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文檔簡介

1、肝臟巨噬細胞肝臟巨噬細胞(kcs)的分離的分離與培養(yǎng)與培養(yǎng) 研究生：魏思東 戴卓婭導師： 龔建平 2010-05-04 肝臟細胞懸液制備門靜脈穿刺，以10mlmin流量經(jīng)門靜脈灌注pbs ，直至肝臟呈黃白色，總量約20ml。再用20ml 0.05的型膠原酶溶液(sigma ，pbs液稀釋)門靜脈灌注(小鼠不用此步驟）。取下肝臟加入20ml 0.05膠原酶，37 oc孵育40 min，經(jīng)200目細胞篩過濾。pbs稀釋至50ml, 300g 5 min，4oc，離心洗滌2次，取沉淀pbs稀釋至50ml，用50gg 3min, 4oc離心，棄沉淀，將上清液以300g，5min, 4oc離心，取沉淀。

2、 用鑷子劃碎肝組織裝入試管消化 肝臟消化吹打后細胞懸液 細胞懸液過濾 洗滌與肝細胞沉淀 梯度離心percoll原液9份加入1份pbs（10倍濃度）配成100%的sip。取4支無菌離心管，沿著管壁加入2 ml 50的sip，然后傾斜（60o）試管，輕輕的沿著管加2ml25的sip細胞懸液（小鼠2管，大鼠4管）。500g，離心15 min，4oc， 50的sip和25的sip層面之間有一層白色物，吸管輕輕的吸取之，置離心管中，用pbs離心清洗2遍，棄上清(300g，5min)。 非肝細胞sip離心準備 sip離心后細胞層與洗滌 細胞貼壁 把細胞按5x105/ml濃度種植于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)2h。取出培

3、養(yǎng)板，用37的pbs液輕輕沖洗3次，去除未貼壁細胞，貼壁細胞即為實驗所用的kcs。剛分離出的細胞 kcs的培養(yǎng)方法培養(yǎng) 5co2、37、95濕度。換液間隔時間為2d。培養(yǎng)基配方為dmem（h）+雙抗+10%胎牛血清（hyclone）。 2天及3天kcs 2周及3周kcs kcs的鑒定活力判定 通過形態(tài)學觀察及吞噬功能鑒定活力：在體外培養(yǎng)的24孔板細胞換液時，加入已消毒碳素墨水的培養(yǎng)基(1/250)，2 h后倒置顯微鏡觀察，記數(shù)200個細胞，觀察具有吞噬功能的細胞數(shù)量。0.2%臺盼藍拒染色判斷細胞活力。 f4/80免疫熒光鑒定kcs（小鼠）， cd163免疫組化鑒定kcs（大鼠）,陽性為kcs。 kcs 吞墨圖像與臺盼藍拒然圖片f4/80的免疫熒光和cd163免疫細胞化學(x400)致謝

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