoresis technique） 利用各種帶電粒子電泳速度不同，對(duì)多組分物質(zhì)利用各種帶電粒子電泳速度不同，對(duì)多組分物

29、質(zhì)進(jìn)行分離，然后進(jìn)行定性、定量分析的技術(shù)。進(jìn)行分離，然后進(jìn)行定性、定量分析的技術(shù)。 第57頁(yè)/共98頁(yè)58第58頁(yè)/共98頁(yè)59（一）溶液中粒子的帶電狀態(tài)（一）溶液中粒子的帶電狀態(tài)許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電?；蜇?fù)電。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)帶電性質(zhì)的差異的差異以及以及分子本身

30、的大小，形狀分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的不同的遷移速度遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。一、電泳分析的基本原理一、電泳分析的基本原理第59頁(yè)/共98頁(yè)60 電泳遷移率：指帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度作用下電泳遷移率：指帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度作用下的移動(dòng)速度，即每厘米電壓下降的移動(dòng)速度，即每厘米電壓下降1V的電場(chǎng)強(qiáng)度下的電場(chǎng)強(qiáng)度下帶電粒子每秒內(nèi)移動(dòng)的距離。帶電粒子每秒內(nèi)移動(dòng)的距離。 （二）電泳的遷移率（二）電泳的遷移率第60頁(yè)/共98頁(yè)61電泳遷移率大小與顆粒帶電量、大小和電泳遷移率大小與顆粒帶電量、大小和形狀及介質(zhì)粘度有

31、關(guān)形狀及介質(zhì)粘度有關(guān)。第61頁(yè)/共98頁(yè)62三、影響電泳的因素三、影響電泳的因素（一）分子的形狀和性質(zhì)（一）分子的形狀和性質(zhì)（二）電場(chǎng)強(qiáng)度（二）電場(chǎng)強(qiáng)度（三）電泳緩沖液（三）電泳緩沖液 緩沖溶質(zhì)緩沖溶質(zhì) 溶液的溶液的pH值值 離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度（五）支持介質(zhì)（五）支持介質(zhì) 1. 電滲作用電滲作用 2. 吸附作用吸附作用決定了帶電顆粒解離的程度，也決定決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少。了物質(zhì)所帶凈電荷的多少。是指單位長(zhǎng)度支持物體上的電位降是指單位長(zhǎng)度支持物體上的電位降。溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動(dòng)溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動(dòng)速度越慢，反之越快；通常緩沖液離速度越慢，反

32、之越快；通常緩沖液離子強(qiáng)度選擇在子強(qiáng)度選擇在0.050.1 molL之間。之間。即介質(zhì)對(duì)樣品的滯留作用即介質(zhì)對(duì)樣品的滯留作用。（六）蒸發(fā)（六）蒸發(fā)第62頁(yè)/共98頁(yè)63第63頁(yè)/共98頁(yè)64第64頁(yè)/共98頁(yè)65v電滲電滲就是指在電場(chǎng)中，液體對(duì)固體支持物的相對(duì)就是指在電場(chǎng)中，液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。移動(dòng)。 第65頁(yè)/共98頁(yè)66 二、常用電泳分析技術(shù)二、常用電泳分析技術(shù) 1.1.移動(dòng)界面電泳移動(dòng)界面電泳 2.2.區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳 3.3.穩(wěn)態(tài)電泳穩(wěn)態(tài)電泳第66頁(yè)/共98頁(yè)67（一）醋酸纖維素薄膜電泳（一）醋酸纖維素薄膜電泳（cellulose acetate electrophoresis

33、） 以醋酸纖維素薄膜為支持介質(zhì)。以醋酸纖維素薄膜為支持介質(zhì)。v分辯力好，對(duì)蛋白質(zhì)吸附極少，拖尾現(xiàn)象輕微；分辯力好，對(duì)蛋白質(zhì)吸附極少，拖尾現(xiàn)象輕微；不吸附染料，對(duì)區(qū)帶周圍的染料能完全洗去，不干不吸附染料，對(duì)區(qū)帶周圍的染料能完全洗去，不干擾測(cè)定；樣品需要量少、介質(zhì)又可以透明后定量掃擾測(cè)定；樣品需要量少、介質(zhì)又可以透明后定量掃描等優(yōu)點(diǎn)。描等優(yōu)點(diǎn)。第67頁(yè)/共98頁(yè)68第68頁(yè)/共98頁(yè)69瓊脂瓊脂瓊脂糖瓊脂糖瓊脂膠瓊脂膠脫去脫去SO42- 丙酮酸酯基丙酮酸酯基（二）（二） 瓊脂或瓊脂糖凝膠電泳瓊脂或瓊脂糖凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1. 含液體量大，疏松。擴(kuò)散小。對(duì)蛋白吸附極弱。含液體量大，疏松。擴(kuò)散小。對(duì)

34、蛋白吸附極弱。 2. 均勻，區(qū)帶整齊，分辨率高。均勻，區(qū)帶整齊，分辨率高。 3. 電泳速度快。電泳速度快。 4. 透明度好。透明度好。 5. 區(qū)帶易著色，樣品易洗脫。區(qū)帶易著色，樣品易洗脫。 6. 干膜可長(zhǎng)期保存。干膜可長(zhǎng)期保存。第69頁(yè)/共98頁(yè)70第70頁(yè)/共98頁(yè)71第71頁(yè)/共98頁(yè)72丙烯酰胺丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝膠具聚丙烯酰胺凝膠具有一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。有一定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。如果形成的孔徑大小如果形成的孔徑大小接近于所分離樣品分接近于所分離樣品分子的平均半徑子的平均半徑，樣品，樣品分子在通過(guò)凝膠孔洞分子在通過(guò)凝膠孔洞時(shí)，所受到的時(shí)，所受到的阻力就阻力就會(huì)和樣品分

35、子的大小會(huì)和樣品分子的大小及形狀有關(guān)。及形狀有關(guān)。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳第72頁(yè)/共98頁(yè)73 （1） 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 蛋白質(zhì)進(jìn)入分離膠，由于凝膠蛋白質(zhì)進(jìn)入分離膠，由于凝膠有一定的孔徑，不同的蛋白質(zhì)分子大小不同，受到有一定的孔徑，不同的蛋白質(zhì)分子大小不同，受到的阻力不同，小分子受阻力小，走在前面，大分子的阻力不同，小分子受阻力小，走在前面，大分子受阻力大，走在后面。受阻力大，走在后面。（2）電荷效應(yīng)）電荷效應(yīng) 同一般電荷。同一般電荷。 v電荷效應(yīng)及電荷效應(yīng)及分子篩分子篩的功能，大大提高了分離能力的功能，大大提高了分離能力，是目前分辨率最高的電泳支持介質(zhì)。，是目前分辨率最高的

36、電泳支持介質(zhì)。第73頁(yè)/共98頁(yè)74 （四）電泳區(qū)帶的測(cè)定（四）電泳區(qū)帶的測(cè)定 電泳區(qū)帶的定性、定量測(cè)定可用直接法或染色法電泳區(qū)帶的定性、定量測(cè)定可用直接法或染色法。1. 區(qū)帶定性分析區(qū)帶定性分析 區(qū)帶染色區(qū)帶染色 蛋白區(qū)帶染色用氨基黑蛋白區(qū)帶染色用氨基黑10B、溴酚藍(lán)、考馬、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)、麗春紅等。斯亮藍(lán)、麗春紅等。 脂蛋白染色常用蘇丹紅、蘇丹黑等。脂蛋白染色常用蘇丹紅、蘇丹黑等。 核酸區(qū)帶染色常用溴乙啶。核酸區(qū)帶染色常用溴乙啶。 多發(fā)性骨髓瘤多發(fā)性骨髓瘤M帶帶 肝硬化肝硬化 橋。橋。第74頁(yè)/共98頁(yè)752. 區(qū)帶定量分析區(qū)帶定量分析（1）光密度掃描法）光密度掃描法（2）洗脫比色法）

37、洗脫比色法第75頁(yè)/共98頁(yè)76三、自動(dòng)電泳分析技術(shù)三、自動(dòng)電泳分析技術(shù)四、電泳分析技術(shù)在臨床中的應(yīng)用四、電泳分析技術(shù)在臨床中的應(yīng)用一、蛋白電泳一、蛋白電泳1. 1. 血清蛋白電泳血清蛋白電泳 新鮮血清經(jīng)醋酸纖維薄膜或瓊脂糖電泳、染色新鮮血清經(jīng)醋酸纖維薄膜或瓊脂糖電泳、染色后，通?？梢姾螅ǔ？梢?條帶，即清蛋白、條帶，即清蛋白、 1、 2、 和和 球球蛋白。蛋白。 血清蛋白電泳圖譜血清蛋白電泳圖譜第76頁(yè)/共98頁(yè)772. 2. 免疫固定電泳免疫固定電泳 常用于臨床常規(guī)常用于臨床常規(guī)M蛋白的分型與鑒定。一般用于蛋白的分型與鑒定。一般用于單克隆單克隆Ig增殖病、單克隆增殖病、單克隆Ig病、本周

38、氏蛋白和游離輕病、本周氏蛋白和游離輕鏈病、多組分單克隆鏈病、多組分單克隆Ig病、重鏈病、病、重鏈病、CSF寡克隆蛋白寡克隆蛋白鑒別、多克隆鑒別、多克隆Ig病的診病的診斷和鑒別診斷。斷和鑒別診斷。 免疫固定電泳圖譜免疫固定電泳圖譜第77頁(yè)/共98頁(yè)783. 3. 脂蛋白電泳脂蛋白電泳 檢測(cè)各種脂蛋白（包括膽固醇和甘油三酯）主要檢測(cè)各種脂蛋白（包括膽固醇和甘油三酯）主要用于高脂用于高脂 血癥的分型、冠心病危險(xiǎn)性估計(jì)，以及動(dòng)血癥的分型、冠心病危險(xiǎn)性估計(jì)，以及動(dòng)脈粥樣硬化性及相關(guān)脈粥樣硬化性及相關(guān) 疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療效果觀察的研究等。療效果觀察的研究等。 脂蛋白電泳

39、圖譜脂蛋白電泳圖譜第78頁(yè)/共98頁(yè)794. 4. 尿蛋白電泳尿蛋白電泳 主要目的是：主要目的是： 確定尿蛋白的來(lái)源；確定尿蛋白的來(lái)源； 了解腎臟病變的嚴(yán)重程度，從而有助于診斷和了解腎臟病變的嚴(yán)重程度，從而有助于診斷和預(yù)后的判斷。預(yù)后的判斷。 尿蛋白電泳圖譜尿蛋白電泳圖譜第79頁(yè)/共98頁(yè)80第80頁(yè)/共98頁(yè)81 5. 5. 血紅蛋白及糖化血紅蛋白電泳血紅蛋白及糖化血紅蛋白電泳 鑒別患者血液中鑒別患者血液中Hb的類型及含量，對(duì)于貧血類型的類型及含量，對(duì)于貧血類型的臨床診斷及治療具有重大意義。的臨床診斷及治療具有重大意義。06-19 血紅蛋白電泳圖譜血紅蛋白電泳圖譜第81頁(yè)/共98頁(yè)82 （二）（二） 同工酶電泳同工酶電泳 同工酶電泳用于臨床上常見的同工酶或同工酶亞同工酶電泳用于臨床上常見的同工酶或同工酶亞型分析。型分析。 1 1乳酸脫氫酶乳酸脫氫酶( (LD/LDH) )同工酶同工酶 2 2肌酸激酶（肌酸激酶（CK）同工酶）同工酶 3 3CK同工酶亞型同工酶亞型 同工酶電泳圖譜同工酶電泳圖譜第82頁(yè)/共98頁(yè)83第83頁(yè)/共98頁(yè)84第84頁(yè)/共98頁(yè)85第85頁(yè)/共98頁(yè)86第86頁(yè)/共98頁(yè)87第87頁(yè)/共98頁(yè)88第88頁(yè)/共98頁(yè)89第89頁(yè)/共98頁(yè)90第90頁(yè)/共98頁(yè)91 利用各種化學(xué)