鐮刀型細胞貧血癥基因的檢測方法

1、湖北當陽一中 沈滿弟 限制性內(nèi)切酶分析法是利用限制性 內(nèi)切酶和特異性 DNA探針來檢測是否存在基因變異。當待測DNA序列中發(fā)生突變時會導致某些限制性內(nèi)切酶位點的 改變，其特異的限制性酶切片段的狀態(tài)在電泳遷移率上也會隨之改變，借此可作出分析診斷。女如：（ 2005湖北3）鐮刀型細胞貧血癥的病因是血紅蛋白基因的堿基序列發(fā)生 了改變。檢測這種堿基序列改變必須使用的酶是A.解旋酶B.DNA連接酶C.限制性內(nèi)切酶 D.RNA聚合酶解析：根據(jù) 堿基互補配對原則可采用DNA分子雜交原理或 DNA探針的方法。采用加熱等 一定的技術(shù)手段將患者的 DNA分子片 段與正常人的DNA分子片段單鏈放在一起， 互補的堿基

2、 序 列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；堿基序列改變的部位 則仍然是兩條游離的單鏈。 解 旋酶的作用是DNA分子在復 制或轉(zhuǎn)錄時將 DNA雙鏈解開，在本題中加熱也可以解開達 到目的， 所以不是必須的酶；DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶 都是基因工程的工具酶，一種限制性內(nèi)切酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子的基本骨架上脫氧核糖和 磷酸之間的磷酸二酯鍵，DNA連接酶的作用和它正好相反，是將限制酶切開的缺口縫合起來。而RNA聚合酶則是在基因轉(zhuǎn)錄過程中促進核糖核苷酸形成 mRNA分子的酶，本題就是采用限制性內(nèi)切酶分析法解題的。必須使用的酶就是限制性內(nèi)切酶，故選Co根據(jù)DNA分子雜

3、交原理知，將患者的DNA分子片段與正常人的 DNA分子片段單鏈放在 一起，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起， 形成雜合雙鏈區(qū)；堿基序列改變的部位則仍然是兩條游離的單鏈，有無雙鏈便是區(qū)別，為什么又要用限制性內(nèi)切酶將 其切開再雜交呢？回答這個問題我們先看看。2008天津30- I下圖為人B-珠蛋白基因與其mRNA雜交的示意圖， -表示基因的不同功能區(qū)。從本題看出基因的單鏈的編 碼區(qū)與其轉(zhuǎn)錄的成熟的 mRNA之間可以雜交形成雜合鏈， 但 是它們兩者之間不僅不是完全互補，相反有兩個內(nèi)含子 對應的單鏈部分 一一所含有的上 百個核苷酸，mRNA 根本沒有對應互補的部分，這就說明它們之間相差很大也能 夠雜交，只

4、 不過結(jié)果有突起部分而已，那鐮刀型細胞貧血 癥基因和正常基因只有一個堿基發(fā)生突變，難道用正?；蜣D(zhuǎn)錄的mRNA就不能與只突變一個堿基的基因雜交形成 雜合鏈嗎？應該是肯定 可以,如果這樣來檢測，那鐮刀型細 胞貧血癥基因和正?；虻臋z測結(jié)果是相同的，就找不到區(qū)別，無法鑒別。所以必須采用限制性內(nèi)切酶分析法來檢測才有效，具體是先找到一種限制性內(nèi)切酶，切開控制鐮刀型細胞貧血癥基因的對應部位的正?；?，這樣就形成兩 短段，也同同一種酶來 切鐮刀型細胞貧血癥基因，因為鐮 刀型細胞貧血癥基因發(fā)生了一個堿基的突變，這樣相同的 限制性內(nèi)切酶就無法切開，就還是完整的一長段，在用以上三段對應的已標記的 mRNA進行

5、雜交（此過程可以不用任 何酶，通過控制溫度來打開氫鍵和連結(jié)氫鍵），然后電泳， 如果出 現(xiàn)兩短段的則是正?；?，如果只出現(xiàn)一長段則是 突變基因，如果都有的說明兩者都存在，可視為雜合。利用相關(guān)知識點命題的請看如下高考試題。2007江蘇38單基因遺傳病可以通過核酸雜交技術(shù)進行早期診斷。鐮刀型 細胞貧血癥是一種在地中海地區(qū)發(fā)病率較高的單基因遺傳 病。已知紅細胞正常個體的基因型為BB、Bb，鐮刀型細胞貧血癥患者的基因型為 bb。有一對夫婦被檢測出均為該致病 基因的攜帶者，為了能 生下健康的孩子，每次妊娠早期都 進行產(chǎn)前診斷。下圖為其產(chǎn)前核酸分子雜交診斷和結(jié)果示 意圖。（1）從圖中可見，該基因突變是由于

6、堿基對改變（或A 變成T）引起的。巧合的是，這個位 點的突變使得原來正常 基因的限制酶切割位點丟失。正?；蛟搮^(qū)域上有3個酶切位點，突 變基因上只有2個酶切位點，經(jīng)限制酶切割后， 凝膠電泳分離酶切片段，與探針雜交后可顯示出不同的帶譜，正?；蝻@示 2條，突變基因顯示 1條。DNA或 RNA分子探針要用 放射性同位素（或熒光分子等）等標記。 利用核酸分子雜交 原理，根據(jù)圖中突變基因的核苷酸序列 （ACGTGTT）寫出作為探針的核糖核苷酸序 列UGCACAA 。（3）根據(jù)凝膠電泳帶譜分析可以確定胎兒是否會患有鐮刀型細胞貧血癥。這對夫婦4次妊娠的胎兒H -l11-4中基因型 BB的個體是 一 I和口

7、一 4 , Bb的 個體是一 3 , bb的個 體是一 2。解析：比較基因B 和和突變后的基因b的堿基組成，發(fā)現(xiàn)它們的差別僅是 B基 因一條鏈某一位點上的堿基A突變成b基因一條鏈某一位 點上的堿基T （實質(zhì)上對應的另一條鏈上的堿基也發(fā)生了改變）。據(jù)圖觀察，正?；?B經(jīng)限制酶切割后，凝膠電泳分 裂酶切片段，與 探針雜交后可顯示出不同的帶譜都是二條， 而突變后的基因b經(jīng)限制酶切割后，與探針雜交后可顯示出不同的帶譜都是一條。所以，在分析推斷胎兒口-1H -4的基因型時，可以這 樣認為：基因型Bb的個體同時帶有 B 基因和b基因，所以其應同時含有與 B基因?qū)亩?條帶 譜，與b基因?qū)囊粭l帶譜（

8、這也可以從I-1和I -2得到驗證）。符合這個條件的僅 有口 -3。同理，基因型為BB的 個體應僅有與B基因相對應的二條帶譜，符合條件的是H -1和口 -4。bb的個體是只能是含有與 b基因相對應的一條帶 譜，為H -2。作為探針的必要條 件之一是要易于識別，所以 可用放射性同位素或熒光分子等進行標記。既可以用脫氧核 苷酸 鏈作探針，也可以用核糖核苷酸鏈作探針，題干中明 確要求用核糖核苷酸鏈，所以，特別要 注意當DNA鏈上的堿基是A時，作探針用的RNA鏈上的堿基應為 U。通過如 上分析可知，限制性內(nèi)切酶分析法是利用限制性內(nèi)切酶和特 異性DNA探針來檢測的方法，即是酶切和核酸分子雜交兩種技術(shù)的綜合分析方法。核酸分子雜交技術(shù)在體外進行的時候可以不用相關(guān)酶，但是限制性內(nèi)切酶無法用溫度等外界 環(huán)境的控制來代替。限制性內(nèi)切酶分析法現(xiàn)在的使用很廣泛，女口：在柯薩奇 B組病毒B1-B6型檢測及分型中的應用 -利用GCG軟件對柯薩奇B1-B6型病毒cDNA全序列進 行了限制性內(nèi)切酶酶切位點的分析，目前從理論上推測該方法幾乎可以檢測所有遺傳病的變異基因，近幾年高考試題 也是