D-二聚體檢測(cè)在臨床應(yīng)用中常見問題的探討

1、精選文檔D-二聚體檢測(cè)在臨床應(yīng)用中常見問題的探討近年來， D-二聚體作為體內(nèi)交聯(lián)纖維蛋白水解的標(biāo)志性產(chǎn)物，其臨床診斷價(jià)值已得到普遍認(rèn)同。它以其高度的敏感性和陰性預(yù)示能力，在深靜脈血栓（DVT）和肺栓塞（PE）的排除、彌散性血管內(nèi)凝血（ DIC）的診斷及溶栓治療監(jiān)測(cè)等方面具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。雖然D-二聚體檢測(cè)已得到推廣普及，但在D-二聚體實(shí)際應(yīng)用中，仍存在一些對(duì)檢測(cè)參數(shù)的認(rèn)識(shí)誤區(qū)，致使實(shí)驗(yàn)室對(duì)一些檢測(cè)結(jié)果難以為臨床提供合理解釋，對(duì)由于方法學(xué)不同造成的檢測(cè)結(jié)果差異缺乏足夠的理解，給科室質(zhì)量管理帶來困惑。一、不同試劑檢測(cè)結(jié)果不可比性D-二聚體檢測(cè)的基本原理均是基于抗原抗體反應(yīng)。自1983 年 R

2、ylatt 等最先報(bào)道了D-二聚體的單克隆抗體后，有20 多種 D-二聚體單抗研發(fā)問世，目前有超過30 種檢測(cè)方法和20 多種單抗被使用。由于方法學(xué)上的原因，不同試劑測(cè)定同一份標(biāo)本中的D-二聚體濃度往往不具有可比性。其原因主要有：1.單克隆抗體不同這里需要說明的是，我們通常所說的“D-二聚體 ”，在循環(huán)體內(nèi)并不是一個(gè)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單均一的物質(zhì)，而是含有D-二聚體結(jié)構(gòu)的大小不同片段的混合物（如DD、 DY、 XD、 XY、DXD、 YXD、 DXXD等，分子量為 190KDa720KDa）。針對(duì)不同片段制備的單克隆抗體對(duì)同一份血漿中不同片段的結(jié)合能力也不同。目前尚無國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的單抗，也無統(tǒng)一的參考方法

3、。另外，在自動(dòng)化凝血儀上采用的免疫比濁法測(cè)定還受到乳膠顆粒特征的影響，各試劑制造商選擇乳膠顆粒大小不等，結(jié)合單抗能力也有差異，反應(yīng)后吸光特性也不一樣。單克隆抗體特異性差異和試劑生產(chǎn)工藝的不同，致使各試劑間檢測(cè) D-二聚體的結(jié)果缺乏可比性。2.報(bào)告結(jié)果缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)單位D-二聚體檢測(cè)的報(bào)告單位通常包括纖維蛋白原等量單位（FEU）和 D-二聚體單位（ DDU）兩種形式。 FEU是將 D-二聚體的量用降解前纖維蛋白原分子的量來表達(dá)，因此，用FEU表達(dá)的 D-二聚體的量相當(dāng)于用DDU 表達(dá)的約1.7-2.0 倍。在 D-二聚體報(bào)告方式中還包括ng/mL 、 ug/mL 和 mg/L 等形式。通常應(yīng)該直

4、接采用制造商提供的單位，不建議進(jìn)行形式和量綱的轉(zhuǎn)換。3.參考區(qū)間不同各試劑制造商在試劑使用說明書中提供的參考區(qū)間，除因方法學(xué)和單抗因素之外，通常所選的受試人群也是不同的，特別是進(jìn)口試劑，種族、性別、年齡和生理等方面的差異都會(huì)造成統(tǒng)計(jì)結(jié)果的不同，直接應(yīng)用試劑說明書中的參考區(qū)間，往往會(huì)出現(xiàn)一些難以解釋的現(xiàn)象，甚至誤導(dǎo)臨床應(yīng)用。1/13精選文檔4.校準(zhǔn)品不同由于每種試劑所使用的抗體不同，因此相應(yīng)的校準(zhǔn)品不同，目前校準(zhǔn)物包括交聯(lián)纖維蛋白凝塊被消化處理后的血漿，部分純化的D-二聚體制品及高分子量纖維蛋白寡聚體制品等。生產(chǎn)制造商選擇適合其產(chǎn)品的校準(zhǔn)品，但是一種定值校準(zhǔn)品并不適用于另一品牌的試劑，因此，D-

5、二聚體測(cè)定沒有參考標(biāo)準(zhǔn)，方法之間校準(zhǔn)的可能性也很低。目前，國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室所采用的D-二聚體分析系統(tǒng)主要包括西門子、貝克曼-庫爾特、思達(dá)高、羅氏、日本積水等，還有一些國(guó)產(chǎn)試劑，這些體系檢測(cè)結(jié)果之間的可比性較低，且參考值和采用的報(bào)告單位均不同，國(guó)內(nèi)雖有一些不同系統(tǒng)比對(duì)的文獻(xiàn)報(bào)道，但結(jié)果不一，缺乏普遍的指導(dǎo)意義。有的實(shí)驗(yàn)室同時(shí)采用 2 種 D-二聚體檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)本測(cè)定，由此產(chǎn)生的結(jié)果差異不僅會(huì)給臨床診斷造成混亂，同時(shí)也給實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理帶來困惑。解決的辦法是一個(gè)實(shí)驗(yàn)室只選用一種D-二聚體檢測(cè)系統(tǒng)，如已有2 種檢測(cè)系統(tǒng)，應(yīng)分別制定不同系統(tǒng)的參考區(qū)間和所提供服務(wù)群體的cutoff 值，并向臨床說明。二、

6、參考區(qū)間與cutoff 值如前所述，由于 D-二聚體檢測(cè)的方法學(xué)及所用抗體的差異，要求實(shí)驗(yàn)室建立自己的參考區(qū)間和用于排除深靜脈血栓和肺栓塞的cutoff 值。參考區(qū)間的建立相對(duì)較易，它所反映的是當(dāng)?shù)亟】等巳篋-二聚體的水平。而 cutoff 值的建立則較為復(fù)雜，它所反映的是懷疑有DVT 和 PE的病人是否真有DVT 和 PE可能的臨界值。國(guó)外通常采用以下步驟建立：1.在不同地區(qū)建立樣本采集點(diǎn)；2.收集門診懷疑有 DVT 和 PE 的病人樣本，樣本量至少在300 人以上，其中包括25%的患者確診為PVT 或 PE；3.病人選擇，采用Wells 的驗(yàn)前概率（ Pretest Probability

7、 PTP ）評(píng)估規(guī)則和影像學(xué)檢查，并對(duì)陰性病人進(jìn)行為期三個(gè)月的隨訪，以最終確診是否患有DVT 或 PE； 4.剔除預(yù)防或抗凝治療的病人和孕婦；5.對(duì)所有選中的疑似患者同時(shí)進(jìn)行D-二聚體檢測(cè)和影像學(xué)檢查； 6.對(duì) D-二聚體檢測(cè)結(jié)果作受試者工作特征（ ROC）曲線并確定 cutoff值。目前尚未見國(guó)內(nèi)有關(guān)D-二聚體檢測(cè) cutoff 值建立的正式報(bào)道。鑒于樣本采集較為困難，CLSI（美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)）建議可以采用試劑制造商提供由權(quán)威機(jī)構(gòu)（如 FDA）驗(yàn)證的 cutoff值（ CLSI H59-P）。值得注意的是， D-二聚體檢測(cè)的cutoff 值只是用來排除DVT 和 PE，而不是用于區(qū)

8、別健康人群與非健康人群；參考區(qū)間則是判斷除排查DVT 和 PE以外其他疾病引起D-二聚體異常的參照指標(biāo)。Cutoff 值有可能低于或高于或與參考區(qū)間上限一致，這可能會(huì)給臨床醫(yī)生造成混亂，為此，CLSI建議，在報(bào)告檢測(cè)結(jié)果時(shí)，如果只用于排查DVT 和 PE，只報(bào) cutoff 值，如果用于其他疾病的診斷和監(jiān)測(cè)，就報(bào)參考區(qū)間；但許多實(shí)驗(yàn)室往往不清楚D-二聚體檢測(cè)何時(shí)用于排查DVT 和 PE，何時(shí)用于其他疾病的診斷和監(jiān)測(cè)，故建議兩者都報(bào)于臨床，并向臨床說明各自的用途。另外，有一些健康人群D-二聚體也會(huì)升高，如妊娠女性、65 歲以上的老年人。尤其是孕婦，懷孕期間凝血和纖溶系統(tǒng)的同步活化會(huì)出現(xiàn)血漿D-二

9、聚體水平升高。用常規(guī)參考區(qū)間和 cutoff 值作為 D-二聚體異常的參照指標(biāo)，可能會(huì)誤導(dǎo)臨床的診斷與治療。因此，應(yīng)對(duì)這些“特殊人群 ”重新建立參考區(qū)間和cutoff 值。2/13精選文檔三、臨床應(yīng)用價(jià)值1. DVT 和 PE 的排除D-二聚體檢測(cè)最大的臨床價(jià)值是用于排除DVT 和 PE。目前臨床結(jié)合驗(yàn)前概率同時(shí)檢測(cè)患者D-二聚體濃度，來排除DVT 和 PE。當(dāng) PTP評(píng)估為低、中風(fēng)險(xiǎn)，D-二聚體檢測(cè)cutoff 值為陰性（<0.5mg/L FEU） ,即可排除DVT 和 PE，無需再做進(jìn)一步的影像學(xué)檢查；PTP評(píng)估為高風(fēng)險(xiǎn)，D-二聚體檢測(cè)cutoff 值為陽性（ >0.5mg/L

10、 FEU），不能排除血栓性疾病，提示出現(xiàn)凝塊、有DVT、 PE、DIC 等的可能，需做進(jìn)一步的檢查。血管造影雖是診斷DVT 和 PE的 “金標(biāo)準(zhǔn) ”，但其檢查費(fèi)用相對(duì)較高，且有侵入性損傷，同時(shí)還受到醫(yī)院醫(yī)療水平的制約。肺部掃描和超聲也可選擇，但也不便作為常規(guī)篩查。與血管造影和超聲檢查相比，D-二聚體測(cè)定更為簡(jiǎn)單便捷，價(jià)格低廉，特別適合對(duì)門診病人的常規(guī)篩查。國(guó)外研究表明，D-二聚體檢測(cè)結(jié)合PTP可使 30-35%懷疑有 DVT/PE 的病人免受進(jìn)一步檢查，從而減少不必要的痛苦和費(fèi)用。目前市場(chǎng)上用于檢測(cè)D-二聚體的試劑品種有很多種，大體上可分為兩類，一類是以歐美產(chǎn)品為代表，主要用于 DVT/PE排

11、除篩查；另一類是以日本產(chǎn)品為代表，主要是用于DIC 診斷。前者試劑的檢測(cè)特點(diǎn)是，靈敏度高，檢測(cè)范圍相對(duì)較窄，有經(jīng)過第三方驗(yàn)證的cutoff值（一般為500g/L 或0.5mg/L FEU） ,陰性預(yù)示值在 98%以上；后者的特點(diǎn)是，靈敏度相對(duì)較低，檢測(cè)范圍較寬（如表1所示）。美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI） H59-P 推薦指南，專門針對(duì)用于排除靜脈血栓栓塞（VTE）D-二聚體定量檢測(cè)的各項(xiàng)指標(biāo)作了明確規(guī)定，并要求在試劑文件中注明，是排除還是協(xié)助診斷VTE。例如西門子公司生產(chǎn)的Innovance D-Dimer 試劑，配套 Sysmex 全自動(dòng)凝血分析儀，已通過美國(guó)FDA驗(yàn)證（ FDA-5

12、10k） ,今年已在中國(guó)成功注冊(cè)，并開始推廣。驗(yàn)證結(jié)果表明，該試劑主要用于排除DVT 和 PE，其 cutoff 值為 0.5mg/L FEU，在 Sysmex CA系列凝血分析儀上檢測(cè)靈敏度和陰性預(yù)示值均大于 99%，檢測(cè)范圍為 0.19-35.20mg/L ，完全符合 CLSI的要求。最近，我國(guó)也在制定D-二聚體試劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其討論稿中已規(guī)定：結(jié)合臨床診斷的驗(yàn)前概率進(jìn)行D-二聚體檢測(cè)，其陰性預(yù)測(cè)值應(yīng)不低于 95%；測(cè)試范圍涵蓋制造商提供的用于排除診斷的臨界值的1/2 到 4 倍的臨床標(biāo)本測(cè)定值； D-二聚體試劑在測(cè)試范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.98 。2. DIC的診斷大量的臨床實(shí)踐證

13、明，作為繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)的標(biāo)志性物質(zhì)，D-二聚體在 DIC 的診斷和病程監(jiān)測(cè)上具有良好的應(yīng)用價(jià)值。DIC 是一種復(fù)雜的病理生理過程和嚴(yán)重的獲得性、全身性血栓-出血綜合征。其特點(diǎn)是體內(nèi)凝血和抗凝機(jī)制失衡導(dǎo)致彌漫性小血管內(nèi)血栓形成和繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)。在DIC 形成早期即有 D-二聚體升高，而且隨病程的發(fā)展，D-二聚體可持續(xù)升高達(dá)10 倍以上。因此， D-二聚體可作為 DIC 早期診斷和病程監(jiān)測(cè)的主要指標(biāo)。另外，D-二聚體與 FDP同時(shí)測(cè)定，可大大提高其診斷效率。3. 溶栓治療的監(jiān)測(cè)國(guó)內(nèi)外學(xué)者均有報(bào)道，D-二聚體可作為血栓性疾病溶栓治療的特異性監(jiān)測(cè)指標(biāo)。在溶栓治療中，3/13精選文檔D-二聚體含量變化一

14、般有以下特點(diǎn)： 溶栓后 D-二聚體含量在短期內(nèi)明顯上升，而后逐漸下降，提示治療有效； 溶栓后 D-二聚體含量持續(xù)升高或下降緩慢，提示溶栓藥物用量不足； 溶栓治療應(yīng)持續(xù)到 D-二聚體含量下降至正常范圍?；謴?fù)正常的D-二聚體是停止溶栓的指征。需要注意的是，不同疾病的溶栓治療，D-二聚體峰值變化的時(shí)間有所不同。在急性心梗、腦梗溶栓后1 6h D-二聚體達(dá)到峰值，24h 降至溶栓治療前水平；而在DVT 溶栓治療時(shí)， D-二聚體峰值常出現(xiàn)在 24h 或以后。對(duì)于慢性期DVT 患者，溶栓前D-二聚體含量高于正常，而溶栓后D-二聚體含量不升高，或迅速下降至正常范圍，說明此時(shí)僅有少量新鮮血栓形成，大部分為機(jī)化

15、的陳舊血栓，溶栓常不能收到滿意效果。另外，溶栓治療結(jié)束后，應(yīng)定期觀察一段時(shí)間的D-二聚體的變化以防血栓復(fù)發(fā)。四、 D-二聚體應(yīng)用的局限性臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，既往血栓患者的D-二聚體水平低于新近發(fā)生血栓的患者水平，小血栓的D-二聚體水平低于大血栓。因此，有一些時(shí)間較長(zhǎng)的小血栓會(huì)出現(xiàn)亞臨床表現(xiàn)或陰性的D-D 結(jié)果。 D-二聚體監(jiān)測(cè)對(duì)遠(yuǎn)端血栓的敏感性低。高滴度的類風(fēng)濕因子、雌激素治療、卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125 等可引起 D-二聚體水平假性升高。由于D-二聚體檢測(cè)的特異性較低（即針對(duì)某一疾病的診斷特異性），故在大多數(shù)情況下，只能作為輔助診斷或篩查項(xiàng)目。近年來對(duì)于D-二聚體陽性結(jié)果與臨床轉(zhuǎn)歸及預(yù)后價(jià)值的研究

16、多為回顧性分析，樣本量較小，定量分析少，尚不具備普遍意義。雖然目前國(guó)內(nèi) D-二聚體的檢測(cè)呈現(xiàn)迅速增長(zhǎng)的勢(shì)頭，與方法學(xué)、質(zhì)量控制、標(biāo)準(zhǔn)化以及臨床應(yīng)用相關(guān)的問題還很多，需要我們?nèi)ド钊胙芯堪殡S著人們生活水平的提高，心血管疾病發(fā)病率和病死率也成逐年增高的趨勢(shì)，血栓栓塞性疾病做為多種系統(tǒng)疾病的并發(fā)癥成為臨床醫(yī)學(xué)的研究重點(diǎn)。近年來，血栓止血學(xué)臨床檢驗(yàn)在出血性疾病的診斷、術(shù)前檢查和抗凝治療檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。受益于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展，自動(dòng)化凝血儀的普及大大提高了檢測(cè)效率，降低了系統(tǒng)誤差，使檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度達(dá)到前所未有的水平。然而，當(dāng)前國(guó)內(nèi)血栓學(xué)常規(guī)檢驗(yàn)中仍然存在著一些誤區(qū)，除了方法學(xué)本身的問題之外

17、，缺乏對(duì)項(xiàng)目和檢測(cè)原理的理解，也是造成目前參數(shù)使用不當(dāng)、實(shí)驗(yàn)室難以向臨床提供有力支持的主要原因。本文圍繞血栓學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)容從三個(gè)方面加以討論。一、凝血檢驗(yàn)的校準(zhǔn)化與可比性從 PT 和 APTT檢測(cè)方法建立以來，相關(guān)學(xué)者就一直致力于這兩個(gè)參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，迄今為止，只有 PT 實(shí)現(xiàn)了部分標(biāo)準(zhǔn)化，也就是抗凝治療監(jiān)測(cè)中INR 系統(tǒng)的應(yīng)用；而APTT的標(biāo)準(zhǔn)化仍然停留在探索階段。4/13精選文檔（一）抗凝治療監(jiān)測(cè)中PT 的標(biāo)準(zhǔn)化由于凝血活酶試劑活性的差異以及報(bào)告方式的不同，抗凝治療的患者在不同實(shí)驗(yàn)室得到的PT 往往不具有可比性，不能用于抗凝治療藥物的調(diào)整。為此，1977 年世界衛(wèi)生組織將人腦來源的凝血活酶

18、作為一級(jí)國(guó)際參考品（IRP）來校準(zhǔn)凝血活酶試劑。并將PT 以 INR 的形式表示， INR=（ PT/MNPT）ISI ，其中 ISI為凝血活酶的國(guó)際敏感度指數(shù)，MNPT為正常人凝血酶原時(shí)間的幾何均數(shù)，這種校準(zhǔn)方式大幅提高了手工檢測(cè)時(shí)不同試劑之間的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化。（二）自動(dòng)化凝血儀的多樣性使報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)化再次面臨困境INR 的方式提高了實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的有效性和口服抗凝治療的安全性，在各大臨床指南中都可以發(fā)現(xiàn)以 INR 為監(jiān)測(cè)目標(biāo)的診治措施。今天，我們必須明確的是INR 概念和校準(zhǔn)方式的提出是基于手工方法的，當(dāng)自動(dòng)化凝血儀被普及使用之后，INR 概念的內(nèi)涵發(fā)生了更為復(fù)雜的改變。儀器測(cè)試原理與手工法顯著不

19、同，對(duì)凝血活酶ISI 以至 INR 產(chǎn)生較大的影響而且程度不確定，機(jī)械和終點(diǎn)判定等因素破壞了 INR 體系原有的可靠性和精密度。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，同一廠家的相同機(jī)型對(duì)INR 的影響都有顯著差異，儀器校正顯得十分必要。必須明確： INR 是 WHO利用 IRP 標(biāo)定凝血活酶試劑后，手工測(cè)定PT 時(shí)優(yōu)化報(bào)告的一種方法和理念，這時(shí)可以減少室間差異及提高報(bào)告的可比性。凝血活酶校準(zhǔn)時(shí)要求使用參考品和試管傾斜方法判定結(jié)果，然而，將商品化凝血活酶在自動(dòng)化凝血儀上檢測(cè)標(biāo)本時(shí)，原理發(fā)生了改變，這種校準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)已經(jīng)不復(fù)存在了。這時(shí)我們校準(zhǔn)的不僅僅是凝血活酶，而是包括凝血活酶和檢測(cè)技術(shù)（儀器）在內(nèi)的整個(gè)系統(tǒng)。如果不用標(biāo)

20、準(zhǔn)血漿校準(zhǔn)，數(shù)據(jù)顯示實(shí)驗(yàn)室間的INR 差異具有顯著性，波動(dòng)幅度（CV%）大約為917%，僅 60%的實(shí)驗(yàn)室在 10%以內(nèi)。即便使用同種試劑，同類型儀器測(cè)定的INR 也有較大差異。原因之一就是很多研究誤以為ISI 只針對(duì)試劑，實(shí)際上，一個(gè)固定的ISI 未必適合所有機(jī)型，如果不考慮儀器差異而泛泛考察可比性，將導(dǎo)致試劑校準(zhǔn)和系統(tǒng)校準(zhǔn)的混淆。自動(dòng)化凝血儀的檢測(cè)系統(tǒng)往往包括幾個(gè)部分：正常血漿、抗凝患者血漿、凝血活酶試劑、檢測(cè)技術(shù)（手工法和不同類型的凝血儀）。試劑對(duì)標(biāo)本類型差異會(huì)產(chǎn)生不同反應(yīng)，比如，某試劑在自動(dòng)化凝血儀上與IRP 手工法對(duì)比測(cè)定正常和高值兩組標(biāo)本時(shí)，可能回歸曲線的斜率很接近，但是截距有差異

21、，也就是試劑相關(guān)性較好，但是在不同值段的測(cè)定結(jié)果有差異。臨床實(shí)踐中不可能對(duì)正常和抗凝患者的標(biāo)本建立兩條工作曲線，所以應(yīng)盡量選擇性能表現(xiàn)均一的試劑。5/13精選文檔（三）要嚴(yán)格限定試劑ISI的適用范圍為了避免混亂，通過多年研究和專家的倡導(dǎo)，國(guó)外制造商已經(jīng)在其說明書中提供儀器型號(hào)特異的凝血活酶ISI ，便于用戶使用；但是要提供所有儀器和不同試劑組合的ISI顯然是不可能的。更讓人頭疼的是，制造商為每一批凝血活酶試劑提供的ISI不一定很準(zhǔn)確，定標(biāo)血漿使用不當(dāng)進(jìn)而導(dǎo)致 INR 的校準(zhǔn)偏差。凝血活酶制品校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性取決于口服華法令患者標(biāo)本的數(shù)量，WHO推薦的用 IRP 校準(zhǔn)凝血活酶試劑的方法需要測(cè)定至少2

22、0 份新鮮正常血和60 份新鮮抗凝治療的血樣。許多廠家難于收集到足夠數(shù)量的標(biāo)本，無法得到準(zhǔn)確的ISI ，受害的不單是實(shí)驗(yàn)室，更多的是患者的利益。是否選用同物種的IRP 來校準(zhǔn)凝血活酶，也是ISI 標(biāo)注的關(guān)鍵，人源和兔源IRP 校準(zhǔn)的凝血活酶在檢測(cè)性能上是不同的。1977 年以后WHO陸續(xù)改良更新了幾個(gè)物種和不同級(jí)別的凝血活酶參考品，雖然 WHO生物標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會(huì)提出所有商品化凝血活酶都應(yīng)以同一物種的國(guó)際參考品校準(zhǔn)，甚至有專家認(rèn)為應(yīng)該都以人腦參考品校準(zhǔn)，以減少物種之間的差異，但是據(jù)筆者觀察，多數(shù)產(chǎn)品說明書中都沒有校準(zhǔn)方法的詳細(xì)表述，這就為單純追求低成本而不加選擇地?fù)Q用試劑埋下了隱患。此外還有生

23、物參考范圍不同的問題。理論上，使用系統(tǒng)特異的ISI計(jì)算的 INR應(yīng)該是相當(dāng)接近的，然而，由于校準(zhǔn)方式不當(dāng)和生物多樣性的存在，INR 的值也有出入，比如各實(shí)驗(yàn)室MNPT不同，凝血活酶生產(chǎn)商標(biāo)定自己產(chǎn)品ISI 時(shí)使用的方法不同等。這些不利因素就對(duì)凝血實(shí)驗(yàn)室提出了較高要求，但是自行校準(zhǔn)也缺乏可行性。醫(yī)院測(cè)定MNPT還相對(duì)容易，但是按照 WHO的推薦方法對(duì)凝血儀和試劑組成的系統(tǒng)來校準(zhǔn)ISI 并非易事。多數(shù)實(shí)驗(yàn)室直接使用了試劑標(biāo)注的ISI ，甚至有的 ISI不是針對(duì)自己的機(jī)型。而且即便是校準(zhǔn)了ISI ，也只能出來報(bào)告之后再編輯程序批量計(jì)算校準(zhǔn)后的INR。據(jù)筆者了解，目前在國(guó)內(nèi)主流機(jī)型上通過調(diào)整ISI 實(shí)

24、現(xiàn)系統(tǒng)校準(zhǔn)難度較大。因此，要么在實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)（LIS ）中增加數(shù)據(jù)處理的程序語句，要么計(jì)算 INR 后再手工輸入，這種方式推行起來有困難。（四）止凝血檢驗(yàn)中的校準(zhǔn)和定標(biāo)辨析先是校準(zhǔn)試劑，接著又校準(zhǔn)試劑和儀器所組合成的系統(tǒng)，但是，我們?nèi)匀粵]有全面考慮到包括測(cè)試環(huán)境的所有因素。比如說粘度法中磁珠的差異，離心比濁法儀器中離心力的差異，光學(xué)比濁中的光徑，凝集曲線的特異性，電子和機(jī)械部件上差異等等，不一而足，任何因素不一致都會(huì)使結(jié)果受到影響。任何一種方法的結(jié)果都是根據(jù)定標(biāo)曲線和檢測(cè)信號(hào)確定的，儀器之間不僅信號(hào)不同，6/13精選文檔定標(biāo)曲線更是千差萬別。盡管常規(guī)工作中的定標(biāo)通常表述為Calibratio

25、n，但是這并不是嚴(yán)格意義的校準(zhǔn)。定標(biāo)曲線的建立是為了在本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下保持檢測(cè)體系穩(wěn)定的一種方式，只是一個(gè)檢測(cè)平臺(tái)，用于保證實(shí)驗(yàn)室對(duì)某一人群標(biāo)本測(cè)定的一致性。這個(gè)過程中沒有真正的標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)，如果定標(biāo)血漿未經(jīng)IRP 校準(zhǔn)，那么該定標(biāo)是不能溯源的，定標(biāo)后的不同儀器未必具有可比性，系統(tǒng)差異的存在也不能通過定標(biāo)來消除。由于儀器性能上的差異性，簡(jiǎn)單地用校正因子來調(diào)整檢測(cè)系統(tǒng)的方法是無效的。APTT的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程更為困難。檢測(cè)系統(tǒng)類型、接觸活化因子以及試劑磷脂成份的差異會(huì)導(dǎo)致APTT反應(yīng)的差異。 1995 年國(guó)際上提議建立APTT標(biāo)準(zhǔn)化的校準(zhǔn)模型，而目前還沒有適用于APTT的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品， 1998 年 Van

26、 Den Besselaar教授提出可以將含有合成磷脂和膠質(zhì)硅的凍干APTT試劑作為候選的 APTT國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品。 Clauss 法 Fib 定量的定標(biāo)曲線可以溯源到參比血漿，因此這種方法可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化 , 而 PT 衍生法是根據(jù)濁度變化換算結(jié)果，不僅與真實(shí)濃度存在偏差而且也不能標(biāo)準(zhǔn)化。（五）實(shí)現(xiàn)止凝血檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化過程中的有益嘗試可以說，凝血檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化仍然在不斷完善的過程中，一方面我們要強(qiáng)調(diào)其必要性，另一方面也需針對(duì)實(shí)驗(yàn)室的具體條件靈活處理，提出相應(yīng)的解決方案。大致可以分為以下幾個(gè)層次：（1）盡可能使用 ISI 接近 1.0 的 PT 試劑，這種情況下可以使用廠家提供的ISI 。或者選擇廠家標(biāo)注

27、了本實(shí)驗(yàn)室機(jī)型相應(yīng) ISI的試劑，這時(shí)也盡量選擇ISI 較小的劑型。針對(duì)特定的儀器和凝血活酶試劑組合，使用系統(tǒng)特異的ISI，系統(tǒng)特異的 ISI與單一 ISI 相比變異性更低，因此選擇儀器和試劑時(shí)應(yīng)予以考慮。（ 2）如果 ISI 接近 2.0 而且沒有配套凝血儀，又無從獲得口服華法林病人的血漿，應(yīng)該用商品校準(zhǔn)血漿調(diào)整本室ISI 。用商品化凍干質(zhì)控血漿校準(zhǔn)檢測(cè)系統(tǒng)，需要注意血漿來源，不同凝血活酶試劑對(duì)人為消耗生成的低凝血漿和口服抗凝藥后患者的低凝血漿是有反應(yīng)差異性的。使用多個(gè)獻(xiàn)血員的混合血漿與單一血漿相比可以減少生物變異性，減少線性回歸時(shí)數(shù)據(jù)的離散。(3) 用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品使PT 標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)本的 IN

28、R 低于 4.0時(shí)，使用廠家標(biāo)注的 ISI 和實(shí)驗(yàn)室重新校準(zhǔn)的 ISI 計(jì)算的 INR 具有良好的相關(guān)性，但是高于4.0時(shí)則會(huì)產(chǎn)生較大的偏差，這種偏差在臨床上會(huì)形成足夠的臨床意義干擾正確的治療。國(guó)外已經(jīng)出現(xiàn)了多種標(biāo)注了INR 的商品化質(zhì)控血漿用于確認(rèn)檢測(cè)程序，假如所有的凝血活酶制劑都根據(jù)WHO推薦的方法正確地校準(zhǔn)過，那么用這些凝血活酶測(cè)定質(zhì)控血漿時(shí)結(jié)果應(yīng)該是一致的，測(cè)得的INR 與標(biāo)注的 INR 相符，事實(shí)上，只有用同一廠家出品的質(zhì)控血漿和凝血活酶才能得到和標(biāo)注值吻合的結(jié)果。換用其他凝血活酶試劑或者將凝血活酶試劑的ISI重新校準(zhǔn)后，INR 與標(biāo)注值相去甚遠(yuǎn)。因此質(zhì)控血漿的使用尚需慎重，避免誤導(dǎo)

29、用7/13精選文檔戶認(rèn)為自己的檢測(cè)系統(tǒng)不準(zhǔn)確。比較好的辦法是使用20 個(gè)參照 IRP 用手工法標(biāo)定PT 值的凍干血漿校準(zhǔn)品對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行校正。綜上所述，可以認(rèn)為自動(dòng)化凝血檢測(cè)系統(tǒng)具有相互獨(dú)立性，儀器之間不存在標(biāo)準(zhǔn)問題。選擇儀器時(shí)我們應(yīng)該考慮那些與手工測(cè)定結(jié)果接近的和 INR 變異小的設(shè)備。盡管我們一直嘗試著校正自動(dòng)化凝血儀，但是以何為準(zhǔn)呢，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)就應(yīng)該是手工參考方法，通過這種方法獲得標(biāo)準(zhǔn)品的參考值，再對(duì)檢測(cè)體系加以調(diào)整，使儀器測(cè)定的INR 接近該值。二、纖維蛋白原的Clauss 法與 PT 衍生法測(cè)定差異纖維蛋白原（ Fib ）除了診斷低纖維蛋白原血癥和溶栓監(jiān)測(cè)等之外，可以作為累及動(dòng)脈

30、的心血管事件的預(yù)測(cè)指標(biāo)，因此用于篩查時(shí)就需要足夠標(biāo)準(zhǔn)化和良好的重現(xiàn)性，以便于臨床判斷或解釋。選擇哪種方法用于纖維蛋白原定量測(cè)定可以說是老生常談了，除了Fib 抗原分析之外，在臨床常規(guī)分析中無疑是Clauss 方法，但是目前仍有為數(shù)不少的臨床實(shí)驗(yàn)室用PT 衍生法的計(jì)算值報(bào)告結(jié)果，并由此產(chǎn)生了室間質(zhì)控甚至臨床報(bào)告的顯著偏差，考慮到本刊讀者群體對(duì)臨床實(shí)際問題的密切關(guān)注，我們簡(jiǎn)單探討一下PT 衍生法 Fib （ PT-Fib ）與 Clauss 法之間的差異，以及這種差異可能帶來的后果。從某種意義上說，Clauss 法 Fib 測(cè)定是臨床凝血檢驗(yàn)中唯一能夠?qū)崿F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的指標(biāo)，即便是使用不同試劑在不同儀器

31、上測(cè)定，都應(yīng)具有良好的一致性。當(dāng)然，前提是在方法學(xué)不受影響的前提下，比如光學(xué)法儀器測(cè)定乳糜標(biāo)本時(shí)，會(huì)因?yàn)闈岫容^大發(fā)生結(jié)果偏差。用clauss法測(cè)定參考品或可溯源的質(zhì)控品時(shí)，不同試劑的結(jié)果之間一致性非常好，甚至來自于不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果之間差異都不顯著，從這一點(diǎn)說，參加室間質(zhì)評(píng)時(shí)，如果是基于clauss方法，而且在本機(jī)上有較好的定標(biāo)，那么至少 Fib 這一項(xiàng)是不該失控的。但是臨床標(biāo)本不同于參考品，特別是溶栓治療的患者標(biāo)本，其變異性會(huì)略高。8/13精選文檔臨床評(píng)估發(fā)現(xiàn)，測(cè)定高值標(biāo)本時(shí)。與clauss法相比， PT-Fib 的測(cè)定值偏高，而且對(duì)校準(zhǔn)血漿有依賴效應(yīng)，它不僅受標(biāo)本濁度影響，也會(huì)因儀器原理或凝

32、血活酶差異產(chǎn)生較大的離散。PT 檢測(cè)是光散射法還是光密度法，反應(yīng)終點(diǎn)的判斷方式如何，都是造成PT-fib 不具有可比性的原因。一般地說， PT-FIB 測(cè)定結(jié)果略高于 Clauss-Fib ，兩者之間呈曲線關(guān)系，而且隨著FIB 濃度的增高，方法之間的差異會(huì)有所波動(dòng)，最大差距甚至可達(dá)2g/L 。在異常纖維蛋白原血癥和溶栓時(shí)，Clauss法 Fib 已經(jīng)減低時(shí)， PT-Fib 卻仍然表現(xiàn)為正常。不得不提起注意的是，PT-Fib不僅是儀器之間，在同一系列不同型號(hào)的儀器之間也存在差異，比如同樣是光散射法原理定標(biāo)測(cè)定，如果使用了不同系列的反應(yīng)杯，就會(huì)出現(xiàn)散射光與濃度之間的定量關(guān)系發(fā)生變化，進(jìn)而出現(xiàn)結(jié)果的

33、不一致性。除了 PT-fib 的結(jié)果略高于 Clauss 法之外，還有一個(gè)特點(diǎn)，即不同試劑測(cè)定的結(jié)果相關(guān)性非常好，但是有可能一種試劑的結(jié)果可能明顯高于另一試劑。因此，我們?cè)谂R床評(píng)估時(shí)，單一依靠相關(guān)性來說明新試劑是否可靠或有效的做法是欠妥當(dāng)?shù)?，起碼纖維蛋白原這一定量指標(biāo)應(yīng)該引入準(zhǔn)確度的概念，也就是說不同試劑測(cè)定纖維蛋白原時(shí)應(yīng)該使用Clauss 直接比較差異性（因?yàn)橄嚓P(guān)性已經(jīng)成為前提）。由于纖維蛋白原濃度減低比增高的臨床意義較大也更為常見，因此多數(shù)Fib 診斷試劑主要針對(duì)低水平Fib 定量，甚至定標(biāo)血漿濃度僅略高于4g/L ，這就決定了測(cè)定高值標(biāo)本時(shí)的靈敏度和特異性是不同的。從這個(gè)概念上說，選擇F

34、IB 定標(biāo)血漿顯得尤為重要，作為臨床實(shí)驗(yàn)室來講，不便于獲得國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，多數(shù)使用的是廠家提供的定標(biāo)血漿，由此就帶來了產(chǎn)品差異性。Clauss 法尚且能夠用參比血漿或其衍生定標(biāo)血漿來保證不同體系測(cè)定的準(zhǔn)確性，而有些PT-fib是根本不能定標(biāo)的；甚至個(gè)別方法連高值血漿Fib 的濃度都不能設(shè)定進(jìn)去，這是因?yàn)閮x器內(nèi)部的參數(shù)限制， Fib 太高用該方法難以得到定標(biāo)曲線。英國(guó)血液學(xué)會(huì)在纖維蛋白原測(cè)定指南中指出：推薦使用Clauss 法纖維蛋白原測(cè)定。結(jié)合我們的臨床經(jīng)驗(yàn)，不推薦用PT-Fib 進(jìn)行試劑或儀器性能比對(duì)，特別是在一些重要血栓性疾病時(shí)，比如DIC、溶栓、口服抗凝藥或高纖維蛋白原血癥時(shí)，方法學(xué)的差異將

35、表現(xiàn)得非常明顯。三、關(guān)于D-二聚體的認(rèn)識(shí)及其臨床應(yīng)用9/13精選文檔從纖維蛋白原到纖維蛋白形成，在纖溶酶的作用下會(huì)降解出一系列的片段，F(xiàn)DP就是評(píng)價(jià)降解產(chǎn)物多寡的一個(gè)常用指標(biāo)，但是它并不能區(qū)別產(chǎn)物是來自纖維蛋白原還是纖維蛋白。在這些降解產(chǎn)物中，由于D-D 結(jié)構(gòu)域只能在交聯(lián)的纖維蛋白肽鏈的羰基末端之間形成，因此D-二聚體被作為交聯(lián)纖維蛋白形成的標(biāo)志物，或者說體內(nèi)有纖維蛋白凝塊形成，D-二聚體與FDP結(jié)合分析有助于了解體內(nèi)纖溶的情況。（一）為什么不同D-二聚體試劑的測(cè)定結(jié)果不可比由于方法學(xué)上的原因，不同試劑測(cè)定同一份血漿或全血中的D- 二聚體濃度往往不具有可比性。原因包括抗體特異性差異，纖維蛋白降

36、解片段長(zhǎng)短不一，針對(duì)不同片段制備的單克隆抗體也不一樣，抗體對(duì)同一份血漿中不同片段的結(jié)合能力也不同；比濁法測(cè)定還受到乳膠顆粒特征的影響，顆粒大小不等在聚集時(shí)吸光特性也不一樣，因此不同D-二聚體試劑的差異是不可避免的。除了方法差異之外，D-二聚體定量的單位也有多種表達(dá)，比如ng/ml, ug/ml, mg/ml，還有纖維蛋白原當(dāng)量單位（FEU），數(shù)量級(jí)相差很大甚至不可比。更為重要的是，文獻(xiàn)報(bào)道的參考值通常受試人群是不同的，種族、生理、性別和年齡的差異都會(huì)造成統(tǒng)計(jì)結(jié)果的不同，即便使用同一種試劑，檢測(cè)不同人群時(shí)特異性竟然從24%到 82%不等。這種方法學(xué)上靈敏度和特異性的波動(dòng)使其應(yīng)用受到了懷疑，筆者認(rèn)

37、為，D-二聚體檢測(cè)結(jié)果的差異性應(yīng)該在充分理解其生理特點(diǎn)和方法學(xué)的基礎(chǔ)上加以分析，比如，抗體對(duì)低分子量和高分子量降解產(chǎn)物的檢出能力不同，甚至個(gè)別抗體對(duì)交聯(lián)的纖維蛋白和纖維蛋白原的降解產(chǎn)物之間還存在交叉反應(yīng)等等。由于每種試劑所用抗體不同，因此相應(yīng)的校準(zhǔn)物也不同，目前校準(zhǔn)物包括交聯(lián)纖維蛋白凝塊被消化處理后的血漿，DIC 患者的混合血漿，或者高分子量纖維蛋白寡聚體制品等。制造商只選擇適合其產(chǎn)品的校準(zhǔn)物，但是一種定值校準(zhǔn)物不會(huì)適用于另一品牌的試劑，因此，D-二聚體測(cè)定沒有參考標(biāo)準(zhǔn)，方法之間校正的可能性也很低。（二）如何確定D-二聚體的Cutoff值由于血栓栓塞不單作為一種獨(dú)立疾病存在，除了原發(fā)性疾病并發(fā)

38、血栓之外，外傷和手術(shù)等都會(huì)造成 D-二聚體水平升高，而且年齡和生理病理狀態(tài)的影響十分顯著，毫無疑問，靈敏度特異性和預(yù)測(cè)價(jià)值的不一致性也就由此而生。鑒于 D-二聚體測(cè)定的方法學(xué)差異，在應(yīng)用上很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，也不易制備通用型的標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)物，可行的倒是根據(jù)每個(gè)體系的檢測(cè)特性，各自建立具有臨床應(yīng)用價(jià)值的 Cutoff 值，一方面該值應(yīng)在大規(guī)模臨床試驗(yàn)的基礎(chǔ)上獲得，另一方面還應(yīng)根據(jù)檢出特10/13精選文檔征選擇適當(dāng)?shù)撵`敏度和特異性來確定該值。由于D-二聚體的價(jià)值首先體現(xiàn)在過篩上，因此如果Cutoff過低時(shí)，靈敏度過高，假陽性過多就失去了檢測(cè)的特異性，達(dá)不到篩查的效果。而Cutoff過高，假陰性過多，漏

39、診了深靜脈血栓或肺栓塞，后果將不堪設(shè)想。Cutoff的選擇不應(yīng)簡(jiǎn)單照搬廠家推薦值，應(yīng)該參考在權(quán)威雜志發(fā)表的有臨床診斷價(jià)值的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并在使用之初針對(duì)本地人群或患者加以驗(yàn)證。（三） D- 二聚體的量值判斷與臨床決策意義靜脈血栓包括深靜脈血栓（DVT）和肺栓塞（ PE），成年人每年發(fā)病率約為0.1%，男性略高于女性，其中大約 2/3 表現(xiàn)為 DVT，另 1/3 為 PE。靜脈血栓的預(yù)后不容樂觀，多為死亡、復(fù)發(fā)、栓后綜合征以及抗凝后的大出血，栓后綜合征的出現(xiàn)使患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生明顯下降，6%的 DVT和 10%的PE患者出現(xiàn)癥狀后 1 個(gè)月內(nèi)死亡， PE死亡率高達(dá)30%，原發(fā)性靜脈血栓病死率較低，而

40、腫瘤并發(fā)血栓的死亡率最高。可惜的是，尸檢結(jié)果表明許多死亡患者臨床上并未診斷出PE，因此，提高 PE的臨床診斷水平對(duì)于降低病死率具有重要意義。血管造影無疑是診斷DVT和 PE的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是造影價(jià)格相對(duì)較高，有侵入性損傷，還受到醫(yī)院醫(yī)療水平的制約。不造影的話，還可以選擇肺部掃描和超聲，即便不考慮價(jià)格因素，這兩種方法也不便作為常規(guī)篩查，而且真正有PE的患者用一般肺部掃描也只能發(fā)現(xiàn)10-20%。因此，臨床醫(yī)生傾向于向?qū)嶒?yàn)室申請(qǐng)D-二聚體檢測(cè)，自上世紀(jì)80 年代以來 D-二聚體就用于靜脈血栓診斷的排除診斷， D-二聚體正常或者低于 Cutoff 值就可以排除 DVT或 PE的可能了。與血管造影和超聲

41、檢查相比， D-二聚體測(cè)定更為簡(jiǎn)單便捷，價(jià)格低廉。如果臨床認(rèn)為發(fā)病的可能性較低，D-二聚體又是陰性就能夠安全排除靜脈血栓，大大減少進(jìn)一步的影像學(xué)評(píng)估。一種可靠的 D-二聚體檢測(cè)方法診斷PE的靈敏度可以達(dá)到 99%以上，特異性為40-60%，陰性預(yù)測(cè)值（陰性時(shí)可以確定不發(fā)病的幾率）達(dá)到99%，如果將 Cutoff水平由 500ug/L提高到 4000ug/L ，那么 D-二聚體的特異性可以達(dá)到93%，但是為了避免漏診，不建議盲目提高D-二聚體 Cutoff 值。在諸多 D-二聚體測(cè)定方法中，普通ELISA 法對(duì) DVT診斷的靈敏度優(yōu)于定量和半定量的乳膠凝集，定量快速 ELISA 優(yōu)于定量和半定量乳膠法，定性快速ELISA 優(yōu)于半定量乳膠凝集。定量和半定量乳膠凝集以及全血凝集法的特異性優(yōu)于ELISA，定量和半定量以及定性ELISA。其中， ELISA 和定量快速 ELISA 最具陰性診斷價(jià)值（似然比分別為0.12 和 0.09 ）。對(duì)于 PE診斷的靈敏度， ELISE、定量快速 ELISA（半定量方法稍差）要高于全血聚集法，但是全血法的特異性獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步細(xì)分的話，定性快速 ELISA 優(yōu)于 ELISA，定量和半定量的快速ELISA，定量和半定量的