參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)PPT課件

1、 現(xiàn)在已經(jīng)知道約現(xiàn)在已經(jīng)知道約2020多種蛋白質(zhì)參與復(fù)制。多種蛋白質(zhì)參與復(fù)制。（1 1）聚合酶）聚合酶（2 2）解解 鏈、鏈、 解解 旋旋 酶酶 類類（3 3）引發(fā)酶）引發(fā)酶（4 4）連接酶）連接酶 下表是與大腸桿菌復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)。下表是與大腸桿菌復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)。第1頁(yè)/共51頁(yè)蛋白質(zhì)名稱蛋白質(zhì)名稱分子量分子量103U亞基數(shù)亞基數(shù) 功功 能能每個(gè)菌中的每個(gè)菌中的分子數(shù)分子數(shù)毫克蛋白質(zhì)毫克蛋白質(zhì)公斤細(xì)胞（濕重）公斤細(xì)胞（濕重）SSBi蛋白蛋白n蛋白蛋白n 蛋白蛋白n蛋白蛋白dnaCdnaB引發(fā)酶引發(fā)酶 74 80 25 75 11 29300 6044111161與單鏈結(jié)合與單鏈結(jié)合預(yù)引發(fā)預(yù)

2、引發(fā)預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)部位識(shí)別部位識(shí)別,ATPase預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)預(yù)引發(fā)移動(dòng)啟動(dòng)子移動(dòng)啟動(dòng)子,ATPase引發(fā)合成引發(fā)合成300 50 30 70 -100 20 50 20 0.5 0.3 0.3 0.2表表 與大腸桿菌復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)與大腸桿菌復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)接下頁(yè)接下頁(yè)BACK第2頁(yè)/共51頁(yè)蛋白質(zhì)名稱蛋白質(zhì)名稱分子量分子量103U亞基數(shù)亞基數(shù) 功功 能能每個(gè)菌中的分子每個(gè)菌中的分子數(shù)數(shù)毫克蛋白質(zhì)毫克蛋白質(zhì)公斤細(xì)胞（濕重）公斤細(xì)胞（濕重）Pol 全酶全酶 140 25 10 37 52 32 831121211鏈的延長(zhǎng)鏈的延長(zhǎng)30020 0.5Pol 1091填補(bǔ)缺口和切去引填補(bǔ)缺口和切去

3、引物物30010連接酶連接酶 741連接連接30010拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 400 210 190422引進(jìn)超螺旋引進(jìn)超螺旋_25025rep 蛋白蛋白 解鏈酶解鏈酶dnaA 65 75 4811解開雙鏈解開雙鏈復(fù)制起始復(fù)制起始5050002000.6Rep蛋白是一種大腸桿菌解鏈酶蛋白是一種大腸桿菌解鏈酶第3頁(yè)/共51頁(yè) 1 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶是指以脫氧核苷三磷酸作為底物催化合成是指以脫氧核苷三磷酸作為底物催化合成DNA的一類酶。的一類酶。 全稱：全稱： DNA依賴的依賴的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)簡(jiǎn)稱：簡(jiǎn)稱：DNA-p

4、ol活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性第4頁(yè)/共51頁(yè) 所有DNA聚合酶的作用方式基本相似。它們催化脫氧核苷三磷酸加到復(fù)制中的DNA鏈的3羥基末端，合成方向從53，由模板決定加上何種脫氧核苷酸。 第5頁(yè)/共51頁(yè)5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突變的能切除突變的 DNA片段和片段和RNA引物。引物。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其

5、水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 目 錄第6頁(yè)/共51頁(yè)第7頁(yè)/共51頁(yè)DNADNA聚合酶的分類聚合酶的分類DNA-pol 主要的修復(fù)酶主要的修復(fù)酶DNA-pol 次要的修復(fù)酶次要的修復(fù)酶DNA-pol 復(fù)制酶復(fù)制酶DNA-pol IV SOS修復(fù)修復(fù)DNA-pol V SOS修復(fù)修復(fù)原核生物的聚合酶原核生物的聚合酶第8頁(yè)/共51頁(yè) (1) 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I (Pol ) 純的純的DNA聚合酶聚合酶I由分子量由分子量109 000U (109KD)，含，含928個(gè)氨基酸殘基的個(gè)氨基酸殘基的一條肽鏈構(gòu)成，每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中大約含一條肽鏈構(gòu)成，每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中大約含400

6、個(gè)酶分子。個(gè)酶分子。(單鏈多肽）單鏈多肽） 功能功能：對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。第9頁(yè)/共51頁(yè)323個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸小片段（小片段（34KD）5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 （76KD）604個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端枯草桿菌蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶胰蛋白酶DNA-pol 第10頁(yè)/共51頁(yè)DNA聚合酶聚合酶的的多種活性。多種活性。 53聚合活性：聚合活性： 在模板指導(dǎo)下，以脫氧核苷三磷酸為底

7、物在引物在模板指導(dǎo)下，以脫氧核苷三磷酸為底物在引物3-OH末端加上脫氧核末端加上脫氧核苷酸苷酸。每個(gè)酶分子每分鐘添加。每個(gè)酶分子每分鐘添加1 000個(gè)單核苷酸。個(gè)單核苷酸。 聚合酶催化的聚合酶催化的DNA的合成需要以下條件：的合成需要以下條件： 模板模板 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 必須有一必須有一 3-OH末端的引物，且此引物必須與模板正確形成氫鍵末端的引物，且此引物必須與模板正確形成氫鍵 合成從合成從53方向進(jìn)行，如圖方向進(jìn)行，如圖7-8和圖和圖7-9所示所示第11頁(yè)/共51頁(yè)第12頁(yè)/共51頁(yè) 35外切酶活性：外切酶活性：沒有脫氧核苷三磷酸底物時(shí)沒有脫氧核苷三磷酸底物時(shí)，DNA聚合酶聚

8、合酶 I 能從能從3-OH開開始以始以35方向水解方向水解DNA，產(chǎn)生，產(chǎn)生5-單核苷酸。單核苷酸。 實(shí)際上實(shí)際上DNA復(fù)制時(shí)，加上去的脫氧核苷酸不一定每次都正復(fù)制時(shí)，加上去的脫氧核苷酸不一定每次都正確，錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)不少，有時(shí)甚至加上一個(gè)不與模板配對(duì)的核苷確，錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)不少，有時(shí)甚至加上一個(gè)不與模板配對(duì)的核苷酸，酸，當(dāng)當(dāng)3-OH末端的堿基不與模板配對(duì)時(shí)聚合酶就無(wú)聚合活性，末端的堿基不與模板配對(duì)時(shí)聚合酶就無(wú)聚合活性，此時(shí)它具有的此時(shí)它具有的35外切酶活性可以切除這個(gè)不配對(duì)的核苷酸，外切酶活性可以切除這個(gè)不配對(duì)的核苷酸，這一堿基切除后，外切核酸酶活性終止，聚合酶活性恢復(fù)，這一堿基切除后，外切核酸酶活

9、性終止，聚合酶活性恢復(fù)，如如圖圖7-10所示。所以聚合酶的所示。所以聚合酶的35外切酶活性也叫外切酶活性也叫修補(bǔ)活性修補(bǔ)活性。第13頁(yè)/共51頁(yè)第14頁(yè)/共51頁(yè) 53外切酶活性：外切酶活性： DNA聚合酶聚合酶I具有具有53外切酶活性。外切酶活性。 如圖如圖7-11，其特點(diǎn)是：，其特點(diǎn)是： 只能在只能在5-P末端一個(gè)接一個(gè)地切除核苷酸；末端一個(gè)接一個(gè)地切除核苷酸； 能連續(xù)地切除多個(gè)核苷酸；能連續(xù)地切除多個(gè)核苷酸； 只切除配對(duì)的只切除配對(duì)的5-P末端核苷酸，不切除不配對(duì)的單鏈末端核苷酸，不切除不配對(duì)的單鏈5-P末端核苷酸；末端核苷酸； 既能切除脫氧核苷酸也能切除核苷酸；既能切除脫氧核苷酸也能切

10、除核苷酸； 對(duì)只具有對(duì)只具有5-P末端的切口也有活性（由于在末端的切口也有活性（由于在DNA復(fù)制過復(fù)制過程中一般情況下只在程中一般情況下只在RNA引物處才有缺口，引物處才有缺口，因此因此53外切酶外切酶活性的主要功能是切除核糖核苷酸引物活性的主要功能是切除核糖核苷酸引物）。）。 第15頁(yè)/共51頁(yè)第16頁(yè)/共51頁(yè) 切口翻譯切口翻譯(nicktranslation) DNA聚合酶聚合酶 I 的的53外切酶活性和聚合活性同時(shí)作用可外切酶活性和聚合活性同時(shí)作用可以進(jìn)行切口翻譯以進(jìn)行切口翻譯(nicktranslation)，用來，用來制造放射性探針制造放射性探針。 在反應(yīng)物里加入同位素標(biāo)記的脫氧單

11、核苷酸，在反應(yīng)物里加入同位素標(biāo)記的脫氧單核苷酸，DNA聚合酶聚合酶I 首先利用首先利用53外切酶活性，從切口處逐個(gè)切下外切酶活性，從切口處逐個(gè)切下DNA上的核苷上的核苷酸，再利用酸，再利用3-OH末端聚合作用末端聚合作用逐個(gè)將標(biāo)記的核苷酸加上去逐個(gè)將標(biāo)記的核苷酸加上去(圖圖712)。第17頁(yè)/共51頁(yè)5353第18頁(yè)/共51頁(yè) 內(nèi)切酶活性：內(nèi)切酶活性：DNA聚合酶聚合酶 I 也具有也具有53 內(nèi)切酶活性，如圖內(nèi)切酶活性，如圖7-13所示。在兩個(gè)堿基之所示。在兩個(gè)堿基之間切開產(chǎn)生一個(gè)具有間切開產(chǎn)生一個(gè)具有5-P 末端的末端的不配對(duì)堿基的片段不配對(duì)堿基的片段。 很多實(shí)驗(yàn)證明很多實(shí)驗(yàn)證明DNA聚合酶

12、聚合酶 I 在大腸桿菌復(fù)制中不是主要的合成酶，而在大腸桿菌復(fù)制中不是主要的合成酶，而是是在除去在除去RNA引物和損傷修復(fù)中起重要作用。引物和損傷修復(fù)中起重要作用。第19頁(yè)/共51頁(yè)不配對(duì)的片段不配對(duì)的片段內(nèi)切酶活性內(nèi)切酶活性第20頁(yè)/共51頁(yè) （2） 大腸桿菌大腸桿菌 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶缺陷的突變株仍能生存，這表明缺陷的突變株仍能生存，這表明DNApol不是不是DNA復(fù)制的主要聚合酶。人們開始尋找另外的復(fù)制的主要聚合酶。人們開始尋找另外的DNA聚合酶，并于聚合酶，并于1970年發(fā)現(xiàn)了年發(fā)現(xiàn)了DNApol。 從從53方向合成方向合成DNA 具有具有35外切酶活性外切酶活性，但

13、沒有，但沒有53外切酶活性。外切酶活性。 在體外的合成速率比體內(nèi)的速率要低得多，帶有這個(gè)酶缺陷在體外的合成速率比體內(nèi)的速率要低得多，帶有這個(gè)酶缺陷的大腸桿菌突變株染色體的復(fù)制各方面都正常，它在體內(nèi)的功能的大腸桿菌突變株染色體的復(fù)制各方面都正常，它在體內(nèi)的功能可能和可能和DNA聚合酶聚合酶 I 類似。類似。 第21頁(yè)/共51頁(yè) (3) 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 聚合酶聚合酶是體內(nèi)是體內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶復(fù)制所必需的酶 帶有帶有DNA聚合酶聚合酶 的溫度敏感突變的溫度敏感突變 (polc) 的大腸桿菌在限制溫度的大腸桿菌在限制溫度下是不能存活的，從這種菌株得到的裂解液也不能合成下是不能

14、存活的，從這種菌株得到的裂解液也不能合成DNA，當(dāng)加入正，當(dāng)加入正常細(xì)菌的常細(xì)菌的DNA 聚合酶聚合酶 時(shí)可以恢復(fù)它的聚合能力，因此不同于時(shí)可以恢復(fù)它的聚合能力，因此不同于DNA聚聚合酶合酶I和和，聚合酶聚合酶是體內(nèi)是體內(nèi)DNA復(fù)制所必需的酶。復(fù)制所必需的酶。 DNA多聚酶多聚酶相當(dāng)復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)和各亞基的功能如圖相當(dāng)復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)和各亞基的功能如圖1124，25所示。所示。 DNA pol 具有具有53聚合功能。聚合功能。 第22頁(yè)/共51頁(yè)DNA聚合酶聚合酶 的的 “核心酶核心酶”由由、三種亞基組成。三種亞基組成。 亞基具有合成亞基具有合成DNA的能力。的能力。 亞基具有亞基具有35外切酶的功

15、能，起到外切酶的功能，起到校正的作用。校正的作用。 亞基可能在組裝中發(fā)揮功能。亞基可能在組裝中發(fā)揮功能。亞基加到核心酶上使其二聚化，亞基加到核心酶上使其二聚化，進(jìn)一步產(chǎn)生進(jìn)一步產(chǎn)生pol III。復(fù)合體加入到復(fù)合體加入到pol ，進(jìn)一，進(jìn)一步形成步形成 pol 復(fù)合體。復(fù)合體。 復(fù)合體是由復(fù)合體是由，和和亞基組成，其作用是固定亞基組成，其作用是固定亞基這個(gè)亞基這個(gè)“夾子夾子”的支架。的支架。亞基亞基：形成夾鉗，保持催化核形成夾鉗，保持催化核心和模板鏈的結(jié)合心和模板鏈的結(jié)合第23頁(yè)/共51頁(yè) 聚合酶聚合酶的活性的活性 聚合活性：聚合活性： DNA復(fù)制時(shí)聚合酶復(fù)制時(shí)聚合酶 全酶十分重要，它可以全酶

16、十分重要，它可以在在DNA模板上的引物的模板上的引物的3-OH上以每分鐘約上以每分鐘約50 000核苷酸的速核苷酸的速率逐個(gè)延伸新生的率逐個(gè)延伸新生的DNA。 35和和53的外切酶活性：的外切酶活性： pol 的的53外切酶活性與外切酶活性與pol的不同，的不同，pol 的的53外切酶活性只對(duì)外切酶活性只對(duì) 單鏈單鏈 DNA有作用，因此不能用于缺口翻譯。有作用，因此不能用于缺口翻譯。DNA聚合酶聚合酶的作用范圍如圖的作用范圍如圖7-14所示。所示。 第24頁(yè)/共51頁(yè)第25頁(yè)/共51頁(yè)催化DNA聚合參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)修復(fù)合成、切除引物、填補(bǔ)空隙功能2040400分子數(shù)/細(xì)胞1011亞

17、基數(shù)+-+5 外切酶活性+ 5 外切酶活性+5 聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE. Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶第26頁(yè)/共51頁(yè) (4) 真核生物中的真核生物中的DNA聚合酶聚合酶 所有真核生物中的聚合酶的性質(zhì)基本上同大腸桿菌中的所有真核生物中的聚合酶的性質(zhì)基本上同大腸桿菌中的聚合酶相似，它的活性有賴于模板，帶聚合酶相似，它的活性有賴于模板，帶3-OH的引物，四種脫的引物，四種脫氧核糖核苷磷酸。氧核糖核苷磷酸。 目前發(fā)現(xiàn)的真核生物目前發(fā)現(xiàn)的真核生物DNA聚合酶有聚合酶有 。 DNA聚合酶聚合酶： 在迅速增殖的細(xì)胞中活力較高。酶分子在迅速增殖的細(xì)胞中活力較高。酶分子量在量

18、在165,000一一175,000U之間。最合適的底物是帶缺口的雙鏈之間。最合適的底物是帶缺口的雙鏈DNA，但是帶引物的變性，但是帶引物的變性DNA也是很好的底物。是真核生物也是很好的底物。是真核生物的復(fù)制酶。的復(fù)制酶。 它同大腸桿菌它同大腸桿菌DNA聚合酶最大不同之處在于聚合酶最大不同之處在于不具外切酶不具外切酶活性活性。 第27頁(yè)/共51頁(yè) DNA聚合酶聚合酶(損傷修復(fù)損傷修復(fù))：為分子量較小為分子量較小(43,000U)的聚合酶。在整個(gè)細(xì)的聚合酶。在整個(gè)細(xì)胞周期中它的活力沒有變化，它利用胞周期中它的活力沒有變化，它利用Dnase I 處理過的天然處理過的天然DNA作模板，作模板，對(duì)對(duì)變性

19、變性DNA幾乎沒有活性，不具外切酶的活性幾乎沒有活性，不具外切酶的活性。 DNA聚合酶聚合酶（線粒體）：（線粒體）：是一個(gè)大分子酶，在細(xì)胞內(nèi)含量很低，因是一個(gè)大分子酶，在細(xì)胞內(nèi)含量很低，因此不容易純化。這個(gè)酶可以使用帶缺口的此不容易純化。這個(gè)酶可以使用帶缺口的DNA作底物，但以多聚作底物，但以多聚(A)、寡聚、寡聚(dT)8-10作為底物，酶活力更高。作為底物，酶活力更高。 DNA聚合酶聚合酶負(fù)責(zé)線粒體負(fù)責(zé)線粒體DNA的復(fù)制。的復(fù)制。 DNA聚合酶聚合酶和和DNA聚合酶聚合酶（主要復(fù)制酶）（主要復(fù)制酶）: 是真核生物的復(fù)制酶，是真核生物的復(fù)制酶，主要根據(jù)是聚合酶主要根據(jù)是聚合酶的活性隨細(xì)胞周期

20、而變化。的活性隨細(xì)胞周期而變化。 DNA聚合酶聚合酶：功能不詳。：功能不詳。第28頁(yè)/共51頁(yè) 2 DNA連接酶連接酶 DNA Ligase DNA連接酶催化一個(gè)連接酶催化一個(gè)DNA鏈的鏈的5磷酸根與另一磷酸根與另一DNA鏈的鏈的3羥基形成磷酸二酯鍵。羥基形成磷酸二酯鍵。 但兩個(gè)鏈都必須與同一另外的鏈互補(bǔ)結(jié)合，而且兩鏈必須但兩個(gè)鏈都必須與同一另外的鏈互補(bǔ)結(jié)合，而且兩鏈必須相鄰，即只能連接一個(gè)切口相鄰，即只能連接一個(gè)切口(nick)而不能連接一個(gè)豁口而不能連接一個(gè)豁口(gap)(丟丟失核苷酸失核苷酸)，如，如圖圖7-15所示。所示。例子：例子：T4誘導(dǎo)的連接酶不僅能誘導(dǎo)的連接酶不僅能在模板上連接

21、在模板上連接DNA和和DNA之間的之間的切口，也能連接切口，也能連接RNA和和RNA之間的切口，不僅能連接之間的切口，不僅能連接DNA中中的單鏈切口或雙鏈的粘性末端，而且能連接平頭雙鏈的單鏈切口或雙鏈的粘性末端，而且能連接平頭雙鏈DNA 。大大腸桿菌連接酶則不行腸桿菌連接酶則不行。 第29頁(yè)/共51頁(yè)第30頁(yè)/共51頁(yè)3 與解鏈有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)與解鏈有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) DNA是雙螺旋，在復(fù)制中雙螺旋要解開，雙螺旋的解是雙螺旋，在復(fù)制中雙螺旋要解開，雙螺旋的解開使得復(fù)制叉前面產(chǎn)生正超螺旋，如果這些應(yīng)力不以某種開使得復(fù)制叉前面產(chǎn)生正超螺旋，如果這些應(yīng)力不以某種方式釋放將妨礙復(fù)制叉前進(jìn)。方式釋放將妨礙

22、復(fù)制叉前進(jìn)。 現(xiàn)在已找到一些酶和蛋白質(zhì)，它們或者能使現(xiàn)在已找到一些酶和蛋白質(zhì)，它們或者能使DNA雙鏈雙鏈變得易于解開，或者可以使超螺旋分子松弛，以下介紹一變得易于解開，或者可以使超螺旋分子松弛，以下介紹一些這類蛋白質(zhì)。些這類蛋白質(zhì)。 第31頁(yè)/共51頁(yè) (1) 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白 (SSB蛋白蛋白) SSB蛋白：蛋白：是缺乏酶活性的復(fù)制輔助蛋白，可以在遠(yuǎn)低是缺乏酶活性的復(fù)制輔助蛋白，可以在遠(yuǎn)低于于Tm的溫度下使雙鏈的溫度下使雙鏈DNA拆開，并牢牢地結(jié)合在單鏈拆開，并牢牢地結(jié)合在單鏈DNA上，穩(wěn)定單鏈區(qū)域的蛋白質(zhì)。上，穩(wěn)定單鏈區(qū)域的蛋白質(zhì)。（ SSB保護(hù)復(fù)制中的保護(hù)復(fù)制中的DNA單鏈部分單

23、鏈部分不被核酸酶降解）不被核酸酶降解） 首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)許多種生物中都有這首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，后來發(fā)現(xiàn)許多種生物中都有這類蛋白質(zhì)。在文獻(xiàn)中，這類蛋白曾用過多種名稱：解旋蛋白類蛋白質(zhì)。在文獻(xiàn)中，這類蛋白曾用過多種名稱：解旋蛋白(unwindingproteill)，熔化蛋白，熔化蛋白(mel2ingprptein)，螺旋降穩(wěn)蛋，螺旋降穩(wěn)蛋白白(helixdestabizingprotein)。 第32頁(yè)/共51頁(yè) (2) 解鏈酶（解鏈酶（DNA解旋酶；解旋酶；DNA helicases） 解鏈酶解鏈酶(解螺旋酶解螺旋酶)：是一類能通過水解是一類能通過水解ATP獲得能量來解開獲得能

24、量來解開雙鏈雙鏈DNA的酶稱為的酶稱為DNA解鏈酶解鏈酶。解鏈酶依賴于單鏈解鏈酶依賴于單鏈DNA 的存在的存在 分解分解ATP獲得能量獲得能量 具具引發(fā)酶的功能引發(fā)酶的功能（合（合成小片段的成小片段的RNA作為后隨鏈的引物作為后隨鏈的引物） 如果雙鏈如果雙鏈DNA中有中有單鏈末端或缺口單鏈末端或缺口，則，則DNA解鏈酶可以首先結(jié)解鏈酶可以首先結(jié)合在這一部分，然后逐步向雙鏈方向移動(dòng)，復(fù)制時(shí)大部分合在這一部分，然后逐步向雙鏈方向移動(dòng)，復(fù)制時(shí)大部分DNA解解鏈酶可以沿著后隨鏈模板的鏈酶可以沿著后隨鏈模板的53方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，只有只有rep蛋白（蛋白（一種大腸桿

25、菌解鏈酶）一種大腸桿菌解鏈酶）是沿前導(dǎo)鏈模板的是沿前導(dǎo)鏈模板的35方方向移動(dòng)。因此在復(fù)制時(shí)向移動(dòng)。因此在復(fù)制時(shí)rep蛋白和某蛋白和某DNA解鏈酶分別在解鏈酶分別在DNA的兩的兩條母鏈上協(xié)同作用以解開雙鏈條母鏈上協(xié)同作用以解開雙鏈DNA（圖圖7-16） 第33頁(yè)/共51頁(yè)第34頁(yè)/共51頁(yè)第35頁(yè)/共51頁(yè) (3) 拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topoisomerase)： 是催化DNA拓?fù)洚悩?gòu)體(Topoisomer)相互轉(zhuǎn)換的一類酶。 拓?fù)洚悩?gòu)酶能與DNA形成共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)-DNA中間體，從而在其骨架的磷酸二酯鍵處造成暫時(shí)性裂口，使DNA的多核苷酸鏈得以穿越，從而改變DNA分子的拓?fù)錉顟B(tài)。 根據(jù)酶作用的機(jī)

26、理及其介導(dǎo)一條鏈還是二條鏈的斷裂，拓?fù)洚悩?gòu)酶可分為型和型。第36頁(yè)/共51頁(yè) 型拓?fù)洚悩?gòu)酶的共同特點(diǎn)是： 僅切斷雙鏈DNA中的一條鏈，即催化瞬時(shí)的單鏈斷裂和連接。 不需要能量輔助因子，如ATP和NAD等，因此不能催化需能的超螺旋化結(jié)構(gòu)。型拓?fù)洚悩?gòu)酶一般都使高度超螺旋的DNA松弛。 型拓?fù)洚悩?gòu)酶的共同特點(diǎn)是： 同時(shí)切斷、縫合DNA的兩條鏈。 需要能量輔助因子，可以作用于任何相交的兩對(duì)雙鏈DNA。第37頁(yè)/共51頁(yè) 大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶I（屬于（屬于型酶型酶） 概述：拓?fù)洚悩?gòu)酶概述：拓?fù)洚悩?gòu)酶 (E. coli)催化負(fù)超螺旋催化負(fù)超螺旋DNA的的松弛松弛。 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶也參

27、與也參與DNA的打結(jié)和解結(jié)。的打結(jié)和解結(jié)。 將兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈將兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈DNA環(huán)耦合為雙鏈環(huán)耦合為雙鏈DNA環(huán)。環(huán)。 完整的全酶是一分子量完整的全酶是一分子量97 kDa的蛋白。的蛋白。第38頁(yè)/共51頁(yè) 大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 的特點(diǎn)是： 僅切斷雙鏈DNA中的單鏈并催化瞬時(shí)的單鏈斷裂和連接。 由于反應(yīng)的產(chǎn)物還是閉環(huán)DNA，因此，酶反應(yīng)機(jī)制是先切開雙鏈DNA中的一條鏈，使切開鏈的末端沿螺旋的方向轉(zhuǎn)動(dòng)，然后把切口封起來，達(dá)到松旋的目的。 不需要能量輔助因子。如：ATP NAD (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸) ，最初從大腸桿菌中分離到一種叫蛋白，后來定名為大腸桿菌拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 。第39頁(yè)/共51頁(yè)

28、StructureoftheTopoI/contactwithDNA第40頁(yè)/共51頁(yè) 后來發(fā)現(xiàn)這種酶廣泛存在于各種生物中，不同學(xué)者曾給后來發(fā)現(xiàn)這種酶廣泛存在于各種生物中，不同學(xué)者曾給予各種命名：予各種命名：轉(zhuǎn)軸酶轉(zhuǎn)軸酶(swivelase)，松旋酶松旋酶(untwisting enzyme)，DNA松弛酶松弛酶(DNA relaxing enzyme)，切割封口酶切割封口酶(nickingclosing enzyme)。 Topo I 酶松弛超螺旋酶松弛超螺旋DNA時(shí)不需要時(shí)不需要ATP，它可以催化三，它可以催化三種拓?fù)滢D(zhuǎn)換反應(yīng)種拓?fù)滢D(zhuǎn)換反應(yīng)(圖圖7-17)。第41頁(yè)/共51頁(yè)拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 I (E. coli)催化負(fù)超螺旋催化負(fù)超螺旋DNA的的松弛。松弛。拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 I也參與也參與DNA的打結(jié)和解結(jié)。的打結(jié)和解結(jié)。 將兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈將兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈DNA環(huán)耦合為雙鏈環(huán)耦合為雙鏈DNA環(huán)。環(huán)。第42頁(yè)/共51頁(yè)TopoIReactions僅切斷雙鏈DNA的一條鏈，即催化瞬時(shí)的單鏈斷裂和連接，不需要能量輔助因子如ATP和NAD等第43頁(yè)/共51頁(yè)TopoI作用機(jī)制23圖圖2-21 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用機(jī)制的作用機(jī)制第44