應(yīng)用“規(guī)?？s小模型”對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行定性研究

1、 應(yīng)用“規(guī)?？s小模型”對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行定性研究一、 過(guò)程定性研究及其意義在生物制藥領(lǐng)域開(kāi)發(fā)商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)工藝，通常在完成小試和中試后，就需要對(duì)生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行定性研究。只有獲得充分的過(guò)程定性研究的數(shù)據(jù)，人們才能對(duì)商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行全面、深入的認(rèn)識(shí)，最終達(dá)到規(guī)避投資風(fēng)險(xiǎn)的目的。從工藝開(kāi)發(fā)的時(shí)間先后順序來(lái)看，過(guò)程定性研究銜接著后期的工藝驗(yàn)證，產(chǎn)品報(bào)批。一般在藥物進(jìn)入臨床II期研究，產(chǎn)品開(kāi)始進(jìn)行商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的時(shí)候，過(guò)程定性研究就要啟動(dòng)（如下圖所示）。這部分工作至少需要1215個(gè)月。完成過(guò)程定性研究工作后，才能開(kāi)展的工藝放大，技術(shù)轉(zhuǎn)移和工藝驗(yàn)證等后續(xù)工作。過(guò)程定性（process character

2、ization）是對(duì)生物制藥生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)的研究，旨在建立具有較強(qiáng)穩(wěn)健性（魯棒性，robust），柔順性（compliance）的生產(chǎn)工藝，滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)對(duì)工藝開(kāi)發(fā)的要求。這部分工作包括，對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行預(yù)先的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，研究過(guò)程操作參數(shù)對(duì)性能指標(biāo)的影響, 區(qū)分關(guān)鍵參數(shù)與非關(guān)鍵參數(shù)，確定操作參數(shù)的控制范圍,了解各操作參數(shù)之間的交互作用等。進(jìn)行過(guò)程定性研究，如果在實(shí)際生產(chǎn)規(guī)模上進(jìn)行試驗(yàn)，不僅成本昂貴，而且不具操作性。目前主要采用“規(guī)模縮小模型”（sale down model），在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)利用小型化生物反應(yīng)器完成過(guò)程定性研究?？梢詮倪@兩個(gè)圖中選一個(gè)二、利用“規(guī)?？s小模型”進(jìn)行過(guò)程定性研究

3、在實(shí)驗(yàn)室里利用“規(guī)?？s小模型”完成商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)過(guò)程定性研究，需要遵循嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的程序。首先，要對(duì)以往批次數(shù)據(jù)的進(jìn)行充分的挖掘、分析，在此基礎(chǔ)上，完成生產(chǎn)過(guò)程的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，根據(jù)各操作參數(shù)對(duì)過(guò)程性能指標(biāo)的影響程度，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)先級(jí)別排序，。建立能夠充分模擬大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程的“規(guī)?？s小模型”。在驗(yàn)證該模型兩者的等效性后，利用該模型進(jìn)行因子篩選試驗(yàn)，確定不同操作參數(shù)對(duì)性能指標(biāo)的影響，找出整個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵參數(shù)，確定其控制范圍。研究各參數(shù)之間的交互作用，避免最差情況的發(fā)生。此外，還需要進(jìn)行過(guò)程冗余性試驗(yàn)等工作。整個(gè)流程如下圖。2.1 數(shù)據(jù)挖掘和過(guò)程風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估在進(jìn)行過(guò)程定性研究之前，首先需要對(duì)以往批次數(shù)據(jù)進(jìn)行充分的挖

4、掘分析。在此基礎(chǔ)上，對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的不同環(huán)節(jié)（培養(yǎng)基、種子鏈及生產(chǎn)期）進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，這其中包括：潛在風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生嚴(yán)重程度，風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生的幾率，風(fēng)險(xiǎn)是否具有可檢測(cè)性等。通常使用危害分析與關(guān)鍵點(diǎn)控制(HACCP) 、失敗模式和影響分析（Failure mode and effects analysis）、因果圖（cause-and-effect diagrams）等工具對(duì)以上過(guò)程要素進(jìn)行的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。這其中，F(xiàn)MEA是利用數(shù)字（1到10）對(duì)過(guò)程風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行量化分級(jí)。MPN是綜合評(píng)價(jià)風(fēng)險(xiǎn)的嚴(yán)重程度，發(fā)生的幾率，以及風(fēng)險(xiǎn)是否具有可檢測(cè)性進(jìn)行綜合評(píng)判。下圖為在FMEA分析中各優(yōu)先級(jí)別所代表的意義。2.2 建立“規(guī)?？s小模

5、型”及其“等效性”驗(yàn)證進(jìn)行過(guò)程定性研究，首先需要建立一個(gè)能夠充分反映商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程特點(diǎn)的“規(guī)?？s小模型”。該模型能夠在參數(shù)評(píng)價(jià)，工藝開(kāi)發(fā)中，起到模擬商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的效果。當(dāng)然，建立好一個(gè)“規(guī)?？s小模型”后，需要對(duì)其的“等效性”進(jìn)行驗(yàn)證。開(kāi)展此工作的流程如下圖，首先確定需要進(jìn)行規(guī)?？s小的操作參數(shù)，找出其中的關(guān)鍵參數(shù)，確定參數(shù)的可以接受的變化范圍。進(jìn)行規(guī)?？s小模型試驗(yàn)，判定該模型是否與其代表的大規(guī)模培養(yǎng)工藝具有等效性。 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程參數(shù)及其規(guī)模縮小策略細(xì)胞培養(yǎng)所涉及到的參數(shù)在進(jìn)行規(guī)?？s小時(shí)，根據(jù)其縮小策略的不同，通常可以分為兩類。一類與體積密切相關(guān)的，如工作體積、流加體積，攪拌和通氣。

6、一類是獨(dú)立于體積的參數(shù)，如pH、溶氧和溫度。對(duì)過(guò)程參數(shù)進(jìn)行規(guī)模進(jìn)行體積縮小時(shí)，非體積依賴型參數(shù)保持不變，體積依賴型參數(shù)則按照培養(yǎng)體積縮小的比例，進(jìn)行線性遞減。但在實(shí)際工作中，受反應(yīng)器的幾何尺寸，液體的表面體積比，以及操作可控能力等因素影響，某些體積依賴參數(shù)如反應(yīng)器攪拌速率、通氣流量又不能簡(jiǎn)單的理解為線性遞減，應(yīng)該依據(jù)特定的公式（如下圖）進(jìn)行計(jì)算。體積非依賴型參數(shù)· 過(guò)程溫度· pH · 接種體積 (v/v) for each step · 流加策略 · 氧氣傳遞速率· 二氧化碳去除速率· 消泡策略體積依賴型參數(shù)·

7、培養(yǎng)基滅菌前后體積變化· 流加速率 · 空氣流量 · 氧氣流量 下圖是使用2L Applikon 生化反應(yīng)器模擬2,000L發(fā)酵罐時(shí)，各操作參數(shù)進(jìn)行規(guī)?？s小時(shí)所采取的策略。2.2.2 “規(guī)?？s小模型”的驗(yàn)證完成操作參數(shù)的規(guī)模縮小，建立了整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程的“規(guī)?？s小模型”后，就需要對(duì)此模型進(jìn)行驗(yàn)證，以判定該模型與其所代表的商業(yè)培養(yǎng)規(guī)模是否具有等效性。驗(yàn)證的方法是比較兩過(guò)程性能參數(shù)是否一致。據(jù)此來(lái)判定，建立的“規(guī)?？s小模型”是否成功。以下細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的性能指標(biāo)常被用來(lái)當(dāng)做判定的依據(jù)。l 細(xì)胞生長(zhǎng)情況可以通過(guò)比較生長(zhǎng)曲線，或者直接比較細(xì)胞比生長(zhǎng)速率，來(lái)考察不同培養(yǎng)規(guī)模下細(xì)胞

8、的生長(zhǎng)情況。這部分工作也可以通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液光密度、固形物體積，細(xì)胞干重、細(xì)胞濕重等方法進(jìn)行。模擬效果好的“規(guī)模縮小模型”可以與大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程具有相同的細(xì)胞比生長(zhǎng)速率和細(xì)胞得率。l 氧氣消耗比較細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的溶氧曲線，或者使用質(zhì)譜或離線氧氣分析儀，比較規(guī)模縮小模式與大規(guī)模培養(yǎng)模式的氧氣攝入速率。l 表達(dá)水平和產(chǎn)品質(zhì)量通過(guò)計(jì)算產(chǎn)物比生成速率，或直接測(cè)量培養(yǎng)液中的產(chǎn)物滴度，來(lái)比較不同培養(yǎng)規(guī)模下，細(xì)胞表達(dá)水平的變化。此外還需要考慮產(chǎn)物自身質(zhì)量，如糖基化水平，C端序列變異，是否在規(guī)?？s小后有所變化。l 營(yíng)養(yǎng)成分的消耗測(cè)定營(yíng)養(yǎng)成分（如葡萄糖）的消耗，代謝產(chǎn)物（氨基酸、乳酸等）的積累也是驗(yàn)證“規(guī)模縮小模型

9、”等效性的重要考察方面。細(xì)胞內(nèi)部的代謝水平會(huì)因?yàn)榄h(huán)境的微小變化而波動(dòng)，不同規(guī)模下培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分、產(chǎn)物濃度會(huì)有所不同，但是對(duì)細(xì)胞而言，其營(yíng)養(yǎng)成分的比消耗速率，代謝產(chǎn)物的比生成速率在規(guī)?？s小后應(yīng)該保持一致。下圖為利用2L Applikon 生化反應(yīng)器模擬2,000L發(fā)酵罐時(shí)，驗(yàn)證兩者過(guò)程等效性的試驗(yàn)結(jié)果。如圖所示，該“規(guī)?？s小模型”在培養(yǎng)體積減少一千倍后，細(xì)胞的生長(zhǎng)情況、氧氣消耗、代謝情況、表達(dá)水平。產(chǎn)物質(zhì)量等方面保持一致。這表明，該“規(guī)?？s小模型”與實(shí)際商業(yè)生產(chǎn)規(guī)模具有過(guò)程等效性。因此，可以利用該模型進(jìn)行過(guò)程定性研究。2.3 因子篩選試驗(yàn)前文所述的FMEA或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可以確定對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量和收率影響

10、較小的非關(guān)鍵因素。而這里所說(shuō)的因子篩選試驗(yàn)，則是進(jìn)一步排除非關(guān)鍵因素。因子篩選試驗(yàn)不能確定個(gè)因素之間的交互作用，但是可以找出對(duì)性能指標(biāo)影響較大的操作參數(shù)，確定參數(shù)的控制范圍。進(jìn)行因子篩選試驗(yàn)一般可以采用單因子試驗(yàn)的方法。也就是固定其他操作參數(shù)設(shè)定值，通過(guò)變化待考察操作參數(shù)的設(shè)定值，來(lái)對(duì)此參數(shù)的重要性進(jìn)行考察。雖然這種方法比較繁瑣，但是卻是最簡(jiǎn)單明了的試驗(yàn)方法。下圖為利用前文已經(jīng)驗(yàn)證的“規(guī)?？s小模型”2L Applican 反應(yīng)器，進(jìn)行DO，pH單因素考察試驗(yàn)的結(jié)果。從圖中可以確定次高的DO值能提高細(xì)胞密度、活性。同時(shí)也可以提高培養(yǎng)液中產(chǎn)物的滴度。在考察的pH范圍內(nèi)，pH本身對(duì)細(xì)胞生產(chǎn)以及表達(dá)影響不大，但是較高的pH會(huì)造成高糖基化異構(gòu)體含量提高。通過(guò)單因素考察試驗(yàn)，可以確定細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的關(guān)鍵參數(shù)為接種密度，pH，溫度和溶解氧。至于者四個(gè)參數(shù)進(jìn)行不同組合時(shí)，對(duì)性能指標(biāo)造成的影響，則需要進(jìn)行下面的“因子交互作用研究”才可以明了。2.4 因子間交互作用的考察進(jìn)行因子交互作用考察時(shí)，操作參數(shù)的設(shè)定范圍一般為正常操作值的邊緣。根據(jù)待考察變量數(shù)目的多少，可以選用完全析因試驗(yàn)、部分析因試驗(yàn)等方法。通常使用DOE進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。上圖為利用DOE進(jìn)行上述四個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，兩水平的交互試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因子交互試驗(yàn)