畢業(yè)論文逍遙散的抗抑郁研究

1、畢業(yè)論文逍遙散的抗抑郁研究逍遙散的抗抑郁研究摘要：探討逍遙散的抗抑郁作用，為其疏肝解郁功效及臨床應(yīng)用提供 藥理學(xué)參考。方法：采用小鼠的小鼠慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(cums)結(jié)合孤 養(yǎng)抑郁模型的建立、小鼠體重測定、糖水消耗量實(shí)驗(yàn)、小鼠自主活動測 定、morris水迷宮等實(shí)驗(yàn)觀察逍遙散的抗抑郁作用。關(guān)鍵詞 抗抑郁抑郁癥是一種常見的精神疾病，近年來其發(fā)病率呈不斷上升趨勢，己 成為全球性的主要精神衛(wèi)生問題之一，與其相關(guān)的治療藥物日益受到重視。 逍遙散功用疏肝解郁、健脾養(yǎng)血，主治肝郁血虛脾弱z證，是調(diào)和肝脾的 代表方藥。大量臨床資料顯示該方在精神科疾患治療中運(yùn)用廣泛，特別是 在抑郁癥的輔助治療中取得較好療

2、效。己有報(bào)道顯示逍遙散可減少行為絕望模型小鼠的不動時間，提高cums模型大鼠的糖水消耗量等，表現(xiàn)出抗抑郁效應(yīng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證其抗 抑郁作用，本課題通過利用一系列輕、中等強(qiáng)度的不可預(yù)知刺激結(jié)合孤養(yǎng) 方式對小鼠連續(xù)實(shí)施6周，造成cums結(jié)合孤養(yǎng)的小鼠抑郁模型，以小鼠 體重變化、行為學(xué)指標(biāo)和糖水消耗實(shí)驗(yàn)來判定逍遙散的抗抑郁作用。糖水 消耗量反映動物的獎賞反應(yīng)程度，模型動物出現(xiàn)糖水飲用量下降的現(xiàn)象， 稱之為快感缺失，是抑郁癥的核心癥狀。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：小鼠被施加 慢性輕度不可預(yù)知應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)造模程序6周后，與空白組小鼠比較，其 體重增長緩慢，小鼠的糖水飲用量明顯降低，陽性藥阿米替林給予后可逆 轉(zhuǎn)上述變

3、化。此外，實(shí)驗(yàn)中采用morris水迷宮對模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)模型 小鼠該能力明顯下降。morris水迷宮檢測的是動物的定向和搜索行為，能 反應(yīng)動物對陌生環(huán)境的學(xué)習(xí)和記憶能力。因此，可以認(rèn)為cums結(jié)合孤養(yǎng) 的造模方式不僅可干預(yù)小鼠的生長，降低小鼠的活動性、社會交往能力, 使模型小鼠出現(xiàn)抑郁癥的核心癥狀快感缺失，而且還能模擬臨床抑郁 癥患者思維遲鈍、學(xué)習(xí)記憶能力下降的表現(xiàn)，表明本次實(shí)驗(yàn)小鼠抑郁模型 復(fù)制成功。模型動物在給予逍遙散治療后，逍遙散30、20g - kg-1劑量組 可不同程度逆轉(zhuǎn)上述變化，表明逍遙散具有抗抑郁作用。同時，研究采用 小鼠自主活動實(shí)驗(yàn)，檢測逍遙散在所試劑

4、量下有無中樞興奮作用。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，逍遙散在所試劑量下對小鼠的自主活動無影響，表明其無中樞興 奮作用，進(jìn)一步明確了該方在所試劑量下的抗抑郁作用。綜上，逍遙散不僅具有較好的抗抑郁作用，還可提高正常及抑郁模型 小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，其作用可能與影響單胺類遞質(zhì)及抗氧化、改善腦 內(nèi)血液循環(huán)冇關(guān)。1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)藥品逍遙散水煎液：組成按照方劑學(xué)所載：柴胡9g,當(dāng)歸寵白芍9g, 白術(shù)寵，茯苓寵，甘草4.5g,薄荷少許，生姜一塊。藥材均購自成都中陜 藥大學(xué)附屬醫(yī)院老中醫(yī)門診部，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本屮心盧先明教授鑒定，柴胡為傘形科植物柴胡bupleurum chinense dc.的干燥根，當(dāng)歸為傘

5、形科植物當(dāng)歸angelica sinensis (oliv.) diels.的干燥根，白芍為毛良科植物芍藥paeonia lactiflora pall.的干燥根，茯苓為多孔菌 科真菌茯苓poria cocos（schw.）wolf.的干燥菌核，口術(shù)為菊科植物口術(shù) atractylodes macrocephala koidz.的干燥根莖，甘草為豆科植物甘草 glycyrrhiza uralensis fisch的干燥根及根莖，薄荷為唇形科植物薄荷 menthae haplocalyx briq.的干燥地上部分。制備方法：按比例取以上藥材加 8倍量水浸泡30min,加熱煮沸，文火煎煮lh,趁熱

6、濾過；同法煎煮40min 及30min；合并三次濾液，文火濃縮至含生藥lg ml-1和1.5g ml-1,藥 液4°c冰箱保存?zhèn)溆?。煎劑采用高效液相色譜法（中華人民共和國藥典2005年版）對英中 的芍藥昔進(jìn)行定量分析，制備滿足樣品含量范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2）,計(jì)算 樣品中芍藥昔的含量。結(jié)果表明：逍遙散1.5g-ml-l. lg - ml-1及0.5g ml-1水煎液中分別含芍藥昔1.13mg mll、0.75mg ml-1 和 0.38mg ml-1,色譜圖見圖 2,3。figl.standard cuve of peordflorinfig2.hplc chromatography

7、 of peordflorinfig3. hplc chromatography of xiaoyao powder decoction阿米替林：sigma公司，批號039k1600，臨用時用生理鹽水配成所需 濃度溶液。1.2實(shí)驗(yàn)試劑芍藥背對照品：中國藥品生物制品檢定所，批號：110736-201026o 0.9% 氯化鈉注射液：四川科倫藥業(yè)股份有限公司,批號b051030r苦味酸:臺 山市眾城化工有限公司，批號20090701雀巢奶粉：批號20100412a1.3實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)場地icr小鼠，雄性，初始體重25-28g,四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究 所提供，合格證號:scxk (川)2008

8、-24o實(shí)驗(yàn)場地為國家中醫(yī)藥管理局成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理科研三級實(shí)驗(yàn)室(no.tcm-03-043)o1.4實(shí)驗(yàn)儀器postar218高效液相色譜儀：美國瓦里安公司液相進(jìn)樣針(25 u i)：美國 hamilton companyvarian 325 uv/is檢測器：美國瓦里安公司mt-200 morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)：成都泰盟科技有限公司ba-200小鼠避暗儀：成都泰盟科技有限公司zz6小鼠自主活動測定儀：成都泰盟科技有限公司101c-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司ld600-1型電子天平：沈陽龍騰電子稱量儀器冇限公司bs323s型電子天平：德國sartorious公司2

9、實(shí)驗(yàn)方法2.1逍遙散抗抑郁作用研究2.1.1逍遙散對慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(cums)結(jié)合孤養(yǎng)抑郁模型動物 的影響2.1.1.1動物分組及給藥方法選取健康雄性icr小鼠，初始體重25-28g,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，5只/籠， 期間進(jìn)行糖水訓(xùn)練及開場實(shí)驗(yàn)，于造模前id采用morris水迷宮對小鼠進(jìn) 行學(xué)習(xí)記憶初篩（兩輪共8次），以兩輪在lmin內(nèi)找到平臺者為合格，否則 予以淘汰。以上指標(biāo)結(jié)合體重，隨機(jī)分為空白組，模型組，阿米替林組 （10mg - kg-1）逍遙散高、中、低劑量組（30、20、10g kg-1,分別為成人 （70kg）臨床日用劑量的30、20、10倍）。除空白組5只/籠飼養(yǎng)外，其余各組均

10、單籠飼養(yǎng)并實(shí)施造模程序。造模2 周后開始給藥，藥物組灌胃給予相應(yīng)藥液，模型組和空白組灌胃給予等體 積蒸鐳水，每天1次，連續(xù)4周。2.1.1.2實(shí)驗(yàn)方法2.1.1.2.1小鼠慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激（cums）結(jié)合孤養(yǎng)抑郁模型的建實(shí)驗(yàn)實(shí)施過程中，除空白組外，其余各組小鼠在6周內(nèi)每天以23次的頻率交替接受以下刺激：潮濕墊料（200ml水籠1）、異物刺激、置于空 籠、4°c冷刺激（冷水游泳）5min. 45°c熱刺激5min（置于烘箱）、鼠籠450傾斜、1ma電刺激+周期性噪音（10db）、明暗顛倒、禁食、禁水等。所冇刺 激隨機(jī)安排并盡量保證不在同一時間點(diǎn)進(jìn)行，使小鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)

11、生。具體執(zhí)行安排見表lotabl. protocol of chr onic un predictable mild stress2.1.1.2.2小鼠體重測定分別在造模前id,造模2、4和6周進(jìn)行小鼠體重測定，計(jì)算小鼠體重增長數(shù)（造模后體重造模前體重，g）o2.1.1.2.3糖水消耗量實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前，在環(huán)境安靜的條件下訓(xùn)練小鼠使其適應(yīng)含糖飲水，2d/次，訓(xùn) 練3次，然后在造模前id和造模后的每周星期一測定糖水飲用量：小鼠 禁食禁水18h后，每只小鼠給予2個已稱重（初重，g）的喂水瓶（1瓶1%蔗 糖水,1瓶白水），lh后，取走水瓶并稱量剩余液體重量（末重，g）,計(jì)算小 鼠的糖水消耗量（初重末重，g

12、）o2.1.1.2.4小鼠自主活動測定分別在造模前id和造模結(jié)束后id進(jìn)行小鼠自主活動測定，在環(huán)境安 靜的條件下將小鼠放入zz-6小鼠自主活動測定儀中，適應(yīng)2min后觀察 4min內(nèi)的活動次數(shù)。2.2逍遙散對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響2.2.1實(shí)驗(yàn)方法2.2.1.1morris水迷宮實(shí)驗(yàn)方法morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)由水池、休息平臺、記錄裝置和分析 軟件組成。水池外有固定參照物如門、窗，掛件等。實(shí)驗(yàn)者每次試驗(yàn)位置 保持不變。水中加牛奶至不透明，水溫為22-24°c,水面高于休息平臺約 lcmo將水池平均分為四個象限（ne, nw, se, sw）,平臺放于se象限中 央。檢測時，

13、將小鼠頭部及背部用苦味酸涂成黃色以做跟蹤分析。morris水迷宮測試程序主要包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)兩個部 分：定位航行實(shí)驗(yàn)（place navigation）：每天每鼠訓(xùn)練4次。將小鼠分別從4 個象限面向池壁輕輕放入池中，測其60s內(nèi)找到平臺所需的時間（即逃避潛 期上scape latency, el）。如在60s內(nèi)小鼠不能觸到平臺,則實(shí)驗(yàn)者將其引上 平臺并令其停留15s,記錄逃避潛伏期為60s,計(jì)算4次潛伏期的平均值作 為每天的成績。以第3天訓(xùn)練的成績作為小鼠的學(xué)習(xí)記憶成績。空間探索試驗(yàn)(spacial probe test)：于第4天測定。撤除平臺，從原平 臺象限對側(cè)池壁屮點(diǎn)將小鼠

14、放入水屮，記錄60s內(nèi)小鼠首次穿越原平臺的 時間、穿越原平臺的次數(shù)及原平臺象限游泳時間占總時間的百分比，以反 映小鼠空間工作記憶能力。2.2.1.2逍遙散對抑郁模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響采用morris水迷宮觀察逍遙散對抑郁模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的 影響。選取2.1.1項(xiàng)中小鼠于造模完畢后進(jìn)行，方法同222。3結(jié)果與討論3.1逍遙散抗抑郁作用研究3.1.1逍遙散對慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(cums)結(jié)合孤養(yǎng)抑郁模型動 物的影響3.1.1.1逍遙散對抑郁模型小鼠體重的影響結(jié)果見表2及圖4o結(jié)果表明：與空白組比較，模型小鼠體重增長數(shù)明顯減少(p<0.05 或p<o.o

15、l),灌胃給藥3周后，逍遙散各劑量組表現(xiàn)出一定提高模型小鼠 體重增長的趨勢；在給藥4周后，逍遙散高劑量組(30g - kg-1)小鼠體重增 長己明顯高于模型組(p<0.05),中、低劑量(20、10gkgl)均表現(xiàn)出一定 提高趨勢。阿米替林 kgl)對模型小鼠體重增長無明顯作用。tab2. effect of xiaoyao powder on weight increasing in cums model mice 仕s)mice(ndose(g-kweight increasing (g)groupcontrol 10g-1)-1.72* 4.08model101.49ami

16、triptyline 100.013.99±4.67±2.35 ±4.56±2.133.13 6.92士1.95*2.25* 6.46士week 2 5.64week 4 ±&71week 6 ±11.382.02xiaoyao10powder xiaoyao10powder xiaoyao10powder102.15201.64 4.02士5.43±2.02301.98 4.11士5.06±1.274.04士5.26±2.352.348.002.52* 7.182.24 7.361.86+ohm

17、bnotes: compared with model group: *p<0.05, *p<0.01fig4 effect of xiaoyao powder on weight increasing in cums model mice3.1.1.2逍遙散對抑郁模型小鼠糖水消耗量的影響結(jié)果見表3和圖5o結(jié)果表明：與空白組比較，模型小鼠從造模第2周起，其糖水消耗量 便持續(xù)減少(p<o.o5或p<o.ol),提示造模程序能引起小鼠的快感缺 失。灌胃給藥3周后，阿米替林(10mg kgl)及逍遙散高劑量(30g kg-1) 明顯提高模型組小

18、鼠糖水消耗量(p<o.o5),逍遙散中劑量(20g - kg-1)現(xiàn) 出了一定提高趨勢。給藥4周后，除阿米替林，逍遙散高劑量組外，逍遙 散屮劑量(20g - kg-1)也使模型小鼠糖水消耗量明顯升高(p<0.05),低劑 量(10g kgl)僅有提高的趨勢。tab3 effect of xiaoyao powder on sweet water con sumption in cums model mice (±s)dosemicegroup(n)kg-1)2.45control 10 - ±0.76 2.39model 10 - ±0

19、.78amitripty10line 0.01 ±±0.58 0.94 0.86 0.80* 1.21*2.352.052.23±2.10±2.33±2.46±2.03±±0.62* 0.611.631.26±1.21±1.51±1.48±1.09±±0.92 0.521.751.22±1.43±1.83±2.09±1.97±0.81 0.55 0.49 0.57 0.91* 0.56* 0.62*0.43

20、* (g-line 12 3 base week week week week 4 week 5 week 60.222.41xys 10 30 ±1.062.37xys 10 20 ±0.912.43xys 10 10 ±0.61 0.65 1.781.26±1.48±1.76±2.07±1.74±±0.94 0.511.601.27±1.49±1.61±1.70±1.71±±0.90 0.75 1.731.24±1.13±

21、1.40±1.36±1.39±±0.74 0.72 0.36 0.74 0.80 0.54 1.16 0.52 0.74 0.60* 0.42 0.64 0.54* 0.62*notes: compared with model group: *p<0.05, *p<0.01.xys means xiaoyao powder.fig5. effect of xiaoyao powder on sweet water con sumption in cums model mice3.1.1.3逍遙散對抑郁模型小鼠自主活動的影響結(jié)

22、果見表4結(jié)果表明：與空白組比較造模前后小鼠自主活動無顯著性差異，表明 逍遙散在所試劑量下對cums小鼠自主活動無明顯影響。tab4. effect of xiaoyao powder on locomotor activity in cums mice (±s)dose number of moving numbermice(groupn)kg-1) base line week 6control 10 101.30±92.5base line week 6 ±54.50±57.80±(g-/4min rearing/4min of16.90m

23、odelamitripty linexys 10 30 25.74xys 10 2023.69xys 10 1029.61 0.01 18.63 10 26.33 17.77 14.17 1.77106.60±104.80±55.20±62.6±9.66 15.60 18.02 90.40±94.811.02±57.40±5983±205 9.43 102.10±96.40±52.60±56.80±3.02 10.00 8.11 95.10±97.00±5

24、9.50±56.67±5.72 21.10 3.21 96.00±88.25±54.60±57.50±8.63 12.90 4.53綜上，逍遙散可緩解cums小鼠的體重增長緩慢，提高其運(yùn)動能力及 探索能力，并能拮抗cums小鼠的快感缺失，表現(xiàn)出良好的抗抑郁作用。 同時，在英有效劑量下，不會影響小鼠自主活動。3.2逍遙散對抑郁模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響結(jié)果見表5及圖6o結(jié)果表嘰與空白組比較,模型小鼠逃避潛伏期明顯延長(p<005), 同時空間探索實(shí)驗(yàn)中穿越平臺的次數(shù)及原平臺象限游泳時間占總時間的 百分比顯著減少(p<0.01),提示造模程序能使小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力降 低。給藥4周后，逍遙散高劑量(30g - kg-1)使模型小鼠的逃避潛伏期明顯 縮短(p<005),穿越原平臺的次數(shù)明顯