血清清蛋白_γ-球蛋白的分離純化與定量----薛彪裴婕

1、血清清蛋白、-球蛋白的分離與純化與定量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)南方醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院學(xué)院10級(jí)預(yù)防醫(yī)學(xué)（食品安全）學(xué)號(hào)：3100091046姓名：薛彪學(xué)號(hào)：3100091047姓名：裴婕 日期：2011年10月19日摘 要 健康人或動(dòng)物血清中含有豐富的血清清蛋白，1-球蛋白，2-球蛋白，-球蛋白，-球蛋白等。血清白蛋白是血清中含量最豐富的蛋白質(zhì)，占血清總蛋白量的50%以上，是維持血液滲透壓的重要物質(zhì)。血清清蛋白還是血液中脂肪酸的攜帶者。當(dāng)身體需要能量或者需要建造材料時(shí)，脂肪細(xì)胞就把脂肪酸釋放到血液中 ，脂肪酸被血清蛋白獲取，并被運(yùn)送到需要的部位。-球蛋白又稱免疫球蛋白，在血清蛋白質(zhì)中數(shù)量居第三，

2、具有重要的一用價(jià)值。各種血清蛋白的功能，性質(zhì)，結(jié)構(gòu)有所不同。因此不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度、在一定的帶電情況等都有所不同，本試驗(yàn)就是利用各種蛋白質(zhì)的差別 ，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離、純化與定量。關(guān)鍵詞：血清清蛋白 -球蛋白 蛋白質(zhì)的差別 分離與純化目 錄1 前言22 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?3 實(shí)驗(yàn)原理44 實(shí)驗(yàn)器材與試劑55 實(shí)驗(yàn)步驟66 結(jié)果及計(jì)算137 實(shí)驗(yàn)預(yù)期及可行性評(píng)估148 注意事項(xiàng)159 參考文獻(xiàn)1. 前言 血清蛋白是血漿里最豐富的蛋白質(zhì)。每一個(gè)蛋白分子能攜帶七個(gè)脂肪酸分子。這    血清蛋白模型些脂肪酸分子結(jié)合在蛋白的縫隙中，它們富含碳的尾部埋藏在里面安全地避開周圍的水分子。血清

3、蛋白同樣能夠攜帶許多其它的不溶于水的分子。尤其是血清蛋白，能夠攜帶著許多藥物分子，比如布洛芬。 正因?yàn)檠宓鞍资侨绱似毡榈卮嬖谟谘褐胁⑶胰绱巳菀椎乇惶峒儯运蔀榭茖W(xué)家最早研究的蛋白質(zhì)之一。今天，當(dāng)需要一種蛋白質(zhì)時(shí)，一種來源于牛體內(nèi)的類似的蛋白在研究中被廣泛地使用，這種蛋白叫做牛族血清蛋白或者稱作BSA。許多酶在稀溶液中不穩(wěn)定，解決的辦法是加入一些牛族血清蛋白。在試驗(yàn)中它能使酶穩(wěn)定，且相對(duì)地中性,不會(huì)影響酶的性質(zhì)。而-球蛋白在血清蛋白質(zhì)中的總含量也達(dá)到了第三位，在醫(yī)學(xué)和臨床上有著重要的意義。2. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.1 從血清中分離并純化血清清蛋白和-球蛋白。2.2 進(jìn)行血清清蛋白和-球蛋白的純

4、度鑒定。2.3 進(jìn)行血清清蛋白和-球蛋白的定量測(cè)定。 3實(shí)驗(yàn)原理：3.1 粗提取（鹽析法）在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性，而使蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出成為鹽析。蛋白質(zhì)表面的電荷和水化膜是維持蛋白質(zhì)親水膠體特性的兩個(gè)重要因素，當(dāng)其中一個(gè)受到破壞，都會(huì)降低膠體的穩(wěn)定性，使蛋白質(zhì)分子凝聚而發(fā)生沉淀，從而達(dá)到鹽析的目的。而各種蛋白質(zhì)的顆粒大小所帶電荷、親水性都不同，鹽析所需的最低鹽濃度也各不相同，因此可以利用不同濃度的鹽溶液分別析出各種蛋白質(zhì)，從而達(dá)到蛋白質(zhì)初步的分離。3. 2脫鹽 用鹽析法分離的得蛋白質(zhì)中含有大量的中性鹽，會(huì)妨礙蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化，因此必須首先去除。常用的方法有透析法

5、、凝膠層析法等，本試驗(yàn)采用的是凝膠層析法，利用得失蛋白質(zhì)與無機(jī)鹽之間分子量的差異，當(dāng)溶液通過SephadeG-25凝膠柱時(shí)，溶液中分子直徑達(dá)的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔而析出，小分子的則滯留在凝膠顆粒中而后洗脫出來。3.3 純化 離子交換是溶液中的離子和交換劑上的離子進(jìn)行可逆的的交換過程。帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑；帶負(fù)電荷的交換劑稱為陽離子交換劑。 本實(shí)驗(yàn)采用的DEAE纖維素是一種陰離子交換劑，溶液中帶負(fù)電荷的離子可與其進(jìn)行交換結(jié)合，帶正電荷的點(diǎn)正電荷的離子則不能，這樣便可達(dá)到分離純化的目的。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液尚含有各種球蛋白，利用它們的等電點(diǎn)的不同可進(jìn)行分離。血清中各種蛋白質(zhì)的pI

6、各不相同，因此，在同一醋酸銨緩沖液中，各蛋白質(zhì)所帶的電荷不同，可以通過DEAE離子交換層析將血清清蛋白和伽馬球蛋白分離出來。3.4 純度鑒定欲檢測(cè)用上述方法分離的清蛋白和-球蛋白是否純凈，單一，可采用醋酸纖維素薄膜電泳對(duì)其進(jìn)行純度鑒定，以正常血清樣品作對(duì)照。比較兩者電泳圖譜可定性判斷純化的清蛋白和-球蛋白的純度。正常人的血清蛋白經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳后可得5條區(qū)帶，本法純化后的伽瑪球蛋白在醋酸纖維電泳圖譜上，僅在清蛋白和伽瑪球蛋白位置上出現(xiàn)。3.5 定量測(cè)定清蛋白，-球蛋白的定量測(cè)定可采用多種方法，如紫外吸收發(fā)，本實(shí)驗(yàn)采用雙縮脲發(fā)。 凡是具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物，都可以在堿性溶液中與Cu2

7、+形成紫色復(fù)合物，即為雙縮脲反應(yīng)，此化合物顏色的深淺與該化合物的濃度成正比，在54nm處有最大吸收峰。蛋白質(zhì)有多個(gè)肽鍵，因此具有雙縮尿反應(yīng)，故可以用分光光度法來測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。4. 實(shí)驗(yàn)器材與試劑4.1實(shí)驗(yàn)材料和試劑4.1.1 0.3mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液4.1.2 0.06mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液4.1.3 0.02mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液4.1.4 1.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液4.1.5 飽和的硫酸銨溶液4.1.6 0.92mol/l磺基水楊酸4.1.7 0.05mol/lBaCl溶液4.1.8 雙縮脲試劑4.1.9 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

8、4.1.10 健康人的血清或動(dòng)物血清4.2 儀器及器材： 1.層析住2.燒杯3.吸管4.滴灌5.試管6.黑色反應(yīng)板7.貼固定架8.螺旋夾9.離心管和離心機(jī)10.分光光度計(jì) 和水浴箱4.3 試劑的配制：4.3.1 0.3mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液：稱取醋酸按23.12g，加蒸餾水800ml溶解，滴入稀氨水或稀醋酸液（注意混合均勻），調(diào)節(jié)PH至6.5后，加蒸餾水至1000ml。4.3.2 0.06mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液：取上液用蒸餾水做5倍稀釋。4.3.3 0.02mol/l的PH6.5醋酸銨緩沖液：取上液用蒸餾水做3倍稀釋。 注意：上述三種溶液的PH必須準(zhǔn)確，用蒸餾水稀釋后營

9、再測(cè)PH。由于醋酸銨可遇熱分解，故配置溶液時(shí)不得加熱，配好后必須密封保存，以防PH和濃度發(fā)生改變，否則將影響分離蛋白質(zhì)的純度。4.3.4 1.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液：稱取NaCl87.7g溶于0.3mol/LPH6.5的醋酸銨溶液中至1000ml。4.3.5飽和的硫酸銨溶液：稱取固體硫酸銨850g加入1000ml蒸餾水中，在7080攝氏度下攪拌溶解，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結(jié)晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。4.3.6 0.92mol/l磺基水楊酸4.3.7 0.05mol/lBaCl溶液4.3.8 雙縮脲試劑：精確稱取硫酸銅3.0g、酒石酸鉀鈉9.0g及碘化鉀5

10、.0g，各自分別溶于25ml蒸餾水中。將酒石酸鉀鈉和碘化鉀溶液倒入1000ml容量瓶中，加入6.0mol/L氫氧化鈉100ml，混勻。再加入硫酸銅溶液，邊加邊搖，最后加水定容至1000ml，儲(chǔ)存于塑料瓶?jī)?nèi)。此試劑可長(zhǎng)期保存，有儲(chǔ)存瓶?jī)?nèi)有黑色沉淀出現(xiàn)，則需重新配置。4.3.9蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)：用微量凱氏定氮法準(zhǔn)確測(cè)出牛血清清蛋白或酷蛋白的蛋白含量，然后用15%氯化鈉-麝香草酚溶液稀釋成梅1ml蛋白質(zhì)含量為6.0mg，此蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液4攝氏度可保存八個(gè)月。4.3.10 0.9%氯化鈉溶液。5.實(shí)驗(yàn)步驟5.1葡萄糖電泳層析柱的準(zhǔn)備 （1萄糖層析柱的準(zhǔn)備步驟）步驟操作（1）凝膠的準(zhǔn)備稱取干燥葡萄糖凝膠G-25

11、，按每克干膠假加入蒸餾水約50ml。置于沸水浴中1h，取出冷卻，待凝膠下沉后，傾去含有細(xì)微懸浮物的上層液， 然后重復(fù)處理兩次，加入兩倍量的0.02mol/l,PH6.5 NH4AC緩沖溶液，輕輕攪拌，靜止片刻待凝膠顆粒沉降后，傾去上層液（2）裝柱選用內(nèi)徑1.0cm，高10cm，頂部嵌裝有砂芯濾片的層析柱，夾持在支架上，并保持垂直。首先向柱內(nèi)加入少量的緩沖溶液，將上述處理的過的凝膠粒懸液連續(xù)注入層析柱內(nèi)，直至所需凝膠床高度（約為7cm）為止。 裝柱后接上恒壓儲(chǔ)液瓶，或在柱下端流出口軟管上加螺旋夾，調(diào)節(jié)流速約為2ml/min用 緩沖溶液，洗滌平衡膠柱，然后夾死下端流出口，裝柱操作即完成，可供蛋白質(zhì)

12、樣品液除鹽使用。（3）凝膠的再生及保存此凝膠層析柱可以反復(fù)使用，每次使用后應(yīng)該一以所需緩沖液，流洗平衡即再生平衡，如暫不使用，應(yīng)以含3mmmol/lNaN3 d 緩沖液洗滌后放置，防止凝膠霉變，久不使用宜將其由柱內(nèi)倒出，加入NaN3至3mmol/l,濕態(tài)保存于4度的冰箱注意：a.沸水浴過程中要經(jīng)常搖動(dòng)，使氣泡逸出。b.裝柱時(shí)注意凝膠粒混合均勻，凝膠床內(nèi)不得有界面和氣體，凝膠床面平整。C.若凝膠床內(nèi)出現(xiàn)界面、氣泡或流速明顯減慢時(shí)，將膠粒倒出，重新裝柱。D.久用后，如凝膠床表面有沉淀等雜質(zhì)滯留，可將表面一層膠粒析出，再填補(bǔ)新的凝膠。e.凝膠禁止保存于0攝氏度以下冰箱中，防止凍損膠粒。5.2 DEA

13、E纖維素離子交換層析柱的準(zhǔn)備（2DEAE纖維素離子交換層析柱的準(zhǔn)備的步驟）步驟操作（1）酸堿處理按100ml柱床體積稱取DEAE纖維素14g，加入0.5mol/L的鹽酸，攪拌均勻，放置30min后加約10倍量的蒸餾水，攪勻，放置片刻，待纖維素下沉后，棄去含細(xì)微懸浮物的上層液。如此反復(fù)洗滌23次后，置墊有細(xì)尼龍濾布的布氏漏斗中抽濾。用蒸餾水充分慮洗，直至流出液PH值約為4 然后將DEAE纖維素置于燒杯中，加入0.mol/L的氫氧化鈉處理一次。并以蒸餾水充分慮洗，直至流出液PH值約為7（2）裝柱，平衡經(jīng)酸堿處理過的DEAE纖維素置于燒杯中，加入0.02mol/L，PH約為6.5 的醋酸銨緩沖液，并

14、用醋酸調(diào)節(jié)PH至6.5，傾去上層清夜，用此DEAE纖維素裝柱。 在層析柱下端出水口套上硅膠管，用螺旋夾擰緊，然后將上述處理好的的纖維素懸液傾入柱內(nèi)，再擰松螺旋夾，使液體流出，直至所需的柱床高度約為6厘米為止。待液面接近纖維柱柱床表面。將螺旋夾擰緊， 裝柱后層析柱接上恒壓儲(chǔ)液瓶，用0.02mol/L,PH 約為6.5 醋酸銨緩沖液流洗平衡。，（3）再生及保存DEAE纖維素柱用過一次后，經(jīng)1.5mol/L的氯化鈉-0.3mol/L的醋酸銨緩沖液流洗。再用0.02mol/L PH為6.5醋酸銨緩沖液洗滌平衡后可重復(fù)使用。 如暫不使用，應(yīng)以濕態(tài)保存在含0.11mol/L正丁醇的緩沖液中，以防霉變。注意

15、：a.HCl處理時(shí)間不可太長(zhǎng)，否則DEAE纖維素變質(zhì)。b.裝柱時(shí)要注意裝均勻，纖維素柱床內(nèi)不得有界面和氣泡，表面要平整。c.若柱床頂部有洗脫不下來的雜質(zhì)，應(yīng)將頂層纖維素吸棄，填補(bǔ)新的、經(jīng)酸堿處理過的DEAE纖維素，并用緩沖液洗至平衡。d.多次使用后如雜質(zhì)較多或流速過慢，可將纖維素倒出，先用1.52.0mol/NaCl浸泡，水洗，再重新裝柱。5.3中性鹽沉淀步驟步驟操作（1）鹽析取離心管一個(gè)，加入0.8mol人或動(dòng)物血清，邊搖邊緩慢滴入飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻后室溫下放置10min，離心10min（4000r/min）。用滴管小心吸出上清液置于試管中，作為純化清蛋白之用（2）溶解沉淀向離心

16、管的沉淀加入0.6mol蒸餾水，振搖使之溶解，作為純化球蛋白用注意：上層清夜盡量全部吸出，但不可吸出沉淀物。5.4過凝膠層析柱步驟步驟操作（1）調(diào)節(jié)層析柱液面葡萄糖凝膠G-25層析柱經(jīng)0.02mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液流洗平衡后，取下恒壓儲(chǔ)液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夾，使層析柱上的緩沖液面剛好下降到凝膠床液面（2）加樣品用細(xì)長(zhǎng)滴管吸取上述經(jīng)鹽析所得的粗制蛋白質(zhì)溶液，小心而緩慢的加入凝膠床上面，柱下端用10ml刻度離心管接液，擰松柱下螺旋夾，調(diào)節(jié)適當(dāng)流速，使樣品進(jìn)入凝膠床，至液面降到凝膠床表面為止（3）洗層析柱小心用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液洗滌層析柱內(nèi)壁，

17、以洗滌粘在柱壁上的蛋白質(zhì)樣品液（4）洗脫待樣品液進(jìn)入凝膠床內(nèi)，繼續(xù)用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液流洗，同時(shí)注意流出液量（5）檢測(cè)及收集蛋白質(zhì) 在黑色反應(yīng)板凹孔內(nèi)加2滴0.92mol/L磺基水楊酸，隨時(shí)檢查流出液是否含有蛋白質(zhì)，滴流出液1滴黑色反應(yīng)板凹孔內(nèi)接觸到磺基水楊酸溶液，若出先白色混濁或沉淀，表示已有蛋白質(zhì)流出（當(dāng)凝膠床體積為5.5ml時(shí)，流出的液體量約為2ml就可能有蛋白質(zhì)流出），立即收集流出的蛋白質(zhì)溶液。收集約12滴后，滴流出液1滴于預(yù)先加有1滴0.05mol/L(1%)BaCl2的黑色反應(yīng)板凹孔內(nèi)，一旦見出現(xiàn)白色沉淀（表示有SO42-），立即停止收集收集的蛋白質(zhì)溶

18、液即可分別過DEAE纖維素柱，進(jìn)行離子交換層析(6)層析柱再生平衡收集蛋白質(zhì)溶液后的凝膠層析柱繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液流洗，用BaCl2液檢測(cè)層析柱流出液，當(dāng)流出液用BaCl2檢查SO42-為陰性后，繼續(xù)洗滌23ml。凝膠層析柱即可再生平衡，可再次使用注意：a.當(dāng)層析柱的緩沖液面或樣品液面剛好下降到纖維素床表面時(shí)，不要使液面低于纖維素膜表面，以免空氣進(jìn)入凝膠床。b.往層析住加樣品或緩沖液洗脫事，要小心緩慢加入，不要將纖維素沖起或破壞纖維素床表面平整。C.切勿將檢測(cè)蛋白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查硫酸根的氯化鋇混淆，因?yàn)槎呦鄳?yīng)生成物的沉淀均為白色。d.洗脫是應(yīng)注意及時(shí)收集

19、樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失。e.葡萄糖凝膠價(jià)錢昂貴，要回收再生避免損耗，嚴(yán)禁倒掉。5.5 球蛋白的純化：過DEAE纖維素陰離子交換層析柱步驟 操作（1）調(diào)節(jié)層析柱換沖液面經(jīng)處理再生好的DEAE纖維素層析柱，取下其恒壓儲(chǔ)液瓶管塞。小心控制柱下端螺旋夾，使柱上緩沖液面剛好下降到纖維素床表面。柱下端用10ml刻度離心管收集液體，以便了解加樣后液體的流出量。（2）加樣品將除除鹽后收集的球蛋白溶液緩慢加到纖維素柱上，調(diào)節(jié)層析柱下端的螺旋夾使樣品進(jìn)入纖維素柱床，至液面降到纖維素柱床表面為止。（3）析層析小心用1ml 0.02mol/L PH 6.5的醋酸銨緩沖液洗滌沾在柱壁上的蛋白質(zhì)樣品液。（4）洗脫待

20、樣品進(jìn)入纖維素柱床內(nèi)，繼續(xù)用0.02mol/L PH 6.5的醋酸銨緩沖液流洗，。同時(shí)注意流出液量（5）檢測(cè)及收集蛋白質(zhì)流洗時(shí)，隨時(shí)用0.92mol/L磺基水楊酸檢查流出液中是否含蛋白質(zhì)（方法同前）當(dāng)有蛋白質(zhì)出現(xiàn)時(shí)，立即連續(xù)收集三管，每管10滴，。此不被DEAE纖維素吸附的蛋白質(zhì)即為純化的-球蛋白，取其中蛋白質(zhì)濃度最高的一管留作鑒定用。 注意：a.當(dāng)層析柱的緩沖液面或樣品液面剛好下降到纖維素床表面時(shí)，不要使液面低于纖維素膜表面，以免空氣進(jìn)入凝膠床。b.往層析住加樣品或緩沖液洗脫事，要小心緩慢加入，不要將纖維素沖起或破壞纖維素床表面平整。C.切勿將檢測(cè)蛋白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查硫酸根的氯化鋇混淆，

21、因?yàn)槎呦鄳?yīng)生成物的沉淀均為白色。d.洗脫是應(yīng)注意及時(shí)收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失，特別是收集伽馬球蛋白時(shí)。6 清蛋白的純化，過DEAE纖維素陰離子交換層析柱 （清蛋白的純化，過DEAE纖維素陰離子交換層析柱的操作步驟）步驟 操作（1）調(diào)節(jié)層析柱緩沖液面此時(shí)DEAE纖維素層析柱不必再生，可直接用于純化清蛋白小心控制住下端螺旋夾，使柱上緩沖液面剛好下降到纖維素床表面，柱下端用10ml刻度離心管收集液體，以便了解加樣后液體流出量（2）加樣品將除鹽后收集的清蛋白溶液緩慢加到纖維素柱上，調(diào)節(jié)層析柱下端的螺旋夾，使樣品進(jìn)入纖維素柱床，至液面降到纖維素柱床表面為止 （3）洗層析柱將除鹽的粗制清蛋白溶液

22、上柱后，改到0.06mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液洗脫小心用1ml 0.06mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液洗滌沾在柱壁上的蛋白質(zhì)樣品液（4）洗脫待樣品進(jìn)入纖維素柱床內(nèi)，繼續(xù)用0.06mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液流洗。同時(shí)注意流出液量。流出約6ml（其中含-球蛋白及-球蛋白）后，將柱上的緩沖液面降至與纖維素表面平齊。改用0.3mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液洗脫（5）檢測(cè)及收集蛋白質(zhì)用0.92mol/L（20%）磺基水楊酸檢查流出液是否含有蛋白質(zhì)（方法同前）。由于純化的清蛋白仍然結(jié)合有少量膽色素等物質(zhì)，故肉眼可見一層淺黃色的成分被0.3mol/L、pH6.

23、5 NH4AC緩沖液洗脫下來，大約改用0.3mol/L NH4AC緩沖液洗脫約2.5ml時(shí)，即可在流出液中試出有蛋白質(zhì)出現(xiàn)，立即連續(xù)收集2管，每管10滴，此即為純化的清蛋白液，留作純度鑒定用（6）纖維素層析住的再生與平衡用過的DEAE纖維素層析柱，應(yīng)重新再生平衡先用約6ml 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用0.02mol/L pH6.5 NH4AC液約10ml流洗平衡即可注意：a.當(dāng)層析柱的緩沖頁面或樣品頁面剛好下降到纖維素膜表層時(shí)，不要是液面低于纖維素膜表面，以免空氣進(jìn)入凝膠床。b.往層析住加樣品或緩沖液洗脫事，要小心緩慢加入，不要將纖維素沖起或破壞纖維

24、素床表面平整。C.使用時(shí)切勿將各時(shí)段所用的溶液濃度搞混。d.洗脫是應(yīng)注意及時(shí)收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失。7 純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳）步驟 操作準(zhǔn)備電泳槽準(zhǔn)備：將電泳槽置于水平平臺(tái)上，兩側(cè)注入等量的巴比妥緩沖溶液，使其在同一水平a，頁面與支架距離22.5cm，用三層濾紙或雙層紗布搭橋薄膜準(zhǔn)備：將醋酸纖維薄膜裁成2cm乘以8cm大小共四段，在薄膜一段1.5cm處用鉛筆輕輕畫上一條橫線為點(diǎn)樣線，末端用鉛筆做記號(hào)。進(jìn)入巴比妥溶液中直至浸潤(rùn)完全。用鑷子青青取出，粗面朝上，平放在兩層干濾紙中間，輕輕拭去多余的緩沖液。點(diǎn)樣薄膜片置于干凈的玻璃或?yàn)V紙片上，粗面朝上，用玻片或載玻片一段的截面在盛有樣

25、品的直接沾取23微升待測(cè)品，讓后將樣品與薄膜點(diǎn)樣先輕輕接觸，均勻分布在點(diǎn)樣線上，帶樣品滲入薄膜后移開，四種樣品分別點(diǎn)樣。電泳將已點(diǎn)好的樣品薄膜放在鋪有濾紙鹽橋的電泳槽上，點(diǎn)樣面朝下，點(diǎn)樣端至陰極，輕輕拉平薄膜。平衡約5min，使緩沖液滲透大道平衡。接好電路，調(diào)節(jié)電壓開始電泳。待各個(gè)樣品沒有變化停止電泳，并輕輕取出。染色漂洗和鑒定將染色液倒入大培養(yǎng)皿中，電泳完畢后用鑷子取出薄膜，直接浸入染色約5min。后將薄膜取出，漂洗至背景無色，觀察電泳情況得出結(jié)論。5.8 定量測(cè)定（雙縮脲法）步驟 操作反應(yīng)體系設(shè)置取血清0.1ml，加0.9%氯化鈉溶液0.9ml 混勻（1:10稀釋），作為測(cè)定管1，清蛋白作

26、為測(cè)定管2，球蛋白作為測(cè)定管3取五支試管編號(hào)，按下表加入試劑，混勻試劑 空白管 標(biāo)準(zhǔn)管 測(cè)定管1 231:10稀釋血清 0 0 1.0清蛋白液 0 0 0 伽馬球蛋白液 0 0 0蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液 0 1.0 0 0 0.9%氯化鈉 2.0 1.0 1.0 雙縮脲試劑 4.0 4.0 4.0 0 1.0 0 0 1.0 4.0 0 0 1.0 0 1.0 4.0反應(yīng)混勻后置37攝氏度水域中保溫20min比色測(cè)定以空白管調(diào)零點(diǎn)，在540nm波長(zhǎng)處比色，讀取各管吸光值A(chǔ)注意：每管重復(fù)測(cè)三次A值求平均值用于蛋白質(zhì)濃度計(jì)算。6、結(jié)果及計(jì)算6.1 定性鑒定結(jié)果 將3條經(jīng)染色的纖維醋酸薄膜并列，使樣點(diǎn)線位于同

27、一水平，以正常血清蛋白譜作為對(duì)照，觀察提純物質(zhì)屬于那種蛋白質(zhì)，其純度如何。并描述與正常帶相比的位置及條帶數(shù)。圖譜見實(shí)驗(yàn)結(jié)果。6.2 數(shù)據(jù)記錄測(cè)定次數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)管 測(cè)定管1 測(cè)定管2 測(cè)定管3123各管平均值A(chǔ)6.3 結(jié)果計(jì)算按以下三式計(jì)算各管蛋白質(zhì)濃度 （蛋白質(zhì)含量單位mg/ml） 血清蛋白質(zhì)=AU1/As*6.0*10 清蛋白= AU2/As*6.0 伽馬球蛋白= AU3/As*6.06.4 常見問題及分析問題解析醋酸纖維薄膜出現(xiàn)白斑或彎曲薄膜質(zhì)量不好，電泳槽密閉性不好或電流太大，溫度過高導(dǎo)致過分干燥電泳圖譜不整齊點(diǎn)樣不均勻，薄膜未完全浸透，溫度過高使薄膜局部干燥，電泳時(shí)薄膜未方正，電流方向與薄膜方向不平衡，緩沖液變質(zhì)。染色后白蛋白部分著色淺染色時(shí)間不足，染色液陳舊，蛋白質(zhì)含量過高各組分分離不佳點(diǎn)樣過多，薄膜結(jié)構(gòu)過分細(xì)膩，透水性、導(dǎo)電性差，電流過小薄膜上有氣泡貼膜時(shí)有氣泡，玻璃板上有油