生物實驗室操作規(guī)范

1、生物實驗室操作規(guī)范第1章 生物實驗室規(guī)范1. 進(jìn)入實驗室需要在實驗室使用登記簿上登記，沒有經(jīng)過培訓(xùn)的人員不允許單獨進(jìn)入細(xì)胞間；2. 進(jìn)第二間屋子換上門口拖鞋，外套脫下，換上白大褂；3. 進(jìn)細(xì)胞間，換上拖鞋，并換上相應(yīng)的白大褂；4. 放在實驗室的任何化學(xué)藥品需要貼上標(biāo)簽，寫明試劑名稱、聯(lián)系方式，否則一律垃圾處理；5. 放入細(xì)胞間的物品需用酒精擦拭外包裝。放入冰箱的物品外圍需用酒精擦拭，然后注明試劑名稱、使用者，遠(yuǎn)離培養(yǎng)基；6. 有毒、易揮發(fā)試劑在外間通風(fēng)柜內(nèi)操作；7. 雙手接觸過任何未滅菌的東西后，都需用酒精消毒后才能接觸滅菌的器具或試劑； 8. 值班同學(xué)：晚上開紫外燈，早上關(guān)掉；垃圾箱滿了倒掉

2、；廢液瓶滿了，加入次氯酸鈉后倒掉；所有的儀器是否關(guān)閉；試劑是否收好；衣服、鞋子是否擺好。第2章 生物實驗室間使用要求2.1 實驗前的例行檢查與消毒措施1. 減壓閥檢查：減壓閥是連接在CO2培養(yǎng)箱與CO2氣瓶間的減壓裝置，用于將氣瓶內(nèi)較高的壓力降低至培養(yǎng)箱可以使用的壓力?？拷鼩馄康囊患墘毫Ρ肀P指示氣瓶內(nèi)氣體壓力，當(dāng)該壓力小于1.5MPa時，表明CO2氣體不足，應(yīng)及時購買氣體1。遠(yuǎn)離氣瓶的二級壓力表盤指針應(yīng)在0.02-0.04MPa之間，若超出此范圍請根據(jù)箭頭指示調(diào)節(jié)旋鈕（注意：a旋鈕感覺越緊，閥門開口越大；b指針示數(shù)會因為培養(yǎng)箱對橡膠管內(nèi)氣體的間斷吸氣而跳動，調(diào)節(jié)旋鈕時注意延時因素，并將跳動范圍

3、控制到0.02-0.04MPa間）。2. CO2培養(yǎng)箱檢查：溫度顯示應(yīng)在36.9-37.1（）之間，CO2濃度在4.9-5.1（%）之間，嚴(yán)禁私自改變設(shè)置。底部增濕盤中水量不足1/3，應(yīng)及時添加無菌去離子水，嚴(yán)禁添加自來水。培養(yǎng)箱長時間斷電重啟后，應(yīng)僅設(shè)置溫度為37，CO2濃度設(shè)置為零，待培養(yǎng)箱溫度穩(wěn)定在37六小時后，再設(shè)置CO2濃度為5%。3. 醫(yī)用冰箱檢查：醫(yī)用冰箱在穩(wěn)定狀態(tài)下冷藏溫度應(yīng)為4，冷凍溫度應(yīng)為-20，若示數(shù)變化應(yīng)及時聯(lián)系管理員。4. 例行消毒：a. 在房間無人狀態(tài)下，每周打開紫外消毒燈30分鐘至少2次；b. 實驗前后，用已經(jīng)被70%酒精浸濕 的紙巾擦拭生物安全柜操作臺；c. 實

4、驗前后，分別打開生物安全柜內(nèi)的紫外滅菌燈至少30分鐘；d. CO2培養(yǎng)箱底盤去離子水兩周 更換一次，每次添加0.1%的新潔爾滅溶液；e. 每四周 清洗一次CO2培養(yǎng)箱，將托盤、水盤等拆卸，并用70%酒精對培養(yǎng)箱內(nèi)部箱體及零件全部擦拭一遍；f. 每兩周 用次氯酸鈉漂白水稀釋液清洗實驗室地面；g. 平時應(yīng)隨手用酒精擦拭桌面，保證桌面整潔。水浴鍋內(nèi)應(yīng)及時添加或更換去離子水，視具體情況而定。2.2 相關(guān)廠家聯(lián)系方式1. CO2氣瓶：純度規(guī)格三個九，千禧京城，2. CO2維修保養(yǎng)：見培養(yǎng)箱箱體；3. 移液器與電動移液槍維修：北京龍躍偉逸科貿(mào)15811173739；4. 生物安全

5、柜維修：青島海爾特種電器有限公司，4006992008；5. 醫(yī)用冰箱維修：青島海爾特種電器有限公司，4006992008；6. 離心機：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠82531618。第3章 細(xì)胞間操作規(guī)范1. 實驗操作必須更換實驗區(qū)拖鞋，穿著白大褂，佩戴無菌手套，應(yīng)勤用酒精對前臂及雙手消毒；2. CO2培養(yǎng)箱內(nèi)部環(huán)境非常適宜微生物繁殖，故所有從外界拿入培養(yǎng)箱內(nèi)的物品均需要用70%酒精提前擦拭消毒，在對培養(yǎng)箱操作之前務(wù)必對雙手及前臂消毒；3. 所有將要使用或用過的試劑及容器 務(wù)必立即標(biāo)注使用人的姓名首字母、日期、試劑名稱或狀態(tài) 以防其他實驗人員混用或誤認(rèn)為是干凈的無菌容

6、器而造成污染；4. 一般情況下不允許 拿出生物安全柜內(nèi)器械，若必須在安全柜外使用器械，則應(yīng)在使用后經(jīng)70%酒精仔細(xì)擦拭消毒后放回安全柜內(nèi)；5. 安全柜的無菌氣流由上自下吹過，并在操作臺表面分成前后兩股氣流進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，故應(yīng)盡可能避免不干凈的物品（如雙手、使用過的耗材等）出現(xiàn)在無菌物品上方，操作應(yīng)盡量在安全柜中間部分進(jìn)行，尤其不能置無菌耗材于前風(fēng)幕與外界環(huán)境的交界處；6. 錐形瓶中的生物廢液可在加入適量次氯酸鈉漂白液消毒后，倒入下水道中，洗凈瓶體后加入厚約1cm的次氯酸鈉漂白液繼續(xù)盛裝生物廢液。使用、污染過的生物耗材應(yīng)置于次氯酸鈉漂白液消毒后再作為一般垃圾處理；7. 使用移液槍及電動移液器時應(yīng)慢

7、速、小心操作，避免液體接觸槍體，若不慎接觸，應(yīng)立即用70%酒精擦拭消毒。對于電動移液器，過度吸取液體會堵塞器械管口，可能造成儀器失效，若更換槍體內(nèi)過濾器后仍不能正常使用，需聯(lián)系廠家維修；8. 實驗結(jié)束后，清理廢液燒杯，并用酒精擦拭安全柜臺面，當(dāng)電動移液器電量不足一半時，應(yīng)及時充電，避免電池老化，開啟紫外燈至少30分鐘。務(wù)必仔細(xì)檢查使用過的儀器、器材，確定離心機電源關(guān)閉，水浴鍋鍋蓋改好，顯微鏡已關(guān)閉，最后應(yīng)清理桌面，保持實驗室整潔干凈，垃圾桶快滿時注意將垃圾帶走并換上新的垃圾袋；9. 酒精噴壺、酒精燈中酒精快用完時，注意及時補充，尤其是酒精燈。第4章 細(xì)胞培養(yǎng)4.1 細(xì)胞培養(yǎng)注意事項1. 打開生

8、物安全柜紫外燈消毒30分鐘以上，開啟安全柜前玻璃面板，至少運行風(fēng)機10分鐘以上，保證氣流穩(wěn)定；2. 提前將培養(yǎng)液置于37水浴鍋加熱（注意不要被紫外線照射以防破壞營養(yǎng)成分）。若舊培養(yǎng)液耗盡，則應(yīng)立即在新培養(yǎng)液的容器上標(biāo)注使用人的姓名；加熱時間不宜過長，達(dá)到室溫即可；3. 對雙手消毒后打開培養(yǎng)箱，將培養(yǎng)瓶瓶蓋旋緊后取出樣品并放入安全柜，標(biāo)記傳代次數(shù)，將加熱至室溫的培養(yǎng)液取出，并用酒精擦拭消毒（注意不要擦拭有字區(qū)域）后放入安全柜。4.2 培養(yǎng)液成分1. HL-60細(xì)胞所采用的全培養(yǎng)基成分為89%RPMI-1640、10% FBS和1% 雙抗（青霉素/鏈霉素）；2. HeLa細(xì)胞所采用的全培養(yǎng)基成分為

9、84%DMEM、15% FBS和1% 雙抗（青霉素/鏈霉素）。4.3 細(xì)胞復(fù)蘇1. 將細(xì)胞從液氮中的凍存盒取出，用鑷子夾著凍存管置于37水浴中，不?；蝿觾龃婀埽ūM量避免凍存管封口處浸入水中，以防細(xì)胞被污染），使其快速完全融化，得到細(xì)胞懸浮液；2. 用移液槍將細(xì)胞懸浮液吸出放入離心管中1.5ml，15ml離心管都行，用15ml多加培養(yǎng)液，可將DMSO去除更干凈），加入適量（的培養(yǎng)液并混勻，然后進(jìn)行離心去除懸浮液中的DMSO，設(shè)定離心轉(zhuǎn)速800r/min左右，離心4分鐘左右；3. 棄去離心管中上層含DMSO的凍存液，一般加入新培養(yǎng)基45ml（根據(jù)培養(yǎng)瓶和或培養(yǎng)皿的容積確定），混勻，然后移入培養(yǎng)容器

10、中。注意：如果細(xì)胞存活率不高，可嘗試先加入適量新培養(yǎng)液直接培養(yǎng)，一天后再換新培養(yǎng)液，根據(jù)實驗結(jié)果來看，剛解凍細(xì)胞對離心較敏感。4.4 細(xì)胞傳代4.4.1 懸浮細(xì)胞傳代1. 用5mL移液槍吸走4/5的細(xì)胞懸浮液（大約為4ml）；2. 換新槍頭，加入與吸走懸液相同量的新培養(yǎng)液；3. 用移液槍混勻，放入培養(yǎng)箱；注意：如果需要精確傳代，則需對細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)，然后保留所需數(shù)目的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。4.4.2 貼壁細(xì)胞傳代1. 用舊液體輕輕沖洗培養(yǎng)瓶底，然后用移液器槍吸盡舊培養(yǎng)液（棄去）；2. 加入2ml左右 PBS，輕輕搖晃，然后同樣用移液槍吸掉PBS（用PBS是為清洗掉舊培養(yǎng)液中的血清，因為血清可抑制胰酶

11、的活性，后面也是采用含血清新培養(yǎng)液終止胰酶消化的）；3. 加入約0.6ml1ml胰酶（為常規(guī)5ml的培養(yǎng)瓶和5ml培養(yǎng)皿的用量，沒有明確限制，只奧胰酶能潤濕所有細(xì)胞即可），室溫或放置45分鐘，培養(yǎng)箱中放置12分鐘（放置于顯微鏡下觀察，細(xì)胞變圓時就可以終止消化）；4. 加入約1ml2ml培養(yǎng)基（含有小牛血清）終止消化；5. (a) 如終止消化后，大部分細(xì)胞還貼壁，則可直接吸走胰酶和培養(yǎng)液的混合物，然后加入適量新培養(yǎng)液，然后將細(xì)胞和培養(yǎng)液混合均勻，取適量到新培養(yǎng)瓶/皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。(b) 如終止消化后，大部分細(xì)胞已脫落到胰酶和培養(yǎng)液的混合液中，則需進(jìn)一步將細(xì)胞吹離瓶壁，混合均勻，然后取適量細(xì)胞懸到

12、離心管中進(jìn)行離心800 1000r/min，53分鐘，然后離心管中上清液去除，加入新培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹打重懸。取適量到新培養(yǎng)瓶/皿中，繼續(xù)培養(yǎng)；6. 傳代結(jié)束后，對雙手、前臂及培養(yǎng)瓶消毒后，將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱內(nèi)并旋松瓶蓋，確保培養(yǎng)瓶透氣。4.5 細(xì)胞凍存1. 重復(fù)細(xì)胞傳代中消化細(xì)胞的步驟，將細(xì)胞通過胰酶消化下來，同樣加入適量含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液終止胰酶消化，然后用移液槍將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，設(shè)定離心機轉(zhuǎn)速1000r/min左右，離心3分鐘左右，去除上層培養(yǎng)液，留下底部白色細(xì)胞團(tuán)；2. 細(xì)胞團(tuán)中加入凍存液（90%完全培養(yǎng)液+10%DMSO，較敏感細(xì)胞可用90%FBS +10%DMSO。加DMSO是為防止

13、細(xì)胞被冰晶刺破，用FBS取代完全培養(yǎng)液是為減少水分），用移液槍輕輕吹打制成細(xì)胞懸液；3. 分轉(zhuǎn)到凍存管內(nèi)，1.8ml的凍存管每個可加入1.2至1.5ml，將凍存管口封嚴(yán)，貼上標(biāo)簽，注明凍存時間、細(xì)胞種類及代數(shù)；4. 按下列順序降溫，并最終凍存：室溫、4 冰箱放置30min 、 -20冰箱放置 2h 、-70冰箱過夜（我們無此溫度冰箱，放在液氮表面8h至16h代替）、投入液氮。注意：準(zhǔn)備凍存的細(xì)胞，最好是對數(shù)期生長的細(xì)胞，一般取細(xì)胞鋪滿底部70%左右時可消化凍存，等細(xì)胞鋪滿底部時，細(xì)胞通常不是最佳狀態(tài)。懸浮細(xì)胞可在常規(guī)換液前幾小時操作。第5章 主要設(shè)備操作說明5.1 安全柜使用說明1. 向上推動

14、打開玻璃窗（不要超過面表上標(biāo)記的刻度）；2. 大概2分鐘后風(fēng)速穩(wěn)定（控制面板上風(fēng)速不變化），再進(jìn)行操作，如果在打開玻璃窗之前紫外燈是打開的，則最好多等幾分鐘，以使紫外光產(chǎn)生的臭氧被排出；3. 實驗操作完成后，用酒精擦拭臺面；4. 關(guān)閉玻璃窗，設(shè)定紫外燈開啟時間。注意：實驗操作過程中，如果袖子或其它物體遮住過濾網(wǎng)，安全柜會警告風(fēng)速不穩(wěn)定，盡量避免出現(xiàn)這種情況。進(jìn)一步詳細(xì)操作可參考安全柜說明書。5.2 培養(yǎng)箱使用說明1. 打開培養(yǎng)箱之前現(xiàn)在手上和門把手處噴上酒精；操作時不要和周圍的人交談以防口中細(xì)菌進(jìn)入培養(yǎng)箱；2. 斷電后，待溫度上升到37度，再設(shè)定二氧化碳的濃度為5%，否則二氧化碳傳感器不準(zhǔn)確。

15、進(jìn)一步詳細(xì)操作見培養(yǎng)箱說明書。5.3 顯微鏡使用說明每次使用的開始和結(jié)束時間需精確登記，尤其是關(guān)閉汞燈的時刻，具體的使用操作見顯微鏡使用說明。操作步驟如下：一、明場觀察1接通電源線，打開電源開關(guān)（“”為開，“”為關(guān)），同時按下顯微鏡前面的按紐（有燈泡）；2用光路選擇桿選擇“觀察”光路（有眼睛圖形），選擇所需放大倍數(shù)的物鏡，并將選擇環(huán)置于相應(yīng)的位置，使用光調(diào)節(jié)旋鈕和濾光片，調(diào)節(jié)至適當(dāng)亮度；3將標(biāo)本放在載物臺上，轉(zhuǎn)動粗微調(diào)調(diào)節(jié)視野內(nèi)圖象清晰；4調(diào)節(jié)目鏡使觀察舒適；5如需拍照，則打開電腦，選擇所需軟件，將光路桿調(diào)至“旁路光口”（有相機圖形），即可拍攝并保存；6使用完畢后，關(guān)閉主開關(guān)（至O），取下電源

16、插頭。二、DIC觀察1.打開明場電源開關(guān)（“”為開，“”為關(guān)）；2.將樣品置于載物臺上，用樣品夾夾好；3.將起偏器、檢偏器、DIC棱鏡推入光路，熒光濾塊轉(zhuǎn)盤撥到“1”位置，DIC棱鏡應(yīng)與相應(yīng)的物鏡倍數(shù)相匹配；4.先選用低倍物鏡（“10×”）；5.調(diào)節(jié)透射光的強度，調(diào)節(jié)焦距，找到視野；6.換到高倍鏡頭，觀察樣品，DIC觀察時，光路選擇拉桿拉到中間位置，既可觀察，也可拍照。三、熒光觀察1.如使用熒光，打開熒光光源，此時最好關(guān)閉明場光源。將熒光光路shutter打開（“”為開，“”為關(guān)），需保護(hù)樣品時關(guān)閉shutter；2.選擇所需波段的熒光，并用熒光調(diào)節(jié)桿調(diào)節(jié)亮度；3.從低倍鏡開始觀察，

17、調(diào)焦，找到預(yù)觀察視野，依次換到高倍鏡頭，觀察樣品；4.不觀察時，要及時使用光柵切斷熒光（關(guān)，開），避免樣品熒光衰減，如熒光較暗，將周圍光亮度減至最低（關(guān)燈，拉上窗簾）；5.拍攝步驟同普通明場觀察。四、軟件功能簡介1.圖像疊加、自動定時拍攝（ISO=200時比較清晰）；2.比例尺設(shè)定（可設(shè)定標(biāo)尺的參數(shù)）；3.可調(diào)節(jié)背景光顏色以達(dá)到白平衡，從而得到真實標(biāo)本顏色；4.調(diào)節(jié)曝光時間可改變得到圖像的亮暗程度。注意事項1.光纖不能大角度彎曲以免折損；2.在使用完畢關(guān)機時,將鏡體電壓調(diào)至最低, 即保證光的強度最弱才可關(guān)閉電源，防止重新開機時電壓高而燒壞燈炮；3.不要頻繁開關(guān)電源;為了延長汞燈使用壽命,請在打

18、開電源后15分鐘之內(nèi)不要關(guān)電源,第二次重新開機間隔時間最少10分鐘;同時建議汞燈每次使用不超過2小時；4.電腦主機機箱后面插著的類似U盤的器件，不要拔掉（那不是U盤?。?.對于光源的控制也要注意，轉(zhuǎn)動光強調(diào)節(jié)鈕時切忌小心，不可太過，以防損壞；6.使用完畢后一定要將物鏡置于載物臺下方，保持清潔。這一步可以通過轉(zhuǎn)動三孔轉(zhuǎn)換器實現(xiàn)；不要隨意拆散物鏡；7.對目鏡、物鏡、聚光鏡等光學(xué)部件的表面有灰塵時,應(yīng)先用吹氣球吹,再用棉簽蘸清潔液擦拭,方法是由內(nèi)向外螺旋型擦拭，清潔液建議使用70%乙醚和30%無水酒精混合液；同時注意不要隨意擦拭熒光激發(fā)塊；8.將鏡頭轉(zhuǎn)到低倍鏡，取出樣品，若使用過油鏡用干凈的擦鏡紙擦拭鏡頭；9.載玻片不同厚度時，需要轉(zhuǎn)動物鏡上的校正環(huán)才能得到最清晰圖像。5.4 滅菌鍋使用說明1. 打開電源按鈕（前面板右上方）；2. 一手按住頂蓋靠身體