熒光定量PCR技術(shù)ppt課件

1、SYBR Green I SYBR Green I 任務(wù)原理任務(wù)原理未結(jié)合的SYBR green I結(jié)合解離曲線識(shí)別不同的PCR產(chǎn)物95 15sec; 60 20sec; 95 15sec在60 95 之間的Ramp time設(shè)為19:59SYBR Green ISYBR Green I的特點(diǎn)的特點(diǎn)可以用于不同的模板運(yùn)用方便，價(jià)錢相對(duì)廉價(jià)靈敏度很高與非特異性產(chǎn)物結(jié)合解離曲線選擇良好的引物和探針并優(yōu)化反響條件 TaqMan Probes熒光素淬滅劑 與目的序列互補(bǔ)FAMTETJOEHEXVIC TAMRA DABCYL TaqMan Probes任務(wù)原理探針與目的序列配對(duì)時(shí) ，發(fā)生 FRET能量

2、轉(zhuǎn)移Taq游離的探針熒光基團(tuán) 淬滅劑 延伸時(shí)，Taq酶水解探針，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分別而發(fā)出熒光，構(gòu)成熒光信號(hào) Taq發(fā)出熒光光另一波長的熒光 隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的添加，TaqMan探針釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系 TaqMan探針運(yùn)用基因檢測(cè)、病毒定量、細(xì)胞因子基因定量、癌細(xì)胞基因微突變檢測(cè)等 其結(jié)果都具有高特異性與高敏感性 但只適宜于一個(gè)特定的目的TaqMan MGB探針 熒光素非熒光淬滅基團(tuán)與目的序列互補(bǔ)MGB(Minor Groove Binder)將探針的Tm值提高10因此，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)得更短，既降低了合本錢錢，

3、也使得探針設(shè)計(jì)的勝利率大為提高。TaqMan MGB探針對(duì)于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。分 子 信 標(biāo) (發(fā)夾型雜交探針)熒光基團(tuán)莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成環(huán)與目的序列互補(bǔ) 環(huán)15-30bpFAM Texas Red 分 子 信 標(biāo) 工 作 原 理探針雜交到DNA模板光發(fā)出熒光熒光基團(tuán)DNA 模板環(huán)光淬滅 分子信標(biāo)能特異性地檢測(cè)感興趣的目的DNA 分子信標(biāo)可用于單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè) 特別適用于檢測(cè)點(diǎn)突變 只能用于一個(gè)特定的目的 設(shè)計(jì)困難 價(jià)錢較高常常 用用 的的 熱熱 循循 環(huán)環(huán) 儀儀 Company PCR systemSample formatMax sample numberAppl

4、ied Biosystems ABI Prism 7700 SDSGeneAmp 5700 SDSABI Prism 7900 HT SDSMicroplateTubesMicroplateTubesMicroplate969696, 384Bio-Rad www.bio-iCycler iQMicroplateTubes9696Cepheid Smart CyclerTubes16Corbett Research Rotor-GeneTubesStrip tubes3272Roche Molecular Biochemicals LightCyclerCapillaries32ABI Prism 7700o可以在同一反響體系中同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因分子進(jìn)展擴(kuò)增o一次可以測(cè)定96個(gè)樣本，并且速度較快，一批樣本的完成只需求