SHMT基因工程菌的構(gòu)建方案

1、SHMT 基因工程菌的構(gòu)建第四組一、實(shí)驗(yàn)相關(guān)知識(shí)1、絲氨酸 羥甲基轉(zhuǎn)移酶是絲氨酸合成中的關(guān)鍵酶，能催化甘氨酸和絲氨酸的相互轉(zhuǎn)化，具體的催化反應(yīng)如下：SHMT甘氨酸 +N5,N10- 亞甲基四氫葉酸L-絲氨酸 +四氫葉酸在絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT）作用下，甘氨酸同亞甲基四氫葉酸反應(yīng)生成L-絲氨酸。該反應(yīng)需要5-磷酸吡哆醛作為輔酶。N5,N10-亞甲基四氫葉酸上亞甲基可以來(lái)自于甘氨酸、甲醛、甲酸、蛋氨酸、膽堿和肌氨酸，它們同四氫葉酸反應(yīng)生成N5,N10- 亞甲基四氫葉酸。本實(shí)驗(yàn)以甘氨酸和甲醇為前體物發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸時(shí)，菌體積累L-絲氨酸與菌體含有的SHMT 的活性直接相關(guān)，但由于 SHMT

2、的催化作用理論上是雙向的， 有必要了解在相同的培養(yǎng)條件或者在本文所用的菌株 SHMT 是否具有雙向催化作用。2、基因工程（genetic engineering ）又稱基因拼接技術(shù)和 DNA 重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)， 以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代法為手段，將不同來(lái)源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖， 在體外構(gòu)建雜種 DNA 分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。 基因工程技術(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段?；蚬こ淌巧锕こ痰囊粋€(gè)重要分支，它和細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程和微生物工程共同組成了生物工程。 所謂基因工程是在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行操作的復(fù)

3、雜技術(shù)。 它是用人為的法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì) DNA 大分子提取出來(lái)，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的 DNA 分子連接起來(lái)，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長(zhǎng)、 繁殖的受體細(xì)胞中， 以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶” ，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙。3、絲氨酸 是一種非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新代及肌肉的生長(zhǎng)中發(fā)揮著作用， 因?yàn)樗兄诿庖哐蛩睾涂贵w的產(chǎn)生， 維持健康的免疫系統(tǒng)也需要絲氨酸。 絲氨酸在細(xì)胞膜的制造加工、 肌肉組織和包圍神經(jīng)細(xì)胞的鞘的合成中都發(fā)揮著作用。 大腸桿菌 細(xì)菌染色體DNA 的制備 （

4、預(yù)習(xí)案）一實(shí)訓(xùn)目的.學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌基因組的基本知識(shí)和提取法二實(shí)訓(xùn)原理及相關(guān)知識(shí)1. 大腸桿菌（ Escherichiacoli ，E.coli ） 革蘭氏陰性短桿菌，大小 0.5 ×13 微米。身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢。能發(fā)酵多種糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進(jìn)入腸道，與人終身相伴，幾占糞便干重的1/3 。規(guī)定，每升飲用水腸桿菌數(shù)不應(yīng)超過(guò)3 個(gè)大腸桿菌的抗原成分復(fù)雜，可分為菌體抗原 （O ）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗機(jī)體吞噬和抗補(bǔ)體的能力。2. 大腸桿菌常引起流行性嬰兒腹泄和成人肋膜炎等等。 侵入人體一些部位時(shí)，可引起感染，如腹膜炎、膽

5、囊炎、膀胱炎及腹瀉等。人在感染大腸桿菌后的癥狀為胃痛、嘔吐、腹瀉和發(fā)熱。感染可能是致命性的，尤其是對(duì)孩子及老人。3. 大腸桿菌是細(xì)菌，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細(xì)胞壁，只含有核糖體簡(jiǎn)單的細(xì)胞器，沒有細(xì)胞核有擬核；細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)粒常用作基因工程中的運(yùn)載體。 大腸桿菌的代類型是異養(yǎng)兼性厭氧型。4. 大腸桿菌在生物技術(shù)中的應(yīng)用：大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應(yīng)用最廣泛，最成功的表達(dá)體系，常做高效表達(dá)的首選體系。5. 核酸：核酸DNARNA名稱脫氧核糖核酸核糖核酸結(jié)構(gòu)規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)通常呈單鏈結(jié)構(gòu)基本

6、單位脫氧核糖核苷酸核糖核苷酸五碳糖脫氧核糖核糖含氮堿基A、G、C、TA、G、C、U分布主要存在于細(xì)胞核， 少主要存在于細(xì)胞質(zhì)量存在于線粒體和葉綠體攜帶遺傳信息，在生物體的遺傳、變異和蛋白主要功能質(zhì)的生物合成中具有極其重要的作用6.作為遺傳物質(zhì)：只在 RNA 病毒中；不作為遺傳物質(zhì)：在 DNA 控制蛋白質(zhì)合成過(guò)程中起作用。 mRNA 是蛋白質(zhì)是合成的直接模板、 tRNA 能攜帶特定氨基酸、rRNA 是核糖體的組成成分；催化作用：酶的一種7. 基因組是指細(xì)胞或生物體中，一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和，或原核生物染色體、質(zhì)粒、真核生物的單倍染色體組、細(xì)胞器、病毒中所含有的一整套基因。8. 實(shí)訓(xùn)原理

7、提取 DNA 的一般過(guò)程是將分散好的組織細(xì)胞在含十二烷基硫酸鈉（SDS）和蛋白酶 K 的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿 / 異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)， 得到的 DNA 溶液經(jīng)乙醇沉淀使 DNA 從溶液中析出。 SDS 的作用機(jī)理是由于其能結(jié)合蛋白，中和蛋白的電性，使蛋白質(zhì)的非共價(jià)鍵受到破壞，失去二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而變形失活，蛋白酶 K 的重要特性是能在 SDS 和 EDTA（乙二胺四乙酸二鈉） 存在的情況下保持很高的活性。在勻漿后提取 DNA 的反應(yīng)體系中， SDS 可通過(guò)失活蛋白破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與 DNA 分離；而蛋白酶 K 可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分離出

8、來(lái)。 CTAB( 十六烷基三乙基溴化銨 )是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7 mol/LNaCl ）是可溶的，當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時(shí)，從溶液中沉淀， 通過(guò)離心就可將CTAB-核酸的復(fù)合物與蛋白，多糖類物質(zhì)分開。最后通過(guò)乙醇或異丙醇沉淀DNA ，而CTAB 溶于乙醇或異丙醇而除去。三實(shí)訓(xùn)試劑LB 液體培養(yǎng)基， LB 固體培養(yǎng)基， TE溶液，10%SDS，蛋白酶 K，5mol/LNaCl ， CTAB/NaCl溶液，酚 / 氯仿 / 異戊醇，異丙醇，70%乙醇四儀器設(shè)備超凈臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式高速冷

9、凍離心機(jī)、恒溫水浴鍋、循環(huán)水真空泵、電子天平、冰箱、精密pH 試紙、微量移液器、離心管、試劑平、tip 頭、吸水紙、標(biāo)簽紙、記號(hào)筆等。五實(shí)訓(xùn)步驟1. 菌種培養(yǎng)固體培養(yǎng)基：從活化的大腸桿菌斜面上挑取少量菌種，接種到一只新鮮的 LB 固體平板上，倒置在恒溫培養(yǎng)箱中， 37 度培養(yǎng)1618h 。液體培養(yǎng)基：從活化的大腸桿菌斜面上挑取少量菌種，接種到一只裝有 5ml LB 液體培養(yǎng)基的 250ml 三角瓶中，置于恒溫?fù)u床中， 37 度振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2. 試劑的配置（ 1 ）、 LB 液體培養(yǎng)基：蛋白胨1.0g，酵母膏0.5g，NaCl1.0g，加蒸餾水使之充分溶解，滴加5mol/LNaOH調(diào) pH 至

10、 7.0 ，補(bǔ)足水分至 100ml ，121 度高壓蒸汽滅菌 20min ，冷卻待用。（ 2 ）、 LB 固體培養(yǎng)基：蛋白胨1.0g ，酵母膏0.5g ，NaCl1.0g ，加蒸餾水使之充分溶解，再加瓊脂粉1.5g ，加熱融化，補(bǔ)足水分至100ml ，調(diào) pH 至 7.0 ，121 度高壓蒸汽滅菌 20min ，冷卻待用。（ 3 ） TE 溶液：實(shí)驗(yàn)室所用的TE 緩沖液是終濃度分別為10mmol/LTris-HCl(pH8.0) 和 1mmol/LEDTA(Ph8.0) 的混合液。（4）10%SDS：稱取 10.0g SDS 慢慢轉(zhuǎn)移到約含 80ml 水的燒杯中，用磁力攪拌器或加熱至 68 度

11、助溶，攪拌至完全溶解，用水定容至 100ml 。（5）蛋白酶 K：將 200mg 蛋白酶 K 加入到 8.0ml 無(wú)菌雙蒸水中，輕輕搖動(dòng)，直至蛋白酶 K 完全溶解。不要漩渦混合，加水定容到 10ml ，不需滅菌分裝成小分，儲(chǔ)存于 -20 度。（6）5mol/L NaCl ：在 80ml 蒸餾水中溶解 29.22g NaCl ，加水定容至 100ml ，分裝后高壓滅菌。（7）CTAB/NaCl 溶液：稱取 4.1g NaCl 溶解于 80ml 蒸餾水中，緩慢加入 10g CTAB ，可加熱至 65 度溶解，定容至 100mL 。（8）酚 / 氯仿 / 異戊醇（ 25：24：1）：按 1：1 的比

12、例混合用Tris飽和的酚與氯仿 / 異戊醇（ 24 ：1）。（9）其他試劑：異丙醇， 70%乙醇等。3. 制備細(xì)菌基因組（1）菌體收集：將2mL 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的大腸桿菌DH5菌液 5000rpm 冷凍離心 10min 棄上清；（2 ）加 190 L TE 懸浮沉淀，并加 10 L 10%SDS， 1 L 20mg/mL 蛋白酶 K，混勻， 37保溫 1h ；（3）加 30L 5mol/L NaCl，混勻；（4）加 30L CTAB/NaCl溶液，混勻， 65保溫 20min ；（5）加入 300 L 酚/ 氯仿 / 異戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm離心 10min ，將上清液移至干凈離心管；（6）加入 300 L 氯仿 / 異戊醇（ 24：1）抽提，取上清液移至干凈管中；（7）加 300L 異丙醇，顛倒混合，室溫下靜止10min ，沉淀DNA；（8）5000rpm離心 10min ，沉淀 DNA ，加入 500 L70%乙醇， 5000rpm 離心 10min ，棄乙醇，吸干；（9）溶解于 20 LTE，取 3L 用于瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，其余-20保存。六、實(shí)訓(xùn)注意事項(xiàng)1.稱量時(shí)防試劑混雜，一把牛角匙用于一種試劑（或稱取一種試劑后，洗凈、擦干，再稱取另一種試劑。）瓶蓋不要蓋錯(cuò)，及時(shí)貼上標(biāo)簽。2. 酚腐蝕性很強(qiáng)