藥物代謝動力學(xué)綜述

1、干血點采樣和微透析技術(shù)在藥動學(xué)研究中的應(yīng)用 摘要：藥動學(xué)研究過程中，傳統(tǒng)的取樣方法存在一定的缺陷，使新的方法應(yīng)運而生，干血點采樣技術(shù)和微透析技術(shù)就是其中兩個。本文就它們的原理、目前在藥動學(xué)方面的應(yīng)用現(xiàn)狀、優(yōu)點與不足之處作概述。關(guān)鍵詞：干血點采樣 微透析技術(shù) 藥動學(xué)進行藥動學(xué)研究通常需要從生物體采集大量的全血（臨床前試驗每個時間點通常采集 100500l，臨床試驗 15 ml）以獲得足夠的血漿用于生物定量分析。應(yīng)用傳統(tǒng)的方法，在臨床前試驗中，每只動物只能獲得一定體積的全血，如果用血量大，則需要將多只動物的血樣混合，這往往導(dǎo)致藥動學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性下降，而且對動物的需求量增加。另外，血漿的處理要使用固

2、相萃取、液液萃取或者蛋白沉淀等方法，這些步驟耗時耗力，限制了檢測通量和樣品檢測數(shù)量。最后，血樣的運輸和儲存也存在實質(zhì)上的困難，運輸以及儲存過程需要凍存并妥善處理。由此可見，研究新的采樣方法對藥動學(xué)的研究有著不容忽視的意義。本文就兩種非傳統(tǒng)采樣方法進行綜述。1.干血點采樣技術(shù)干血點采樣（dried blood spot，DBS），即將全血樣品收集在卡紙上，作為一種采集生物樣品的新型替代技術(shù)，在血樣采集方法上比傳統(tǒng)方法有一定的優(yōu)勢。它需求較少的血量（通常小于 100 L），可減少動物使用，方便血樣采集、存儲運輸，簡化樣品前處理。特別適合小動物的連續(xù)樣品采集。有關(guān)DBS樣品采集、干燥、儲存和運輸、前

3、處理等方面的綜述如下：1.1 DBS 樣品采集方法1.1.1 DBS 采樣卡FTA 和 FTA Elute 卡，可用于 DBS 采樣，兩種卡通過適宜的化學(xué)試劑處理后，具備溶解細胞，使蛋白變性，并且抑制細菌等其他微生物生長的功能。1.1.2 DBS 樣品采集過程 在臨床前研究中，小動物（如小鼠、大鼠）可以從尾部采血。血樣可直接滴到采樣卡的圓圈內(nèi)，應(yīng)避免直接接觸到卡紙，尤其是在采樣前和血樣未干燥前。還應(yīng)避免凝血、分層以及過飽和等情況的發(fā)生。血樣應(yīng)均勻分布在圓圈內(nèi)，采樣卡兩側(cè)血樣的顏色應(yīng)保持一致。如果樣品被污染，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象或者采樣體積不夠，均為不合格的采樣。也可以使用加樣槍將血樣點到采樣卡上，這樣

4、可避免潛在的血細胞比容差異、采血量的影響、血樣在采樣卡上分布不均勻等采樣錯誤。加樣槍頭應(yīng)距離采樣卡若干毫米，當(dāng)血樣碰觸到卡時會迅速分散開，使血樣在卡上分布均勻。1.2 DBS 樣品干燥、儲存和運輸方法 在儲存和運輸前將 DBS 樣品充分干燥是十分重要的。一般而言，在室溫開放環(huán)境（1522 ）下，干燥時間至少為 23 h。干燥時間取決于采樣卡的類型以及采血量的多少。樣品不應(yīng)該加熱、重疊放置或者接觸其他表面，需要的話應(yīng)避免陽光直射。潮濕可能引起細菌生長，改變提取效率或者促進不穩(wěn)定分析物的降解，從而導(dǎo)致血樣的分析質(zhì)量下降。因此在干燥之后，為避免 DBS 樣品接觸水分或濕氣，可用紙覆蓋 DBS 樣品并

5、裝進含有干燥劑的封口袋里，另外，包裝袋內(nèi)應(yīng)含有濕度指示劑。通過這種方式包裝的 DBS 樣品可在室溫下儲存數(shù)周至數(shù)年。如果樣品含有不穩(wěn)定的化合物，則應(yīng)儲存在低溫環(huán)境（28 、15 或60 ）。按照上述方法包裝的 DBS 樣品可通過郵寄方式運輸，在此期間不需考慮血樣暴露或者傳染性物質(zhì)等問題。1.3 DBS 樣品前處理方法1.3.1 打孔位置的選擇 為考察全血在 DBS 卡上的分布情況，根據(jù)干血點的直徑大小，選擇中心及邊緣位置打孔得到相同尺寸的濾紙片，處理后進行樣品分析，隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線測定其濃度。研究表明，打孔位置會直接影響DBS 樣品定量分析的結(jié)果。如果點卡體積小而打孔面積大，那么所測結(jié)果的精密度會

6、比較好；如果點卡體積大而打孔面積小，那么所測結(jié)果的精密度會比較差，原因可能是卡紙成分的干擾。唯一能精確地對待測物進行定量分析的方法為點卡體積完全相同，從卡上取下所有的血點。1.3.2 離線提取 在定量分析中，從 DBS 卡上打下一個或多個一定直徑的圓片放入分析試管或 96 孔微量滴定盤中進行提取。提取時通常加入一定量的含有內(nèi)標(biāo)的提取溶劑（甲醇、乙腈或者一定比例的水-有機溶劑混合物）。選擇合適的提取溶劑破壞基質(zhì)或濾紙里分析物與蛋白的結(jié)合，并通過振蕩或者渦旋等方式將分析物洗脫下來，渦旋時間一般為 2060 s，必要時也可采用超聲處理來提高提取效率。離心之后，提取物手動或自動轉(zhuǎn)移到試管或微量滴定盤中

7、直接進樣，或者吹干后用流動相復(fù)溶進樣。1.3.3 在線提取 最近有報道關(guān)于 DBS 樣品的在線提取方法。該方法基于“inox cell”結(jié)構(gòu)，可以將濾紙片上的分析物洗脫下來，隨即導(dǎo)入 LC-MS 系統(tǒng)，從濾紙上釋出的分析物通過色譜分離后進入質(zhì)譜檢測。1.4 樣品穩(wěn)定性 根據(jù) DBS 的采樣情況，應(yīng)對分析物（以及代謝物）在室溫下不同介質(zhì)以及不同存放時間進行穩(wěn)定性考察，以確定 DBS 的存放條件和時間。具體的穩(wěn)定性試驗應(yīng)包括儲備液的穩(wěn)定性、樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性、分析物在全血中的穩(wěn)定性、含藥全血點樣后室溫放置的穩(wěn)定性、含代謝物全血點樣后室溫放置的穩(wěn)定性等。1.5總結(jié)相較于傳統(tǒng)的血漿采集方

8、法，在藥動學(xué)研究中使用 DBS 采集全血樣品具備了一定優(yōu)勢。但是作為一種新方法，DBS 法尚存在以下不足。測定結(jié)果的準(zhǔn)確性可能受點樣條件（工具、溫度、體積）影響；樣品量少，靈敏度不高；不適用于不穩(wěn)定的藥物（如易于氧化、酶解的藥物）。雖然 DBS 技術(shù)還處在開發(fā)期，有待完善，但其較一般樣品采集及處理方法顯示出的優(yōu)點使其在藥動學(xué)研究的應(yīng)用范圍越來越廣泛。2. 微透析技術(shù)2.1 基本原理 微透析技術(shù)可在基本不干擾生物體正常生命過程的情況下進行在體、實時和在線取樣與檢測。其原理是基于物質(zhì)自由擴散，將具有一定孔徑的纖維半透膜制成探針（probe）植入待測的組織內(nèi)，以恒定速度向探針內(nèi)灌流與組織成分相似的等

9、滲灌流液。當(dāng)灌流液流經(jīng)探針的頂端時，組織內(nèi)小分子量生物活性物質(zhì)即順濃度梯度從膜外擴散至膜內(nèi)，并隨灌流液被引流至探針外，按一定的時間間隔連續(xù)收集透析液，用現(xiàn)檢測儀器檢測其中待測生物活性物質(zhì)水平，可監(jiān)測該區(qū)域內(nèi)細胞外生物活性物質(zhì)濃度的經(jīng)時變化過程。2.2 系統(tǒng)組成微透析系統(tǒng)的組成主要分為四個部分，微注射泵、微透析探針、微收集器以及連接這些部分的導(dǎo)管。其中最主要的部分是微透析探針。微透析探針有多種類型，同心圓型的探針是現(xiàn)在應(yīng)用最為廣泛的探針。這種探針是一種頂端連有半透膜的同心圓型套管，主要應(yīng)用于腦內(nèi)微透析實驗。除了同心圓形探針外還有柔性探針、線性探針、分流探針等，每種探針?biāo)鶓?yīng)用的條件是不同的，在實驗

10、時需要根據(jù)實驗的具體要求來選擇不同類型的探針進行實驗。2.3 技術(shù)特點 微透析方法與傳統(tǒng)的方法相比，主要具有以下幾個方面的特點： （1）微透析技術(shù)可以實時監(jiān)測目標(biāo)化合物在體內(nèi)的分布以及多種化合物在靶器官內(nèi)的濃度隨時間變化的趨勢。這就為研究藥物在體內(nèi)的分布、吸收、代謝及排泄過程提供了有力的手段。 （2）微透析技術(shù)既可以在麻醉動物身上取樣，也可以在自由活動的清醒動物身上取樣，且對動物的組織損傷小，能從同一動物收集大量的樣本而不損失體液量，從而避免了傳統(tǒng)研究方法中因采血后血容量減少所造成的對藥物分布及消除的影響。微透析技術(shù)方法應(yīng)用于藥物代謝動力學(xué)的研究，減少了實驗動物的使用量，排除了個體差異對實驗結(jié)

11、果的影響（在同一只動物身上可以得到一套完整的藥動學(xué)參數(shù)），保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。 （3）微透析取樣技術(shù)所采集的樣本是不含蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的游離態(tài)小分子化合物，其結(jié)合現(xiàn)代檢測方法后，可以不經(jīng)過預(yù)處理直接進行分析，減少了樣品的損失和誤差，使得到的藥動學(xué)參數(shù)的可靠性和準(zhǔn)確性也相對較高。且由于蛋白質(zhì)無法通過微透析探針的半透膜，故不會因在室溫取樣而發(fā)生酶解反應(yīng)，提高了樣品的穩(wěn)定性。2.4微透析取樣技術(shù)在藥動學(xué)研究中的應(yīng)用2.4.1 微透析取樣技術(shù)在腦內(nèi)藥動學(xué)研究中的應(yīng)用 腦微透析技術(shù)采用了截留不同分子質(zhì)量物質(zhì)的透析膜制成微透析探針,利用腦立體定位儀將探針埋入指定的組織區(qū)域,將灌流液以一定速率泵入探針

12、進液管,腦細胞外液中的小分子生物活性物質(zhì)或藥物根據(jù)Fick's定律通過探針中具有一定孔徑的透析膜,順濃度梯度在細胞外液與灌流液之間擴散,隨著灌流持續(xù)進行,膜內(nèi)的灌流液隨時更新,膜兩側(cè)濃度梯度得以維持,因此小分子物質(zhì)可持續(xù)順濃度梯度擴散,以一定時間間隔收集探針流出液并采用高靈敏的分析技術(shù)進行定量分析,從而實現(xiàn)對腦特定部位細胞外液中生物活性物質(zhì)的動態(tài)監(jiān)測。由于物質(zhì)順濃度梯度跨膜運動可雙向進行,所以腦微透析技術(shù)除了用作動態(tài)監(jiān)測腦內(nèi)細胞外液的的生化改變,還可作為一種給藥途徑用于腦內(nèi)特定部位的給藥。微透析技術(shù)在測定藥物向腦內(nèi)分布和轉(zhuǎn)運具有明顯的優(yōu)勢，且微透析探針的剛性結(jié)構(gòu)適合于腦內(nèi)試驗，結(jié)合腦立

13、體定位儀可以準(zhǔn)確的定位到腦內(nèi)的各個分區(qū)，且具有很高的時間分辨率和空間分辨率。 腦微透析技術(shù)為研究腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)改變、特定部位細胞外液藥物濃度的監(jiān)測等提供了有效的技術(shù)支持。但作為一門新興的技術(shù),它仍存在一些問題,包括缺乏準(zhǔn)確易操作的探針回收率校準(zhǔn)方法和可滿足小體積、低濃度的靈敏的分析方法、微透析探針植入對腦內(nèi)環(huán)境的影響不確定、目前只能通過微透析技術(shù)采集小分子物質(zhì)、親脂性藥物易產(chǎn)生吸附、可重復(fù)使用性差導(dǎo)致成本高等,這些都限制了其在PK和PK/PD研究中更廣泛的應(yīng)用。2.4.2 微透析取樣技術(shù)在外周組織及血液藥動學(xué)研究中的應(yīng)用2.4.2.1皮膚 對皮膚及皮下脂肪組織的藥動學(xué)研究傳統(tǒng)的方法有起皰技術(shù)、

14、皮膚刮取術(shù)、膠帶剝離術(shù)等，但這些方法都無法反映皮膚局部藥物的吸收過程，且會出現(xiàn)皮膚變性、細菌生長等問題。DMD技術(shù)能進行在體原位檢測，對皮膚破壞??；可選擇性地采集非結(jié)合性藥物；可同時在多位點進行采樣。與此同時，DMD具有能同時采集外源性和內(nèi)源性化合物的特點，因此近年來，該技術(shù)在皮膚病生理機制及藥效機制研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，成為少數(shù)適合于研究皮膚藥動學(xué)進而評價經(jīng)皮制劑生物利用度和生物等效性的研究方法之一。2.4.2.2 眼 對眼藥的藥動學(xué)研究中微透析方法也能適用?？梢垣@得藥物在眼局部的吸收、分布及從眼部消除的資料。微透析法應(yīng)用于眼科藥代動力學(xué)研究中不僅能使實驗的準(zhǔn)確度更高，而且能節(jié)省實驗動物

15、，減少動物不必要的損失。2.4.2.3 膽 膽微透析技術(shù)是微透析技術(shù)的一種，是一門新興的"用途廣泛的技術(shù)，是將一種具有透析作用且充滿液體的微細探針置于膽管內(nèi)，與探針周圍組織進行物質(zhì)交換后測定其內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)含量的技術(shù)，能直接"有效地對膽汁中的藥物及其代謝產(chǎn)物濃度進行持續(xù)檢測，是藥物動力學(xué)研究的重要工具，具有不可替代的作用及廣闊的應(yīng)用前景。2.4.2.4 血液 藥動學(xué)分析方法最常用的方法是血藥濃度法。這種方法操作簡單，實驗技術(shù)含量小，但是會不斷的減少動物的體液，特別是對體型較小的動物，會使實驗受影響產(chǎn)生較大誤差。且取出的血液樣本要經(jīng)過預(yù)處理后才能進行分析，使得實驗結(jié)果受到影響。

16、微透析方法則不存在這些問題，將血液微透析探針直接放入動物的血管中，可以動態(tài)的檢測血藥濃度的變化，在長時間的取樣過程中，動物的體液量并不減少，可以在一只動物的體內(nèi)得到一套較完整的藥動學(xué)參數(shù)。且實驗動物可以自由活動，實驗過程可以長達數(shù)天。這樣既節(jié)約了實驗動物，又可以提高實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。2.3.總結(jié) 綜上所述，微透析技術(shù)是藥物代謝動力學(xué)研究的重要工具，與傳統(tǒng)取樣方法相比其不引起體液的損失，定位更加精確，在同一只實驗動物身上獲得資料更多，減少了個體差異對實驗結(jié)果的影響。隨著微透析探針在設(shè)計上的不斷改進，可以將微透析探針插入藥物作用的靶器官，以監(jiān)測藥物在靶器官中的濃度，從而更加準(zhǔn)確地為藥物在臨床上合理

17、使用提供科學(xué)依據(jù)。不可否認微透析技術(shù)還存在一些局限性。如：每個微透析探針的價格較高且只能使用一次、微透析探針的相對回收率較低、透析液量少、對分析儀器的靈敏度要求高，在臨床上使用較少，現(xiàn)基本只是應(yīng)用于藥物代謝動力學(xué)的基礎(chǔ)研究。然而，隨著微透析技術(shù)的發(fā)展和現(xiàn)代高精密度的分析儀器的不斷的出現(xiàn)，微透析技術(shù)在藥物代謝動力學(xué)方面的應(yīng)用前景將是不可估量的，會成為研究藥物代謝的常規(guī)實驗技術(shù)。3. 結(jié)語 干血點采樣和微透析技術(shù)在藥動學(xué)研究中具有不可替代的作用，但仍有不足之處，尚需繼續(xù)研究不斷改進完善。參考文獻：1. 劉勇,魏廣力,夏媛媛,肖淑華,司端運. 干血點采樣技術(shù)及其在藥動學(xué)研究中的應(yīng)用. Drug Ev

18、aluation Research 第 34 卷 第 5 期 2011 年 10 月 2.毛澤玲，馮健，李范珠. 膽微透析技術(shù)及其在藥學(xué)研究中的應(yīng)用. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊第30卷第1期2012年1月3.陳芳,胡晉紅,朱全剛. 微透析技術(shù)在皮膚藥動學(xué)研究中的應(yīng)用. 藥學(xué)服務(wù)與研究 2012年2月；12（1）4.何壽蕓. 微透析技術(shù)在抗精神失常藥物藥動學(xué)研究中的應(yīng)用.臨床合理用藥 2014年2月第7 卷第2A 期 5.鄧亞利,陳道陽,周莉玲.微透析采樣技術(shù)在抗乳腺癌藥物研究方面的應(yīng)用.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志2012年第32卷第4期6.方浩. 微透析取樣技術(shù)在藥動學(xué)方面的應(yīng)用. 科技信息7.韓文迪,王長連.

19、腦微透析技術(shù)及其在藥動學(xué)研究中的應(yīng)用. 海峽藥學(xué) 2011年 第23卷第5期8.李靜雅,朱 丹,劉建勛,林 力.皮膚微透析技術(shù)在藥動學(xué)及藥效學(xué)研究中的應(yīng)用進展. 中國藥房 2011年第22卷第30期9.張英豐，汪小根，吳陽，等. 微透析技術(shù)進行藥動學(xué)研究的發(fā)展趨勢及局限性探討J. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2011,17（15）：270-27310.李靜，潘國鳳，周英，等.微透析技術(shù)在靶組織局部藥物濃度監(jiān)測中的應(yīng)用J. 中國臨床藥理學(xué)雜志，2012,28（5）：396-39811.聶穎蘭，范斌，閆寒，等. 微透析與現(xiàn)代分析技術(shù)在線聯(lián)用的研究進展J. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2012,18(5):252-

20、25512.吉戀英，楊志宏，孫曉波.微透析技術(shù)在腦內(nèi)藥物代謝動力學(xué)及腦缺血研究中的應(yīng)用J.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012,18(12):303-30713.謝松梅 創(chuàng)新性皮膚局部外用藥物研發(fā)應(yīng)關(guān)注皮膚藥代動力學(xué)研究J 中國臨床藥理學(xué)雜志 2007,23(4):313-31514. 鄧亞利，陳道陽，周莉玲. 微透析技術(shù)在藥物局部藥動學(xué)研究中的應(yīng)用. 中國實驗方劑學(xué)雜志2011年12月第17卷第23期15.張巖，鄧蘭 皮膚藥動學(xué)研究進展 中國藥學(xué)雜志 2009 年 8 月第 44 卷第 16 期16.Peter Matzneller, William Couet, Patrice Gobin, Ma

21、rkus Müller, Markus Zeitlinger. Characterization of colistin tissue pharmacokinetics by microdialysis. Matzneller et al. BMC Pharmacology and Toxicology 2012, 13(Suppl 1):A7417.Richard J. Shannon，Keri L. H. Carpenter，Mathew R. Guilfoyle， Adel Helmy，Peter J. Hutchinson .Cerebral microdialysis in clinical studies of drugs :pharmacokinetic applications JPharmacokinetics Pharmacod