流式細(xì)胞術(shù)臨床應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用一、在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用 這是 FCM 在臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最早的一個(gè)領(lǐng)域。 首先需要把實(shí)體瘤組織解聚、 分散制備成單細(xì)胞 懸液，用熒光染料(碘化吡啶PI)染色后對(duì)細(xì)胞的 DNA 含量進(jìn)行分析， PI 可以與細(xì)胞內(nèi) DNA 和 RNA 結(jié)合，采用 RNA 抑制劑將 RNA 消化后， 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的與 DNA 結(jié)合的 PI 的熒 光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi) DNA 含量的多少。由 于細(xì)胞周期各時(shí)相的 DNA 含量不同，通常正常 細(xì)胞的 G1 / GO 期具有二倍體細(xì)胞的 DNA 含量 (2 N) ，而 G2/ M 期具有四倍體細(xì)胞的 DNA 含 量(4 N)，而S期的DNA含量介

2、于二倍體和四 倍體之間。因此，通過流式細(xì)胞術(shù) PI 染色法對(duì) 細(xì)胞內(nèi) DNA 含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以將細(xì)胞周期 各時(shí)相區(qū)分為G1 / GO期，S期和G2/ M期， 并可通過特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率， DNA 含量直接代表細(xì)胞的倍體狀態(tài)， 非倍體細(xì)胞與腫 瘤惡性程度有關(guān)。1 、發(fā)現(xiàn)癌前病變，協(xié)助腫瘤早期診斷 人體正常組織發(fā)生癌變要經(jīng)過一個(gè)由量變到質(zhì) 變的漫長(zhǎng)過程， 而癌前細(xì)胞即處于量變過程中向 癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化階段。 人體正常的體細(xì)胞均具有比較 穩(wěn)定的 DNA 二倍體含量。當(dāng)人體發(fā)生癌變或具 有惡性潛能的癌前病變時(shí)， 在其發(fā)生、 發(fā)展過程 中可伴隨細(xì)胞 DNA 含量的異常改變， FCM 可精 確定量

3、DNA 含量的改變，作為診斷癌前病變發(fā) 展至癌變中的一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)志， 能對(duì)癌前病變 的性質(zhì)及發(fā)展趨勢(shì)作出估價(jià)， 有助于癌變的早期 診斷。有資料證實(shí)， 癌前病變的癌變發(fā)生率與細(xì) 胞不典型增生程度有密切關(guān)系，增生程度越重， 癌變發(fā)生率越高。 隨著細(xì)胞不典型增生程度的加 重， DNA 非整倍體出現(xiàn)率增高，這是癌變的一 個(gè)重要標(biāo)志。 2、在腫瘤的診斷、預(yù)后判斷和治療中的作用 FCM 在腫瘤診斷中的重要作用已經(jīng)被認(rèn)可， DNA 非整倍體細(xì)胞峰的存在可為腫瘤診斷提供 有力的依據(jù)， FCM 分析病理細(xì)胞具有速度快、 信息量大， 敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，已被用在常規(guī)工作 中。腫瘤細(xì)胞 DNA 倍體分析對(duì)病人預(yù)后的判

4、斷 有重要作用，異倍體腫瘤惡性病變的復(fù)發(fā)率高、 轉(zhuǎn)移率高、 死亡率也高， 而二倍體及近二倍體腫 瘤的預(yù)后則較好。 FCM 不僅可對(duì)惡性腫瘤 DNA 含量進(jìn)行分析，還可根據(jù)化療過程中腫瘤 DNA 分布直方圖的變化去評(píng)估療效， 了解細(xì)胞動(dòng)力學(xué) 變化，對(duì)腫瘤化療具有重要的意義。臨床醫(yī)師可 以根據(jù)細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況， 依據(jù)化療藥 物對(duì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的干擾理論， 設(shè)計(jì)最佳的治療方 案，從 DNA 直方圖直接地看到瘤細(xì)胞的殺傷變 化，及時(shí)選用有效的藥物， 對(duì)瘤細(xì)胞達(dá)到最大的 殺傷效果。3、FCM 在細(xì)胞凋亡和多藥耐藥基因的研究中的 作用研究如何用藥物誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。 通過對(duì)細(xì)胞體 積、光散射、 DNA

5、含量及特異性抗原基因 （如 bcl-2, Fas 等）測(cè)定分析出細(xì)胞凋亡情況。 如可用 Ann exin V 結(jié)合PI或7- AAD雙染色法進(jìn)行細(xì) 胞凋亡分析。 在凋亡的早期階段，胞漿膜磷脂的 不對(duì)稱性喪失，導(dǎo)致膜內(nèi)側(cè)磷脂酞絲氨酸（PS）從 細(xì)胞膜內(nèi)層暴露于外層，從而可被 PS 特異的 Annexin- V 探針?biāo)鶚?biāo)記。 PS 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不 是細(xì)胞凋亡特有的， 也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。但 在凋亡的早期細(xì)胞膜是完整的， 而細(xì)胞壞死時(shí)細(xì) 胞 膜 的 完 整 性 被 破 壞 。 由 于 碘 化 丙 錠 (PI) 或 7-AAD 對(duì)細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞 是拒染的，而對(duì)膜完整性被破壞的晚期

6、凋亡細(xì)胞 或壞死細(xì)胞可以染色。因此， Annexin- V 結(jié)合 PI 或 7-AAD 進(jìn)行雙染色可以用于檢測(cè)活細(xì)胞、 凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。正?；罴?xì)胞不會(huì)被染色， 凋亡細(xì)胞可被標(biāo)記上 Annexin-V ，壞死和凋亡晚 期細(xì)胞可被 Annexirr V 和 PI 或 7- AAD 同時(shí)染 色。多藥耐藥是腫瘤病人化療失敗的主要原因， FCM 對(duì)多藥耐藥基因 (MDR-1 、P170 等)和凋亡 抑制基因及凋亡活化基因表達(dá)的測(cè)定， 可為臨床治療效果分析提供有力依據(jù)二、在臨床細(xì)胞免疫中的作用FCM 提供了一種簡(jiǎn)捷地監(jiān)測(cè)細(xì)胞亞群的方法。 即通過熒光抗原和抗體檢測(cè)技術(shù)對(duì)淋巴細(xì)胞膜 表面分化抗原 （CD

7、分子 ）、細(xì)胞分類和各亞群進(jìn) 行分析，并計(jì)算出淋巴細(xì)胞各亞群的百分比，從 而對(duì)人體細(xì)胞免疫狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。 在某些病毒性 疾病的感染血液病、原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷 病、腫瘤的療效觀察和預(yù)后判斷以及器官移植的 監(jiān)測(cè)上起著重要的指導(dǎo)作用。 如正常人群淋巴細(xì)胞 CD3+CD4+/CD3+CD8+ 比值大約為2 : 1，但在人體細(xì)胞免疫力低下時(shí) 可出現(xiàn)比例倒置。用 FCM 還可以監(jiān)測(cè)腎移植后 病 人 的 腎 排 斥 反 應(yīng) ， 如 果 CD3+CD4+/CD3+CD8+ 比例倒置，病人預(yù)后 良好，較少發(fā)生腎排異現(xiàn)象；反之排異危險(xiǎn)性增 加。同樣此種測(cè)定技術(shù)也用于愛滋病的診斷和治 療中。白細(xì)胞表面分化抗原的

8、檢測(cè)：CD3+ ： T 淋巴細(xì)胞； CD45RA ：未受刺激 （ Naive ）T 淋巴細(xì)胞； CD45RO ：記憶 T 淋巴 細(xì)胞CD3-CD19+ ： B 淋巴細(xì)胞CD3-CD16+56+ ： NK 細(xì)胞【 NK 細(xì)胞表達(dá)眾多表面分子，如CD56 、CD16 、 CD57 、CD161 等，但這些表面標(biāo)志都 不是 NK 細(xì)胞所特有的，只具有相對(duì)特異性。通 常將 CD56+ 、 CD16+ 、CD3- 、 TCR- 、 BCR- 的 淋 巴 樣 細(xì) 胞 認(rèn) 為 是 NK 細(xì) 胞 。 以CD56+CD16+CD56+CD16-CD56-CD16+ 為標(biāo)志將 NK 細(xì)胞分為 3 個(gè)亞群， 發(fā)現(xiàn)

9、CD56 是 NK 細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志，而 CD16 的表達(dá)量與 NK 細(xì)胞的殺傷活性密切相 關(guān)。在上述研究基礎(chǔ)上許多學(xué)者主張以 CD56 的 表達(dá)密度不同， 將 NK 細(xì)胞分為 CD56bright 和 CD56dim 兩群 . CD56brightNK 細(xì)胞高表達(dá) CD56, 低 表 達(dá) CD16, KIR(killer cell immunoglobulin-like receptors, KIR) ；表達(dá)高 親和力的 IL-2 受體。而 CD56dim NK 細(xì)胞高 表達(dá) CD16 ，低表達(dá) CD56 ，僅表達(dá)中親和力的 IL-2 受體。 CD56bright NK 細(xì)胞在 IL-2

10、 的作 用下表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖作用，而 CD56dim NK 細(xì)胞幾乎不分泌細(xì)胞因子，且 IL-2 不能促其增 殖。CD56dim NK細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺傷活性，而 CD56bright NK 細(xì)胞殺傷活性較低且表達(dá)一 些末成熟標(biāo)志，可以認(rèn)為 CD56bright NK 細(xì)胞 是未成熟的 NK 細(xì)胞，而 CD56dim 及 NK 細(xì)胞 則 相對(duì) 較成 熟 ， 即 NK 細(xì) 胞發(fā)育 可能 經(jīng) 歷 CD56bright NK 細(xì)胞到 CD56dim NK 細(xì)胞這樣 一個(gè)過程?！緾D64 ： 單核、巨噬細(xì)胞CD1a 、CD83 ： 樹突狀細(xì)胞CD3+CD4+CD8- ：T 輔助/ 誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞標(biāo)記 （

11、Th/Ti ）；CD3+CD4+CD29+ ：T 輔助 淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)亞群標(biāo)記， 輔助 B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗 體和誘導(dǎo)細(xì) 胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞溶解作用； CD3+CD4+CD45RA+ ：T 抑制淋巴細(xì) 胞誘導(dǎo)亞群，誘導(dǎo) Th 的活化和輔助其功能。 T輔助細(xì)胞還可分成 Th1 、Th2 兩個(gè)亞群， 同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN- 丫和IL-4 ,可區(qū)分Th1細(xì)胞(CD4+/IFN- 丫 + )和Th2 細(xì)胞(CD4+/ IL-4+)。CD3+CD4-CD8+ ：T 抑制/殺傷淋巴細(xì)胞標(biāo)記( Ts/Tc)；CD3+CD8+CD28- ：抑制性 T 淋巴 細(xì)胞；CD3+CD8+CD28+:細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞

12、；CD3/HLA-DR ：同時(shí)計(jì)數(shù)外周血靜止 T 淋巴細(xì) 胞 ( CD3+HLA-DR- )、 B 淋 巴 細(xì) 胞( CD3-HLA-DR- ) 及 活 化 T 淋 巴 細(xì) 胞(CD3+HLA-DR+ ); CD25 :白細(xì)胞介素 2 低親和力受體，其中 CD3+CD25+ 為活化 T 淋巴 細(xì)胞，CD3+CD25-為靜止T淋巴細(xì)胞；CD34 、CD38 、CD117 、HLA-DR ： 造血干、 祖細(xì)胞CD59 ： PNH 疾病監(jiān)測(cè)；CD23 ： IgE 低親合力受體，變態(tài)反應(yīng)病、自身 免疫、白血病和腎病綜合癥等病人 PBL 中 CD23 表達(dá)顯著增加，陽性率與疾病嚴(yán)重程度正相關(guān)； CD44

13、 ： 腫瘤患者 CD44 粘附分子與惡性度相 關(guān)；目前 FCM 用的各種單克隆抗體試劑已經(jīng)發(fā)展到 了百余種，可以對(duì)各種血細(xì)胞和組織細(xì)胞的表型 進(jìn)行測(cè)定分析。三、在血液病診斷和治療中的應(yīng)用FCM 通過對(duì)外周血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞表面抗原和DNA 的檢測(cè)分析，對(duì)各種血液病的診斷、預(yù)后 判斷和治療起著舉足輕重的作用。1、白血病的診斷和治療 形態(tài)學(xué)分型是白血病分型的基礎(chǔ)， 而白血病免疫 分型則是形態(tài)學(xué)分型的重要補(bǔ)充和進(jìn)一步深化。 形態(tài)學(xué)分型是基于細(xì)胞水平的觀察， 屬于直觀判 斷，其準(zhǔn)確度與檢測(cè)者的水平及主觀因素有關(guān)。 由于白血病細(xì)胞的異質(zhì)性及分化程度不同， 使細(xì) 胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)不典型， 細(xì)胞發(fā)育幼稚， 再加上

14、混 合細(xì)胞性白血病等，大約有 20%30%病例難 以明確診斷和分型。而應(yīng)用 FCM 白血病免疫表 型分析能夠客觀地、 快速地分析異常細(xì)胞系來源 及其分化階段， 大大地提高了白血病分型的準(zhǔn)確 性。 常用的檢測(cè)和鑒別白血病各系列的特異性標(biāo)志 為： T淋巴細(xì)胞白血?。喊麧{抗原 CD3、抗T細(xì) 胞受體 (TCR) 抗TCR 丫 3 CD2、CD5、CD8、 CD10 和 CD7B淋巴細(xì)胞白血病：cCD79a、CD22、CD19、CD10、和 CD20 +髓系白血?。嚎顾栊赃^氧化物酶(cMPO)、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15 和 CD64NK淋巴細(xì)胞白血病： CD16、CD56和C

15、D57 紅白血?。?血型糖蛋白A( Gly A)和CD36 巨核細(xì)胞白血?。篊D41、 CD42和CD61 ;其中，cCD79a最具特異性，cMPO是髓系特異標(biāo) 志，cCD3和cCD79a分別表達(dá)于早期T細(xì)胞和 B細(xì)胞。另外，常用的白血病系列非特異標(biāo)志為： CD34 和主要組織相容性抗原 DR(HLA-DR )。，利用FCM 可以測(cè)定出血細(xì)胞表達(dá)各種抗原的水平， 協(xié)助臨床確診。同其它腫瘤的治療一樣，測(cè)定 DNA 倍體和 進(jìn)行細(xì)胞周期分析對(duì)指導(dǎo)白血病化療有一定作 用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白 血病細(xì)胞增殖狀況不同， 定期了解細(xì)胞增殖情況 采取相應(yīng)藥物可以提高療效。目前臨床除化療藥物

16、治療外還采用造血干 細(xì)胞移植技術(shù)治療急性白血病和一些疑難性疾 病。FCM通過對(duì)人白細(xì)胞抗原（HLA）配型的測(cè)定 可以為異體干細(xì)胞移植病人選擇出最合適的供 體。造血干細(xì)胞移植技術(shù)主要包括干細(xì)胞的鑒 別、活性測(cè)定、干細(xì)胞動(dòng)員和采集、分離純化、 保存擴(kuò)增、 腫瘤細(xì)胞的凈化、干細(xì)胞回輸以及術(shù) 后保持移植物抗宿主病的低發(fā)生率等一系列過程。FCM 測(cè)定 CD34、HLA-DR、CD33 等細(xì)胞 表面標(biāo)志物，成為干細(xì)胞移植技術(shù)重要的監(jiān)測(cè)手 段。用 FCM 檢測(cè)一系列指標(biāo)觀察病人的恢復(fù)狀 態(tài)，可以對(duì)預(yù)后做出早期的判斷。2、其它種類血液病的診斷和治療監(jiān)測(cè) 陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥是一種造血干細(xì)胞 克隆病，細(xì)胞

17、CD55 、 CD59 抗原表達(dá)減低是該 病的一個(gè)特點(diǎn)。 該抗原屬于血細(xì)胞表面磷脂酰肌 醇錨連蛋白家族， 是重要的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，它通 過與補(bǔ)體 C8、 C9 的結(jié)合以阻止補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合 物的形成， 從而抑制細(xì)胞被補(bǔ)體激活溶解。 FCM 采用熒光標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)血細(xì)胞 CD59 的 表達(dá)做定量分析， 可以協(xié)助臨床做出診斷并判斷 疾病的嚴(yán)重程度。3、網(wǎng)織紅細(xì)胞的測(cè)定及臨床應(yīng)用網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)是反映骨髓造血功能的重要指 標(biāo)，F(xiàn)CM通過某些熒光染料(吖啶橙、噻唑橙等) 與紅細(xì)胞中 RNA 結(jié)合，定量測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞中 RNA ，得到網(wǎng)織紅細(xì)胞占成熟紅細(xì)胞的百分比。 此外 FCM 還可以測(cè)量出網(wǎng)織紅細(xì)胞的

18、成熟度， 對(duì)紅細(xì)胞增殖能力的判斷很有意義。 為干細(xì)胞移 植術(shù)后恢復(fù)的判斷、 貧血的治療監(jiān)測(cè)、 腫瘤病人 放化療對(duì)骨髓的抑制狀況等提供了依據(jù)。4、在血栓與出血性疾病中的應(yīng)用 (1)血小板功能的測(cè)定：正常情況下血小板以分散 狀態(tài)在血管內(nèi)運(yùn)行， 但當(dāng)血管損傷、血流改變或 受到化學(xué)物質(zhì)刺激時(shí)血小板被活化而發(fā)生一系 列改變。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖 蛋白表達(dá)水平的高低來判斷， 血小板活化時(shí)其質(zhì) 膜糖蛋白較其靜止期發(fā)生顯著改變， FCM 可以 通過單抗免疫熒光標(biāo)記(血小板膜糖蛋白H b/皿 a,CD62 ，CD63 等)監(jiān)測(cè)血小板功能及活化情況， 有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療。 外血小板 活

19、化時(shí)其細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)生很大變化， 借 助于鈣離子敏感熒光探針的幫助，用 FCM 測(cè)定 鈣離子濃度， 可以作為活化血小板監(jiān)測(cè)的非免疫 性指標(biāo)。(2) 血小板相關(guān)抗體的測(cè)定： 免疫性血小板減少性 紫癜病人血漿中可產(chǎn)生血小板自身抗體， 結(jié)合在 血小板表面， 稱為血小板相關(guān)抗體，其分子可以 是 IgG 、IgA 或 IgM ，用羊抗人 IgG 、IgA 、IgM 熒光抗體標(biāo)記被測(cè)血小板， FCM 可以測(cè)定血小 板相關(guān)抗體含量。 直接法檢測(cè)血小板表面的相關(guān) 抗體， 間接法可測(cè)定血清中的相關(guān)抗體。 該方法 用于該病的診斷及治療監(jiān)測(cè)，具有檢測(cè)速度快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)四、其他臨床應(yīng)用FCM 在自身抗體 (

20、HLA- B27) 檢測(cè)中的應(yīng)用 HLA 抗原是人類主要組織相容性復(fù)合體的表達(dá) 產(chǎn)物，在免疫系統(tǒng)中主要負(fù)責(zé)細(xì)胞之間的相互識(shí) 別和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、 調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能。根據(jù) HLA 抗原結(jié)構(gòu)、功能與組織分布的不同，可分 為三類;I、II、皿類分子。HLA-B27基因?qū)儆?I類MHC基因，在淋巴細(xì)胞的表面有豐富的含 量。早在二十多年前，有人發(fā)現(xiàn) HLA - B27 抗 原的表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎有高度相關(guān)性。超過 90% 的強(qiáng)直性脊椎炎患者其 HLLA -B27 抗原表 達(dá)陽性，普通人群中僅5%10%為陽性，而強(qiáng) 直性脊椎炎由于其癥狀與許多疾病相似而難以 確診，因此， HLA- B27 的檢測(cè)在病情的診斷中 有著重要意