淺談對微生物限度檢查：微生物計數(shù)法的相關(guān)思考

1、    淺談對微生物限度檢查微生物計數(shù)法的相關(guān)思考    劉慶慶 劉巍摘 要： 筆者針對中國藥典2015 年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法的主要增修訂情況進(jìn)行了相關(guān)解讀。關(guān)鍵詞： 微生物限度檢查；計數(shù)法0 引言2014 年3月28日，國家藥典委員會發(fā)布了中國藥典2015年版通則征求意見稿（通則公示稿），與中國藥典2010 年版比較，2015年版在微生物限度檢查方法和指導(dǎo)原則上均做了較大的修訂。修訂的內(nèi)容主要包括了非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（ 通則1105）、非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106）及非無菌藥品微生物限度

2、標(biāo)準(zhǔn)（通則1107）等，修訂后的微生物限度檢查方法與美國藥典基本一致。這對于需要進(jìn)口或出口的藥品生產(chǎn)企業(yè)來說，因檢測方法基本一致，檢測結(jié)果將具有可比性，并減少了資源浪費(fèi)。1 藥品微生物限度檢查法的變遷1995 年版中國藥典第一次提出藥品微生物限度檢查法，2005 年版中國藥典第一次提出要對所有用于檢查藥品微生物的方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，以防因檢驗方法不科學(xué)造成漏檢或誤判；2010 年版中國藥典中則又一次強(qiáng)調(diào)了進(jìn)行微生物檢驗方法學(xué)驗證的重要性，強(qiáng)調(diào)方法確認(rèn)過程；2015年版中國藥典將方法學(xué)驗證修訂為方法適用性試驗，更加重視對于檢驗全過程的控制，達(dá)到試驗條件、檢驗方法和判定標(biāo)準(zhǔn)三者的統(tǒng)一，使檢驗結(jié)果更

3、具可比性，真正做到與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌。2 藥品微生物計數(shù)方法的建立和確認(rèn)2.1 檢驗方法的選擇藥品微生物計數(shù)方法通常包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（簡稱mpn 法）。平皿法應(yīng)用較廣，是最常用的微生物計數(shù)方法，也是方法適用性試驗的首選；薄膜過濾法適用于有較強(qiáng)抑菌作用且具較強(qiáng)溶液性的供試品；最可能數(shù)法因其精確度較差，更適合于某些受微生物污染程度較小的供試品。在選擇計數(shù)方法時，首先應(yīng)根據(jù)供試品的理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，選擇操作簡便、快速的方法；其次應(yīng)考慮供試品的抑菌性，在使用中和劑或消除抑菌作用時應(yīng)避免損傷供試品中污染的微生物。選擇方法后應(yīng)對所選方法的適用性進(jìn)行確認(rèn)。2.2 檢驗方法的建立一般來說

4、，多數(shù)中成藥制劑都需要進(jìn)行需氧菌總數(shù)計數(shù)，通常應(yīng)依據(jù)藥品自身的特點(diǎn)和標(biāo)準(zhǔn)限值，來擬定檢驗方法，并對計數(shù)方法進(jìn)行適用性試驗，并確認(rèn)其結(jié)果的有效性。例如，實驗室采用不同的方法測定某中成藥口服液的需氧菌總數(shù)，由于中藥制劑受微生物污染的可能性較大，故先擬定平皿法和薄膜過濾法為檢驗方法，并對此方法進(jìn)行適用性試驗。2.2.1 供試液的制備取供試品10g，加入ph7.0 的無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液至100 ml，充分振搖使其溶解，制成110 比例的均勻供試液備用。2.2.2 菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，在35的溫度下培養(yǎng)1824 h，并將此

5、培養(yǎng)物用0.9% 無菌氯化鈉溶液稀釋至菌落數(shù)約為104 cfu/ml 的菌懸液。2.2.3 試驗方法（1）平皿法試驗組：取上述供試液9.9 ml，加入上述菌懸液0.1 ml，使之充分混合均勻，吸取1 ml 混合液至無菌平皿中，然后傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，凝固，需平行制備2個平皿，在35溫度下培養(yǎng)3 d。（2）薄膜過濾法試驗組：試驗前應(yīng)先將少量的ph7.0的無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液濾過，以潤濕濾膜，然后取上述供試液1ml，加入100 ml上述稀釋液，充分混勻，全量濾過后以此稀釋液沖洗濾膜，每次沖洗100ml，沖洗3次，總沖洗量為300ml，在第3次沖洗液中加入不高于100cfu的試

6、驗菌液，混合均勻后抽濾，然后轉(zhuǎn)移濾膜，使其菌面朝上貼在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，在35的條件下培養(yǎng)3d。供試品對照組：取以上供試液，用稀釋液代替菌液同試驗組進(jìn)行操作。菌液對照組：用稀釋液代替供試液，按試驗組方法加入試驗菌液。3 計數(shù)法適用范圍的變化3.1 嗜溫細(xì)菌和真菌的計數(shù)修訂后的微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細(xì)菌和真菌的計數(shù)。與醫(yī)藥相關(guān)的細(xì)菌大多數(shù)是嗜溫的，其生長溫度為2040，真菌是一類重要的致病源，人類最常見的真菌病原體可以分為酵母、霉菌和皮膚真菌。盡管嗜溫細(xì)菌、真菌是影響藥物安全性最主要的因素，其他與特定藥品相關(guān)微生物也需要關(guān)注其有害性。新版藥典以微生物的生理特點(diǎn)和生長

7、特性為依據(jù)，科學(xué)地將細(xì)菌數(shù)修訂為需氧菌總數(shù)（定義為生長在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上所有菌落，也包括霉菌和酵母菌），霉菌和酵母菌數(shù)修訂為霉菌和酵母菌總數(shù)（一般指生長在沙氏葡萄糖瓊脂上的所有菌落，也包括細(xì)菌菌落數(shù)）。如果由于細(xì)菌的生長而使霉菌和酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含有抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基重新進(jìn)行計數(shù)。3.2 新版藥典計數(shù)法不適用于活菌制劑的檢查微生態(tài)活菌制品是由非致病的活菌組成，本身即是微生物，因此新版藥典第三部各論項下的微生態(tài)活菌制品總論對其檢測有專門規(guī)定。修訂后的非無菌產(chǎn)品微生物計數(shù)法明確了其不適用于活菌制劑的檢查，增加了中國藥典2010年版一、二部未規(guī)定的事項，方

8、法的應(yīng)用范圍更加明晰、嚴(yán)謹(jǐn)。3.3 明確了可采用替代法可采用自動檢測等方法替代藥典方法，但須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的方法。這一原則使得方法更具科學(xué)性、時代性、開放性和靈活性，有利于鼓勵方法創(chuàng)新和現(xiàn)代儀器設(shè)備的使用，促進(jìn)檢測技術(shù)的發(fā)展。3.4 增加了檢測產(chǎn)品范圍新版藥典規(guī)定微生物計數(shù)法適用于生物制品和醫(yī)療器械等其他產(chǎn)品，強(qiáng)調(diào)了除藥品外的其他醫(yī)藥產(chǎn)品也可應(yīng)用。4 計數(shù)法檢測環(huán)境的變化中國藥典2010年版規(guī)定微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100 級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。而2010 年版藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范，引入了動態(tài)連續(xù)監(jiān)測，將藥品生產(chǎn)所需的潔凈區(qū)分為a、b、c、d 4

9、個級別。各國藥典對檢驗檢測環(huán)境通常只做出了在適宜的潔凈度的環(huán)境中進(jìn)行的要求?；谖覈鴩椋掳嫠幍鋵z驗檢測環(huán)境僅做原則性要求，試驗環(huán)境必須符合微生物限度檢查的要求。但在通則9203 藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則中給出具體指導(dǎo)意見，微生物計數(shù)試驗應(yīng)在受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于b 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。對出具法定藥品檢驗報告書的實驗室，檢驗環(huán)境低于生產(chǎn)環(huán)境將會導(dǎo)致報告書的權(quán)威性受到挑戰(zhàn)，從長遠(yuǎn)的觀點(diǎn)看，檢驗環(huán)境應(yīng)不低于生產(chǎn)環(huán)境。5 計數(shù)檢測用試劑試藥的變化污染微生物在供試品中的分布具有隨機(jī)性、不均勻性的特點(diǎn)，供試液制備過程中，中和劑、滅活劑和表面活性劑應(yīng)對微生物生長無毒，相互間具有

10、相容性，有利于供試品中微生物均勻分布，提高計數(shù)的準(zhǔn)確性以真實反映藥物的微生物污染狀況。中國藥典2015年版新增了“供試液制備時如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對微生物無毒性及所使用中和劑或滅活劑的相容性”的要求。相容性要求供試品不一定要完全溶解于稀釋液中，但要均勻分散，形成均一、穩(wěn)定的供試液分散體系，這是獲得高準(zhǔn)確性和良好檢驗結(jié)果的基礎(chǔ)。結(jié)語新版藥典微生物檢查體系在樣品前處理、微生物選擇性培養(yǎng)和鑒定確認(rèn)等方面的規(guī)定更為靈活，為檢驗技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展提供了空間，有利于藥品質(zhì)量從最終產(chǎn)品檢驗向過程控制轉(zhuǎn)變。通過增修訂，新版藥典藥品微生物控制標(biāo)準(zhǔn)體系不僅實現(xiàn)了中國藥典三部通則的統(tǒng)一，且解決了中國藥典與ich 協(xié)調(diào)案的協(xié)調(diào)問題，完