葡萄糖異構酶PPT

1、12 小組成員：周杰小組成員：周杰 張芬張芬 周伊玲周伊玲 陳艷梅陳艷梅第七節(jié) 葡萄糖異構酶3影響 酶活的因素酶活的測定酶的固定化提取分離、純化國內(nèi)外的研究情況產(chǎn)生菌株及其分布該酶的特性概念和用途參考文獻參考文獻葡萄糖異構酶本節(jié)課的框架本節(jié)課的框架4一、葡萄糖異構酶的概念一、葡萄糖異構酶的概念：也稱也稱木糖異構酶木糖異構酶，或或簡稱異構酶它可以催化簡稱異構酶它可以催化 DD木糖，木糖，DD葡萄糖，葡萄糖，即將即將DD核糖等核糖等醛糖轉(zhuǎn)化為相應的酮糖醛糖轉(zhuǎn)化為相應的酮糖。由于葡。由于葡萄糖異構化對果糖具有重要的經(jīng)濟意義，因此萄糖異構化對果糖具有重要的經(jīng)濟意義，因此工業(yè)上習慣將工業(yè)上習慣將DD木糖

2、異構酶稱為葡萄糖異構酶。木糖異構酶稱為葡萄糖異構酶。二、葡萄糖異構酶的用途：二、葡萄糖異構酶的用途：異構酶的主要用途就異構酶的主要用途就是將葡萄糖異構化成是將葡萄糖異構化成高果糖漿高果糖漿。5 葡萄糖異構酶的優(yōu)點：味道純正，葡萄糖異構酶的優(yōu)點：味道純正，具有較強的具有較強的保溫性保溫性，著色性和防腐性著色性和防腐性；營養(yǎng)價值較高，可不經(jīng)消化直接被腸營養(yǎng)價值較高，可不經(jīng)消化直接被腸胃吸收，果糖的代謝胃吸收，果糖的代謝不受胰島素調(diào)節(jié)不受胰島素調(diào)節(jié)，糖尿病人可以利用。系飲料，糕點等糖尿病人可以利用。系飲料，糕點等食品工業(yè)的理想用糖。在蜂蜜中含量食品工業(yè)的理想用糖。在蜂蜜中含量最為豐富，它的甜度約為蔗

3、糖的最為豐富，它的甜度約為蔗糖的1 12-2-1 18 8倍。目前在全世界范圍內(nèi)，各國倍。目前在全世界范圍內(nèi)，各國都大力發(fā)展果葡糖漿和結晶果糖的生都大力發(fā)展果葡糖漿和結晶果糖的生產(chǎn)。產(chǎn)。 6 淀粉淀粉的漿液經(jīng)過的漿液經(jīng)過-淀粉酶的催化作用，淀粉酶的催化作用，可以形成可以形成糊精糊精；糊精經(jīng)過糖化酶的催化作；糊精經(jīng)過糖化酶的催化作用形成用形成葡萄糖葡萄糖；葡萄糖在葡萄糖異構酶的；葡萄糖在葡萄糖異構酶的催化作用下，分子的結構發(fā)生變化，這叫做催化作用下，分子的結構發(fā)生變化，這叫做葡萄糖的葡萄糖的異構化異構化。葡萄糖經(jīng)過異構化，就。葡萄糖經(jīng)過異構化，就形成了果糖。如果把果葡糖漿中的果糖和葡形成了果糖。

4、如果把果葡糖漿中的果糖和葡萄糖分離開來，將分離出來的葡萄糖再次進萄糖分離開來，將分離出來的葡萄糖再次進行異構化，并且如此反復多次，最后的混合行異構化，并且如此反復多次，最后的混合物中果糖的含量可以達到物中果糖的含量可以達到70%70%90%90%，這樣的，這樣的混合物就叫做高果糖漿?；旌衔锞徒凶龈吖菨{。 果葡糖漿生產(chǎn)過程果葡糖漿生產(chǎn)過程回吧回吧7二、酶的特性、酶的特性葡萄糖異構酶的生物學性質(zhì)葡萄糖異構酶的生物學性質(zhì) 葡萄糖異構酶能催化葡萄糖異構酶能催化D2葡萄糖至葡萄糖至D2果糖的異構化反應果糖的異構化反應,它是工業(yè)上大規(guī)模從淀粉制備高果糖漿的關鍵酶它是工業(yè)上大規(guī)模從淀粉制備高果糖漿的關鍵酶

5、,且該酶且該酶可將木聚糖異構化為木酮糖可將木聚糖異構化為木酮糖,再經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇再經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇.A、熱穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性 B、底物專一性、底物專一性 C、 金屬離子的影響金屬離子的影響 D、最適、最適pH和溫度和溫度 親愛的親愛的想我了想我了嗎？嘿嘿嗎？嘿嘿8四、國內(nèi)外的研究情況四、國內(nèi)外的研究情況 目前國內(nèi)許多科研機構和企業(yè)正在進行葡萄糖異構酶研究目前國內(nèi)許多科研機構和企業(yè)正在進行葡萄糖異構酶研究和應用。在與基礎理論研究中有關的基因改造、酶學性質(zhì)，以和應用。在與基礎理論研究中有關的基因改造、酶學性質(zhì)，以及在遺傳育種過程中突變型篩選，都需要一個準確、快速、具及在遺傳育種過程中突變型

6、篩選，都需要一個準確、快速、具有較高重復性的測定葡萄糖異構酶活的方法。有較高重復性的測定葡萄糖異構酶活的方法。讓俺好好看看讓俺好好看看9 中國科學技術大學生命科學學院獨家承擔國家科委中國科學技術大學生命科學學院獨家承擔國家科委863”863”項目項目“葡萄糖異構酶的蛋白質(zhì)工程葡萄糖異構酶的蛋白質(zhì)工程”，經(jīng)十五年科技攻關，經(jīng)十五年科技攻關目前已完成葡萄糖異構酶的蛋白質(zhì)工程改造，獲得性質(zhì)改目前已完成葡萄糖異構酶的蛋白質(zhì)工程改造，獲得性質(zhì)改良的良的基因重組葡萄糖異構酶基因重組葡萄糖異構酶；并利用基因工程方法構建并利用基因工程方法構建表表達量達量極高的基因重組鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株。目前已擁有兩極高的基因

7、重組鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株。目前已擁有兩項國家專利，同時正在申報項國家專利，同時正在申報“表達突變體酶表達突變體酶GIG138PGIG138P的的7 7號號淀粉酶鏈霉菌基因工程菌株淀粉酶鏈霉菌基因工程菌株SM33XZSM33XZ及其構建方法及其構建方法”的美國的美國專利。已具備將基因重組葡萄糖異構酶產(chǎn)業(yè)化的成熟的科專利。已具備將基因重組葡萄糖異構酶產(chǎn)業(yè)化的成熟的科技條件。項目旨在建立完整的葡萄糖異構酶蛋白質(zhì)工程研技條件。項目旨在建立完整的葡萄糖異構酶蛋白質(zhì)工程研究系統(tǒng)，究系統(tǒng)，利用蛋白質(zhì)工程技術對葡萄糖異構酶的某些性質(zhì)利用蛋白質(zhì)工程技術對葡萄糖異構酶的某些性質(zhì)缺陷進行改造，缺陷進行改造，如提高酶熱

8、穩(wěn)定性等，使其更好地應用于如提高酶熱穩(wěn)定性等，使其更好地應用于工業(yè)生產(chǎn)。項目涉及菌種篩選，基因克隆，基因表達，基工業(yè)生產(chǎn)。項目涉及菌種篩選，基因克隆，基因表達，基因突變，酶動力學，分子設計，工程菌構建以及酶的固定因突變，酶動力學，分子設計，工程菌構建以及酶的固定化研究等諸多方面?；芯康戎T多方面。10我國對a淀粉酶、葡萄糖淀汾酶和葡萄糖異構酶的研究取得了可喜的成就。但由于一些因素的影響，我國果葡糖漿的工業(yè)尚未形成一定規(guī)模，其主要問題是：1、 果葡糖生產(chǎn)技術，尤其是酶制劑未完全過。2、 原料價格過高影響生產(chǎn)成本。3、 果葡糖漿價格高。 在果葡糖生產(chǎn)的系列酶中，葡萄糖異構酶是關鍵，這不僅是因為葡萄

9、糖異構酶的價格比淀粉貴幾十倍，更重要的在于異構酶的性質(zhì)和反應條件和淀粉酶不相適應，在調(diào)節(jié)PH和支隊Ca+等離子過程中增加了工藝流程，從而提高了成本，影響酶的活力和產(chǎn)品的質(zhì)量。為此，葡萄糖異構酶的蛋白質(zhì)過程勢在必行。 而我們將葡萄糖異構酶經(jīng)過改造后，在工藝上可望省略一次離子交換柱處理，酸咸調(diào)節(jié)等步驟，并可能在較高溫度下（80）進行轉(zhuǎn)化反應，從而大大加速反應速度，使重組葡萄糖異構酶生產(chǎn)的果糖漿產(chǎn)量高，質(zhì)量好，味道鮮美。我國的果葡糖工業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)狀回了回了11五、酶的篩選五、酶的篩選 酶的提取是指在一定條件下，用適當?shù)娜軇┟傅奶崛∈侵冈谝欢l件下，用適當?shù)娜軇┨幚砑毎扑楹蟮暮冈?，使酶充分地溶處理?/p>

10、胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的過程。解到提取液中的過程。酶的提取方法酶的提取方法有有鹽溶鹽溶液提取法液提取法、堿溶液提取法堿溶液提取法和和有機溶劑提取法有機溶劑提取法等。為了提高酶的提取率和防止酶提取后變等。為了提高酶的提取率和防止酶提取后變性失活，提取過程中性失活，提取過程中必須注意保持適宜的溫必須注意保持適宜的溫度和度和pHpH，并且添加適量的保護劑。提取液中，并且添加適量的保護劑。提取液中含有多種酶，要想從提取液中分離純化出某含有多種酶，要想從提取液中分離純化出某一種酶，必須根據(jù)這種酶的特性，選擇適合一種酶，必須根據(jù)這種酶的特性，選擇適合的分離純化方法。的分離純化方法。

11、葡萄糖異構酶主要是胞內(nèi)酶，可以直接用其菌體，進行反應。提取胞葡萄糖異構酶主要是胞內(nèi)酶，可以直接用其菌體，進行反應。提取胞 內(nèi)酶，首先要破碎細胞內(nèi)酶，首先要破碎細胞 破壁、膜然后將含有酶活性的部分用過濾破壁、膜然后將含有酶活性的部分用過濾 或離心法去除殘留細胞和細胞碎片，從而得到澄清溶液。再采用逐步或離心法去除殘留細胞和細胞碎片，從而得到澄清溶液。再采用逐步 逐級分離和濃縮等步驟將所得的無細胞提取液純化。常用破碎處理方法：逐級分離和濃縮等步驟將所得的無細胞提取液純化。常用破碎處理方法： 機械破碎法：指利用搗碎機、研磨器或勻漿器等將細胞破碎開來機械破碎法：指利用搗碎機、研磨器或勻漿器等將細胞破碎開

12、來。 物理破碎法：指利用溫度差、壓力差或超聲波等將細胞破碎開來。物理破碎法：指利用溫度差、壓力差或超聲波等將細胞破碎開來。 化學破碎法：指利用甲醛、丙酮等有機溶劑或表面活性劑作用于細胞膜，化學破碎法：指利用甲醛、丙酮等有機溶劑或表面活性劑作用于細胞膜， 使細胞膜的結構遭到破壞或透性發(fā)生改變。使細胞膜的結構遭到破壞或透性發(fā)生改變。 酶學破碎法：指選用合適的酶，使細胞壁遭到破壞，進而在低滲溶液中將酶學破碎法：指選用合適的酶，使細胞壁遭到破壞，進而在低滲溶液中將原生質(zhì)體破碎開來。原生質(zhì)體破碎開來。酶的提取酶的提取13 葡萄糖異構酶的分離純化葡萄糖異構酶的分離純化分子篩分子篩 DEAEFF（離子交換層

13、析離子交換層析的一種，的一種， 離子交換樹脂為纖維素類）離子交換樹脂為纖維素類） 透析透析14 IEXC可在中性條件下，利用多肽的可在中性條件下，利用多肽的帶電性不帶電性不同分離純化同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。 在多肽類物質(zhì)的分離分析研究中，對多肽的在多肽類物質(zhì)的分離分析研究中，對多肽的性質(zhì)、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多

14、性質(zhì)、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強度、洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。鹽濃度等對純化影響較大。Wu等報道利用離子等報道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐異構體和牛血交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐異構體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價值的數(shù)據(jù)供今后此類物質(zhì)分離研究。有價值的數(shù)據(jù)供今后此類物質(zhì)分離研究。 離子交換層析離子交換層析15透析透析在純化中極為常用，透析膜的截留分子量為5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危險，在純化中，可除去

15、除去鹽類、有機溶劑、低分子量的抑制劑鹽類、有機溶劑、低分子量的抑制劑等。超濾一般用于濃縮和脫色。 不同種類的蛋白質(zhì)在不同種類的蛋白質(zhì)在分子大小分子大小方面有一定方面有一定的差別，用一些簡便的方法，使蛋白質(zhì)混合的差別，用一些簡便的方法，使蛋白質(zhì)混合物得到初步分離。物得到初步分離。BACK16 提取和分離純化后的酶制成酶制劑（如將某種酶的酶液提取和分離純化后的酶制成酶制劑（如將某種酶的酶液進行干燥處理后，加入適量的穩(wěn)定劑和填充劑），就可以進行干燥處理后，加入適量的穩(wěn)定劑和填充劑），就可以用來催化化學反應了。用來催化化學反應了。 但是，這樣的催化反應結束后，酶制劑和產(chǎn)物是混合在但是，這樣的催化反應結

16、束后，酶制劑和產(chǎn)物是混合在一起的，產(chǎn)物的純度不高，并且酶制劑不能重復使用。為此，一起的，產(chǎn)物的純度不高，并且酶制劑不能重復使用。為此，科學家設想將分離純化后的固定到一定的載體上，使用時將科學家設想將分離純化后的固定到一定的載體上，使用時將被固定的酶投放到反應溶液中，催化反應結束后又能將被固被固定的酶投放到反應溶液中，催化反應結束后又能將被固定的酶回收，這樣的酶叫做定的酶回收，這樣的酶叫做固定化酶固定化酶。例如，將葡萄糖異構。例如，將葡萄糖異構酶吸附到離子交換樹脂上，或者包埋在明膠，制成的固定化酶吸附到離子交換樹脂上，或者包埋在明膠，制成的固定化葡萄糖異構酶，不僅可以用于使葡萄糖轉(zhuǎn)化成甜度更高的

17、高葡萄糖異構酶，不僅可以用于使葡萄糖轉(zhuǎn)化成甜度更高的高果糖漿、而且可以在生產(chǎn)中果糖漿、而且可以在生產(chǎn)中反復使用反復使用。目前，科學家已經(jīng)研。目前，科學家已經(jīng)研制出膜狀、顆粒狀等多種形態(tài)的固定化酶。制出膜狀、顆粒狀等多種形態(tài)的固定化酶。六、酶的固定化17酶的固定化方法歸納起來有三種：酶的固定化方法歸納起來有三種：載體結合法、交聯(lián)法和包埋法。載體結合法、交聯(lián)法和包埋法?？炊藛幔?8載體結合法載體結合法： 指將酶固定到非水溶性載體上的方法。指將酶固定到非水溶性載體上的方法。根據(jù)根據(jù)固定方式的不固定方式的不同，這種方法可以分為物理吸附法、分為物理吸附法、離子結合法和共價結合法。離子結合法和共價結合法

18、。物理吸附法物理吸附法是指將酶吸附到固體吸附劑表面的方法，固體吸附劑多為活性碳、多孔玻璃等。離子結合法離子結合法是指通過離子鍵將酶結合到具有離子交換基團的非水溶性載體上的方法，載體有離子交換樹脂等。共價結合法共價結合法是指酶和載體以共價鍵的形式結合在一起的方法，這種方法需要酶和載體都具有氨基、羧基或羥基等官能團。19交聯(lián)法交聯(lián)法： 指通過雙功能試劑，將酶和酶聯(lián)結成網(wǎng)狀指通過雙功能試劑，將酶和酶聯(lián)結成網(wǎng)狀結構的方法。交聯(lián)法使用的交聯(lián)劑結構的方法。交聯(lián)法使用的交聯(lián)劑 是戊二是戊二醛等水溶性化合物。醛等水溶性化合物。 包埋法：包埋法：指將酶包裹在多孔的載體中，如將酶包裹指將酶包裹在多孔的載體中，如將酶包裹在在聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠等高分子凝膠中，或包等高分子凝膠中，或包裹在裹在硝酸纖維素硝酸纖維素等半透性高分子膜中。前等半透性高分子膜