RNA干擾技術(shù)的原理與應(yīng)用

1、RNA 干擾技術(shù)的原理與應(yīng)用RNA 干擾 ( RNAinterference , RNAi )是通過(guò)小干擾 RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的 mRNA 特異性降解 , 從而使基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種現(xiàn)象。這一現(xiàn)象廣泛存在于自然界 , 是生物體進(jìn)化過(guò)程中抵御外來(lái)基因侵害的一種機(jī)制 , 為穩(wěn)定基因組發(fā)揮了重要作用。由于 RNAi 可以作為一種簡(jiǎn)單、 有效的代替基因剔除的遺傳工具,正在功能基因組學(xué)領(lǐng)域掀起一場(chǎng)真正的革命 , 并將加快這個(gè)領(lǐng)域的研究步伐。1 RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展1995 年, Guo 等用反義RNA 阻斷秀麗新小桿線蟲(chóng)的part 1基

2、因的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) , 正義和反義RNA 都阻斷了該基因的表達(dá),這與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA 技術(shù)的解釋相反。 1998 年 2 月卡耐基研究院的F i re等將雙鏈RNA (RNA, ds RNA) 轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi) ,發(fā)現(xiàn)靶基因的mRNA 發(fā)生了降解 ,證實(shí)高度純化的ds RNA 可以高效特異的阻斷相應(yīng)的基因表達(dá),而且效率比單鏈RNA 至少高2 個(gè)數(shù)量級(jí) ,首次揭示了Guo 等遇到的現(xiàn)象 ,即為 RNAi 。隨后研究發(fā)現(xiàn) , RNAi 現(xiàn)象廣泛存在于各種生物中,是一種古老的重要保護(hù)機(jī)制 , RNAi技術(shù)作為一種重要的研究手段大大加速了基因組學(xué)的研究進(jìn)程 ,現(xiàn)已成為基因功能研究和基因治療研究的熱點(diǎn)。在短短幾

3、年中 ,對(duì) RNAi 的研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展, 許多令人振奮的報(bào)道相繼出現(xiàn) , 2001年首次報(bào)道了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中成功1應(yīng)用 RNAi 技術(shù)抑制基因表達(dá) , 開(kāi)創(chuàng)了 RNAi 技術(shù)應(yīng)用于高等生物基因功能研究的先河 ; 2002 年, K ay 研究小組首次報(bào)道了應(yīng)用 RNAi 技術(shù)在哺乳動(dòng)物整體水平進(jìn)行基因表達(dá)沉默的實(shí)驗(yàn)研究 ;2004 年哺乳動(dòng)物全基因組范圍 RNAi 研究也取得了重要進(jìn)展 ,先后報(bào)道了用酶法構(gòu)建全基因組 siRNA 文庫(kù)新技術(shù)和應(yīng)用基因組 siRNA 文庫(kù) ,從全基因組水平對(duì)高等動(dòng)物基因功能進(jìn)行高通量 RNAi 研究。這些研究成果愈來(lái)愈表明 , 生物體基因轉(zhuǎn)化的最

4、終產(chǎn)物不僅僅是蛋白質(zhì),還包括相當(dāng)一部分RNA 。2 RNAi的作用機(jī)制細(xì)胞中 ds RNA 的存在是 RNAi 形成的先決條件。 ds RNA 可以通過(guò)多種途徑在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生。 通過(guò)對(duì) RNAi 所進(jìn)行的遺傳學(xué)和生物化學(xué)的研究 ,現(xiàn)已初步闡明了其作用機(jī)制。 RNAi 的作用機(jī)制可分為三個(gè)階段 :起始階段、 效應(yīng)階段和級(jí)聯(lián)放大階段。 起始階段 :由 RNA 病毒入侵 ,轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄 ,基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄等所產(chǎn)生的 ds RNA 分子在細(xì)胞內(nèi)被一雙鏈 RNA 酶!型內(nèi)切酶也叫 Dicer 酶或 Dicer 核酸酶同源物剪成 21 23 nt siRNA , 3 端帶有 2 個(gè)堿基突出的

5、黏性末端 , 5為磷酸基團(tuán) ,此結(jié)構(gòu)對(duì)于 siRNA 行使其功能非常關(guān)鍵。剪切位點(diǎn)一般在 U 處, 具特異性。效應(yīng)階段 : RNAi 特異性的核酸外切酶、 核酸內(nèi)切酶、 解旋酶、 輔助識(shí)別同源序列蛋白和其他一些 蛋 白 與 siRNA 結(jié) 合 成 RNA 誘 導(dǎo) 沉 默 復(fù) 合 體 R I SC ( RNAinducing silence complex , R I SC) 識(shí)別靶 mRNA, 其中的反義2鏈與靶 mRNA 互補(bǔ)結(jié)合 ,正義鏈則被置換出來(lái)。繼而 , R I SC 復(fù)合物中的 RNase(可能是 Dicer)在靶 mRNA 與 siRNA 結(jié)合區(qū)域的中間將其切斷。級(jí)聯(lián)放大 : 在

6、 RNA 依賴性 RNA 聚合酶的作用下 ,以 mRNA 為模板 , siRNA 為引物 ,擴(kuò)增產(chǎn)生足夠數(shù)量的 dsRNA 作為底物提供給Dicer 酶 ,產(chǎn)生更多的siRNA, 從而使效應(yīng)階段反復(fù)發(fā)生,一個(gè)完整的mRNA 被降解成多個(gè)21 23 nt 的小片段 , 從而導(dǎo)致相應(yīng)的基因表達(dá)沉默。在這一過(guò)程中的多個(gè)步驟都需要ATP , 如 R I SC 復(fù)合體的形成、siRNA 與靶 mRNA 的配對(duì)、 靶 mRNA 的切割。另外 ,在 dsRNA復(fù)制過(guò)程中 ,兩條鏈的分離可能也需要一個(gè)依賴ATP 的 RNA 解旋酶。dsRNA 可通過(guò)細(xì)胞微管在細(xì)胞間傳遞 , 實(shí)現(xiàn) dsRNA 在整個(gè)個(gè)體中的散

7、布。 RNAi 在植物、 線蟲(chóng)、果蠅等低等模式生物中 ,都可由 dsRNA 誘導(dǎo) ,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 , > 30 bp 的 dsRNA 會(huì)引起干擾素效應(yīng)和非特異性基因抑制 , 導(dǎo)致 mRNA 非特異性降解 ,是醫(yī)療上應(yīng)用RNAi 的一大障礙 ,隨后發(fā)現(xiàn)合成雙鏈的只有19 21 nt的 siRNA 卻可以避免這種效應(yīng) , 特異性發(fā)揮RNAi 作用 , 并發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)入雙鏈RNA ( dsRNA )后導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默比用核酶或反義RNA 更徹底、更有效。 E lbash i r 等通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體外合成的21 nt雙鏈siRNA 成功誘導(dǎo)出了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNA , i 且避免了

8、dsRNA 引起的非特異性反應(yīng) ,這為 RNAi 技術(shù)在基因治療領(lǐng)域的研究鋪平了道路。33 RNAi的作用特點(diǎn)3 . 1 高特異性 RNAi 是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制 ,有高度的序列特異性 , 19 nt 的 dsRNA 幾乎可以完全抑制基因的表達(dá) ,而其中的 1 n t 突變后 , 它對(duì)基因的抑制作用就消失了 , 這種高度的序列特異性能夠使 ds RNA 非常特異地誘導(dǎo)與之序列同源的mRNA 降解 , 避免降解與目的mRNA 同家族的其他mRNA, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的精確沉默。因此 , RNAi 具有重大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。3 . 2高效性RNAi存在級(jí)聯(lián)放大效應(yīng) , 由于 Dicer 酶切產(chǎn)生

9、的siRNA 與同源 mRNA 的結(jié)合并降解后者 ,產(chǎn)生新的 siRNA; 新產(chǎn)生的 siRNA 可再次與 Dicer 酶形成 RISC 復(fù)合體 ,介導(dǎo)新一輪的同源 mRNA 降解的多次利用 ,如此循環(huán) ,使相對(duì)很少量的 dsRNA 分子 (數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于內(nèi)源 mRNA 的數(shù)量 )就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的 RNAi 效應(yīng) (每個(gè)細(xì)胞僅需幾分子 siRNA 就可產(chǎn)生 RNAi 效應(yīng) ) ,并可達(dá)到缺失突變體表型的程度。相比普通的 siRNA, 具有短發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈 RNA 產(chǎn)生的 RNAi 效應(yīng)更強(qiáng)。3 . 3高穩(wěn)定性ds RNA 可被細(xì)胞內(nèi)的特異性核糖核酸酶家族成員 Dicer 酶切割為 21 23 nt

10、 的 siRNA 。切割后的 siRNA 由于 3端懸垂 TT 或 UU 堿基 , 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 ,使其不再需要進(jìn)行任何的修飾就能避免細(xì)胞內(nèi)核酸酶類降解而較穩(wěn)定的存在。3 . 4 濃度時(shí)間依賴性 RNAi 效應(yīng)存在時(shí)間、 濃度雙重依賴性 : 干擾效應(yīng)常出現(xiàn)注射 ds RNA 的 6 h 后,在注入 ds RNA 的 2 3 d 后的作用最強(qiáng) ,可持續(xù)效應(yīng) 72 h 以上 ; 而其干擾強(qiáng)度則隨著濃度的增高4而增強(qiáng)。只有連續(xù)注入 ds RNA, 沉默效應(yīng)才能持續(xù)下去 ,否則將產(chǎn)生短暫的沉默效應(yīng) , 而且這種效應(yīng)的強(qiáng)度與初始dsRNA的濃度有關(guān)。另外 , RNAi 還具有對(duì)靶 mRNA 的切割位點(diǎn)確

11、定性高、對(duì)細(xì)胞調(diào)控系統(tǒng)無(wú)影響、作用快速、 穿透性高及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。3 . 5可傳播性等觀察到將 dsRNA 注射入線蟲(chóng)體內(nèi) ,這些 dsRNA可以從注射處的細(xì)胞擴(kuò)散到體內(nèi)其他細(xì)胞, 引起其他細(xì)胞的基因沉默 , 表明了 RNAi 作用的可擴(kuò)散性。3 . 6可遺傳性siRNA 介導(dǎo)的 RNAi 具有一定的可遺傳性。 Fi re等將 dsRNA 注射入秀麗新線蟲(chóng)的性腺后 ,在其第 1代中也誘導(dǎo)出了同樣的基因抑制現(xiàn)象 , 即證明了它的遺傳性。3 . 7靶基因位點(diǎn)的高選擇性外源性 dsRNA的傳入只對(duì)成熟mRNA 產(chǎn)生作用 ,對(duì) mRNA 前體沒(méi)有或很少具有影響 ,以內(nèi)含子或啟動(dòng)子構(gòu)成的外源 ds R

12、NA 無(wú)法引起 RNAi 效應(yīng)。4 RNAi的應(yīng)用4 . 1基因功能的研究人類已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代, 需要大規(guī)模高通量的研究基因的功能, RNAi技術(shù)具有高效特異阻斷基因的表達(dá)等特征 , 也就責(zé)無(wú)旁貸地成為研究基因功能的強(qiáng)大工具, 已有若干實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用RNAi 技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的基因組篩選。 其基本原理就是針對(duì)一基因組不同的部分設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的ds RNA, 構(gòu)建 dsRNA 文庫(kù) ,分別導(dǎo)入不同個(gè)體細(xì)胞內(nèi), 通過(guò)蛋白表達(dá)的改變來(lái)篩選基因并確定基因功能。有研究利用離體和活體RNAi 方法來(lái)沉默根節(jié)線蟲(chóng)的編碼一種保守的 RKN (根節(jié)線蟲(chóng) )分泌肽基16D10 ,并且證實(shí)這種寄生基因在根5節(jié)線蟲(chóng)的植物寄生

13、過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。目前, 哺乳動(dòng)物中非特異性RNAi效應(yīng)的克服和新型表達(dá)載體的問(wèn)世,為哺乳動(dòng)物基因功能的研究提供了一種高效的途徑, 其與基因芯片等技術(shù)結(jié)合,可高通量分析各基因的功能。4 . 2基因表達(dá)調(diào)控在基因組學(xué)的研究中 , 基因表達(dá)調(diào)控是研究基因功能的一個(gè)重要部分, 而基因功能缺失策略在基因表達(dá)調(diào)控中具有特殊重要地位。 RNAi 技術(shù)對(duì)于建立基因剔除動(dòng)物模型具有相當(dāng)大的應(yīng)用前景。K i m 等將 siRNA 運(yùn)用于鼠卵母細(xì)胞和植入前胚胎中,利用針對(duì)內(nèi)源性的Oct3 /4 和 cmos基因的siRNA, 成功地清除了內(nèi)源性的O ct3 /4 和 Mos 產(chǎn)物 , 結(jié)果產(chǎn)生了與Oct3 /4

14、 和 cmos 基因剔除相類似的表型 ,證明了siRNA 對(duì)小鼠早期發(fā)育的分子生物學(xué)研究是一個(gè)非常有用的工具。 Dubouzet 等在 2005 年報(bào)道了用RNAi 技術(shù)抑制黃連中異喹啉生物合成途徑中金黃紫堿甲基轉(zhuǎn)移酶基因,使該酶的表達(dá)水平明顯降低。 A llen 等用 RNAi 技術(shù)一次性抑制罌粟中可待因酮還原酶基因家族中所有基因的表達(dá),結(jié)果也產(chǎn)生了預(yù)期的效果。RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠的出現(xiàn) ,使得在哺乳動(dòng)物整體水平研究基因的剔除成為可能。4 . 3 基因治療 siRNA 的特異性有效保證了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 RNAi 效應(yīng)的特異性 ,結(jié)合已有的高效基因?qū)胂到y(tǒng) ,使得 RNAi 在那些由于基因表達(dá)異

15、常增高而引起的疾病(如腫瘤、病毒感染 )中的作用優(yōu)于目前以抑制基因表達(dá)為目的而采用的反義技術(shù)和核酶等方法。人們正在探索利用siRNA 來(lái)治療腫瘤、病毒感染核免疫缺陷等重6大疾病 , 并且取得了一定成果。 Z immermann 等針對(duì)為獼猴的阿樸蛋白 B 編碼的基因施用 siRNA, 成功降低阿樸蛋白 B、血清膽固醇和低密度脂蛋白的水平。這是首次在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中有關(guān)RNAi的全身用藥 , 是 RNAi 在藥物治療方法上重要進(jìn)展。研究人員首次通過(guò)利用 siRNA 能夠有選擇地抑制PI 3K 路徑的成分并抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中移植的人類結(jié)腸癌細(xì)胞的擴(kuò)散。RNAi 可以特異性的抑制基因表達(dá),所以可用于基

16、因病 , 病毒感染、癌癥的治療。同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列, 設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的dsRNA 分子引發(fā)RNAi ，那么只注射一種dsRNA 即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn) , 也可以同時(shí)注射多種ds RNA 而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。Turner 等針對(duì)人類免疫缺陷病毒1 基因組的LTR ( long ter m i nal repeate , LTR ) 、v i f 和 nef 設(shè)計(jì)了 siRNA, 將 siRNA 轉(zhuǎn)染進(jìn)人類免疫缺陷病毒后 ,這些基因的水平降低了 95 %。運(yùn)用 RNAi 方法對(duì)比觀察了低氧誘導(dǎo)因子 1 和低氧誘導(dǎo)因子 2 ,均有一定程

17、度的調(diào)節(jié)血管生成基因的作用。4 . 4 藥物篩選 RNAi 還應(yīng)用于鑒定藥物靶位和篩選藥物方面。 RNAi 的應(yīng)用明顯地縮短了從鑒定到認(rèn)識(shí)藥物靶基因功能的時(shí)間 , 有助于藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中對(duì)已知靶基因功能的高通量分析。利用RNAi技術(shù)使丘腦下部一種豚鼠相關(guān)肽的表達(dá)量減少了50 %。豚鼠相關(guān)肽使代謝率提高而不減少攝食量,從而減輕肥胖 ,為肥胖的治療提供了一個(gè)靶點(diǎn)。5結(jié)語(yǔ)7雖然人們對(duì) RNAi 的研究只有短短的十幾年時(shí)間 ,但進(jìn)展卻極為迅速。可以認(rèn)為 RNAi 是個(gè)以小分子 RNA 為中心的真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng) ,它可以在多個(gè)層面調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞的增殖分化,通過(guò)對(duì)RNAi的研究將會(huì)使人們對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)更加深入。但siRNA 技術(shù)也存在一定的缺陷 , 如對(duì)靶 mRNA 以外同源序列的非特異性抑制 , 各種載體和 siRNA 本身所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。此外 , 過(guò)量導(dǎo)入 siRNA 可能干擾細(xì)胞內(nèi)其他正常