畢業(yè)論文（設(shè)計）-試論蛋白酶

1、青島農(nóng)業(yè)大學本科生畢業(yè)論文論文題目試論蛋門酶學生專業(yè)班級學生姓名(學號)(20093344)指導教師完成時間2011-8102011年 8月 10 日中文摘要:蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱。按其水解多肽的方式，可以將其分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩類。內(nèi)肽酶將蛋白質(zhì)分了內(nèi)部切 斷，形成分子量較小的月示和豚。外肽酶從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或 竣基的末端逐個將肽鍵水解，而游離出氨基酸，前者為氨基肽酶后者 為竣基肽酶。按其活性中心和最適ph值，乂可將蛋白酶分為絲氨酸 蛋白酶、疏基蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反應(yīng)的最 適ph值，分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。工業(yè)生產(chǎn)上 應(yīng)用的蛋白酶，

2、主要是內(nèi)肽酶。蛋白酶廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖 葉、果實和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、細菌，其次由酵 母、放線菌生產(chǎn)。催化蛋白質(zhì)水解的酶類。種類很多，重要的有胃蛋 白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。蛋 白酶對所作用的反應(yīng)底物有嚴格的選擇性，一種蛋白酶僅能作用于蛋 白質(zhì)分子中一定的肽鍵，如胰蛋白酶催化水解堿性氨基酸所形成的肽 鍵。蛋白酶分布廣，主要存在于人和動物消化道中，在植物和微生物 中含量豐富。由于動植物資源有限，工業(yè)上生產(chǎn)蛋白酶制劑主要利用 枯草桿菌、棲土曲霉等微生物發(fā)酵 關(guān)鍵詞： 蛋白酶、蛋白的提取方法、蛋白酶的純化方法、蛋白酶活性檢測目錄一、中文摘要、關(guān)

3、鍵詞2二、目錄3三、論文正文4（1）引言4（2）第一章蛋白酶的提取方法（3）第二章 蛋白酶的純化方法（5）第三章 蛋白酶的活性檢測方法（6）第四章蛋白酶的應(yīng)用前景，存在的問題10參考文獻11引言蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱。按其水解多肽的方式，可以將其 分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩類。內(nèi)肽酶將蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切斷，形成分子量較小的月 示和腺。外肽酶從蛋白質(zhì)分了的游離氨基或竣基的末端逐個將肽鍵水解，而游離 出氨基酸，前者為氨基肽酶后者為竣基肽酶。按其活性屮心和最適ph值，又可 將蛋口酶分為絲氨酸蛋口酶、筑基蛋口酶、金屬蛋口酶和天冬氨酸蛋口酶。按其 反應(yīng)的最適ph值，分為酸性蛋白酶、小性蛋白酶和堿性

4、蛋白酶。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng) 用的蛋白酶，主要是內(nèi)肽酶。蛋白酶廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實和微 生物中。微生物蛋白酶，主耍由霉菌、細菌，其次由酵母、放線菌生產(chǎn)。催化蛋 白質(zhì)水解的酶類。種類很多，重耍的冇胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜 蛋白酶和枯草桿菌蛋口酶等。蛋口酶對所作用的反應(yīng)底物有嚴格的選擇性，一種 蛋白酶僅能作用于蛋白質(zhì)分子屮一定的肽鍵，如胰蛋白iw催化水解堿性氨基酸所 形成的肽鍵。蛋白酶分布廣，主要存在于人和動物消化道中，在植物和微生物中 含量豐富。第一章 蛋白酶的提取方法口前已開發(fā)利用的植物蛋白卿主要有木瓜蛋白«( papain)、菠蘿蛋 白酶(bromelain)、生

5、姜蛋白酶 ginger protease, zingibain)等1,作 為食品添加劑，用于肉質(zhì)嫩化、啤酒澄清等。也可用于醫(yī)跖上，如菠蘿蛋口 酶可溶解纖維蛋白及血凝塊，可以治療水腫及多種炎癥2。我用羅漢果蛋 白酶的提取來說明蛋口酶的提取方法。蛋口酶的提取分離方法很多，如鹽 析法、層析法，還有電泳、超濾等技術(shù)3。1材料與方法1. 1材料與儀器羅漢果；所用試劑為國產(chǎn)分析純。752紫外光柵分光光度計、phs- 3c 精密ph計上海精密科學儀器有限公司；超濾器蠕動泵北京信康億達科技發(fā) 展有限公司；超濾膜(sum，328d, 30kda)北京圣萬泉膜分離設(shè)備有限公司; 冷凍干燥機吉林大學儀器技術(shù)發(fā)展公司

6、。1.2實驗方法1.2. 1羅漢果蛋白酶活力測定4酶活力單位定義：在規(guī)定條件下，lmin內(nèi)酶水解酪蛋口釋放出相當于1 ug/ml酪氨酸在 275nm波長處的吸收度為1個活力單位。1.2.2膜通量j的測定5用燒杯接濾過液，同時用秒表計時，用濾過液體積除以相應(yīng)時間表示。1.2.3羅漢果蛋白酶活力回收率的測定按各自工藝流程進行提取，最后進行真空冷凍干燥，所得酶粉的活力與所用羅漢 果果汁的總活力相比，即為其冋收率。1.2.4羅漢果蛋白酶的提取鮮羅漢果榨汁，離心(4000r/min, 20min)果汁。1.2.4. 1乙醇沉淀法用無水乙醇(-20°c)與100ml的羅漢呆汁配 成體積分數(shù)為30

7、%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇羅漢果汁溶液，混 勻，4°c放置30min,然后進行離心(4000r /min, 15min),收集沉淀， 真空中除去乙醇并冷凍干燥后，稱重，測定酶活，并用最佳乙醇濃度所捉得的產(chǎn)物的酶活數(shù)據(jù)計算酶活回收率。1. 2寧沉淀法各取羅漢果汁90ml,加入不同濃度的單寧溶液， 使溶液中單寧濃度分別為 0. 01%、0. 04%、0. 08%、0. 12%、0. 16%、0. 20%、 0.24%、0. 28%,然后進行離心(4000r/min, 15min),收集沉淀，冷凍 干燥，稱重，測定酶活，并用最佳單寧濃度所提得的產(chǎn)物的酶活數(shù)據(jù) 計算酶活

8、回收率。1. 4. 3超濾法超濾法提取羅漢果蛋口酶的方法為：羅漢果一洗 凈壓榨一靜置一汁液離心(4000r/min, 20min)-清液一超濾f濾 后酶漿一真空冷凍干燥一羅漢果蛋白酶粉。最佳操作壓力的的確定取7份相同體積的羅漢果汁，通過超濾 機壓力表控制壓力進行超濾，用秒表計算時間，測定不同壓力下濾出 濃汁的酶活力，并計算不同壓力下的膜通量j(ml/min)。最佳操作溫度的確定分別將相同體積的羅漢果汁在水浴鍋加熱 至不同溫度，然后在步驟".確的最佳恒定壓力下立即超濾，測定濾后 濃汁的酶活力，計算不同溫度卜的膜通量j(ml/min)。羅漢果汁濃度對膜通量的影響以步驟a確定的最佳恒定壓力

9、下 超濾羅漢果汁，將原羅漢果汁濃度定義為0,用燒杯接不同時間的濾出 清液，用濾出清液體積除以原羅漢果汁體積，代表當吋的羅漢果汁濃 度，同時計算膜通量，比較二者的關(guān)系。每次羅漢杲汁量對酶超濾的濃縮度的影響每次用不同量的羅漢 果汁進行超濾，測最后濾過液的量，用其除以每次所用羅漢果汁的量， 即為超濾的濃縮度(%) o第二章蛋白酶的純化方法生物細胞產(chǎn)生的酶有兩類：一類由細胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到細胞外進行作用的 酶，稱為細胞外酶。這類酶大都是水解酶，如酶法生產(chǎn)葡萄糖所用的兩種淀粉酶, 就是由枯草桿菌和根酶發(fā)酵過程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另 一類酶在細胞內(nèi)產(chǎn)生后并不分泌到細胞外，而在細胞內(nèi)起催化

10、作用，稱為細胞內(nèi) 酶，如檸檬酸、肌昔酸、味精的發(fā)酵生產(chǎn)所進行的一系列化學反應(yīng)，就是在多種 酶催化卜在細胞內(nèi)進行的，在類酶在細胞內(nèi)往往與細胞結(jié)構(gòu)結(jié)合，有一定的分布 區(qū)威，催化的反應(yīng)具冇一定的順序性，使許多反應(yīng)能冇條不紊地進行。酶的來源多為牛物細胞。生物細胞內(nèi)產(chǎn)生的總的酶量雖然是很高的，但毎一種酶 的含量卻很低，如胰臟屮期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別 很大。因此，在提取某一種酶時，首先應(yīng)當根據(jù)需要，選擇含此酶最豐富的材料，如唳 臟是捉取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于從動物內(nèi)臟或 植物果實中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本乂很大。目前工 業(yè)上大多采

11、用培養(yǎng)微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物屮來生產(chǎn)酶制劑 的優(yōu)點冇很多，既不受氣候地理條件限制，而且動植物體內(nèi)酶人都可以在微生物 中找到，微生物繁殖快，產(chǎn)酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產(chǎn)量，用廉 價原料可以大量生產(chǎn)。由于在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一 般蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)，因此為制取某酶制劑吋，必須經(jīng)過分純化的手續(xù)。酶是具冇催化活性的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)很容易變性，所以在酶的提純過程中應(yīng)避免 用強酸強堿，保持在較低的溫度下操作。在捉純的過程中通過測定酶的催化活性 可以比較容易跟蹤酶在分離提純過程中的去向。酶的催化活性乂可以作為選擇分 離純化方法和操作條件

12、的指標，在整個0悔的分離純化過程屮的每一步驟，始終要 測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經(jīng)過某一步驟回收到多少酶，純度提高 了多少，從而決定著一步驟的取舍。酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽 捉、純化、結(jié)品或制劑。首先將所需的酶從原料屮引入溶液，此時不可避免地夾 帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇 性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶制劑。下面就iw的分離純化的常用方法作一綜 合介紹：一、預處理及固液分離技術(shù)1 細胞破碎（cell disruption）高壓均質(zhì)器法：此法可用于破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑曲霉菌。 將細胞懸浮液在高壓下通入一個孔徑

13、可調(diào)的排放孔屮，菌體從高壓環(huán)境轉(zhuǎn)到低壓 環(huán)境，細胞就容易破碎。菌懸液一次通過均質(zhì)器的細胞破碎率在12%-67%。細胞 破碎率與細胞的種類有關(guān)。要達到90%以上的細胞破碎率，起碼耍將菌懸液通過 均質(zhì)器兩次。最好是捉高操作壓力，減少操作次數(shù)。但有人報道，當操作壓力達 到175mpa時，破碎率可達100%。當壓力超過70mpa時，細胞破碎率上升較為緩 慢。高壓均質(zhì)器的閥門是影響細胞破碎率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質(zhì)器的閥 門，尤其高濃度菌體吋更是如此。在豐富培養(yǎng)基上比在合成培養(yǎng)基上生長的大腸 菌更難破碎。容菌酶處理法：蛋清屮含冇豐富的溶菌酶，價格便宜，常用來裂解細胞。具體做 法是：溶壁微球菌（mic

14、rococcus lysodeikticus）43kg,置于0. 5%的氯化鈉溶液 屮，使細胞濃度為5% （干重），在35°c用0. 68kg （干重）的蛋清處理20min,得 到的細胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機將細胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)除去， 再色乙醇濃度提高到75% （體積分數(shù)），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500go2. 禺心離心分離過程可分為離心過濾、離心沉淀、離心分離3種類型，所使用的設(shè)備有 過濾式離心機、沉降式離心機和離心機。過濾式離心機的轉(zhuǎn)鼓壁上開有小孔，壁 上冇過濾介質(zhì)，一般口j用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降 式離心機用于分離固體濃度較低的

15、固液分離，如發(fā)酵液中的菌體，用鹽析法或有 機溶劑處理過的蛋白質(zhì)等。分離機用于分離兩種互不相溶的、密度冇微小差別的 乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。在生物領(lǐng)域采用的離心機系統(tǒng)，除了應(yīng)具備離心機的一般要求外，還應(yīng)滿足生物 生產(chǎn)的技術(shù)要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產(chǎn)品不受污染并不污染環(huán)境。 現(xiàn)代哦離心機裝置包括以卜三個步驟，并進行程序控制：離心、離心系統(tǒng)的滅菌 及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機產(chǎn)品的裝置，具冇雙重軸向密封，密封由 裝在轉(zhuǎn)筒主軸上下的碳化硅動環(huán)和固定環(huán)組成，密封由水連續(xù)冷卻和潤滑，可防 止產(chǎn)詁被污染，也可防止生產(chǎn)過程屮排宙的廢物對環(huán)境的污染。該離心機又如一 個密閉的壓力容器，可

16、在121 °c溫度下進行蒸汽滅菌，該離心設(shè)備設(shè)冇環(huán)繞離心 機轉(zhuǎn)筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進行充分的冷卻，并能有效地控 制溫度，這對于生物制品是非常重要的。如btpx205型離心機可用于細胞收集、 培養(yǎng)液的凈化和細胞碎片的分離，可用于疫苗、酶制劑等的提取。該機的其他輔 助系統(tǒng)及控制系統(tǒng)也較為完善，如設(shè)有壓力指示器、力量計、溫度傳感器和液面 傳感器。3. 膜分離技術(shù)在蛋口質(zhì)純化過程中主要用到的膜分離技術(shù)多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過 孔徑非常小的濾膜，使溶液屮分子量較小的溶質(zhì)透過薄膜，而大分子被截留于膜 表面。人多數(shù)超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結(jié)合在-起而組成

17、 的。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機械強度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的 優(yōu)點是：操作條件溫和，無相變化，對生物活性物質(zhì)沒冇破壞。超濾系統(tǒng)主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過液收集罐組成，料液經(jīng)泵打入超濾 器，水及低分子量物質(zhì)排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器 中循環(huán)。當料液濃縮至一定的倍數(shù)后即可作為進一步處理的濃縮料液。超濾應(yīng)用于蛋口質(zhì)類物質(zhì)的濃縮和脫鹽過程中時應(yīng)注意以卜問題：第一，在超濾 循環(huán)過程屮，由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會逐漸升高，會 造成蛋口質(zhì)分子的損失。因此 料液貯罐應(yīng)加冷卻系統(tǒng)，并安裝自動測溫及控制 系統(tǒng)。第二，某些酶的輔助因子散失為問題：一些嗨含

18、有輔助因子，其分子量小, 超濾時易從透過液中排除掉，因而在超濾前或超濾后要添加一定濃度的的輔助因 了。述可將超濾與親和層析相結(jié)合以捉高分離純度。英工作原理是：當溶液屮欲被分 離的蛋口質(zhì)不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時，如果在膜的一側(cè)結(jié)合著親和配基， 該蛋白質(zhì)就會與配基結(jié)合因而結(jié)聚在膜的這一側(cè)。不與配基結(jié)合的其他物質(zhì)就將 穿過孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質(zhì)洗脫下來，洗脫液用于進一步的 分離純化。4. 泡沫分離原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由于這些組分的表面活性由差異，因此 在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩(wěn)定性取決于操作條件及溶液的生 物學特性。泡沫中含冇更多的表面活性成分，故

19、泡沫的組分種類及其含量與溶液 中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分離。蛋白質(zhì)較易吸附與氣液界而，這有利丁其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。泡沫分離過程是：蛋白質(zhì) 從主體溶液中擴散到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發(fā) 生重排，一般認為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是 濃膜，口j能會發(fā)生出多個分子聚集在一起的現(xiàn)象。在氣液界面形成的蛋白質(zhì)膜可 以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質(zhì)的特 性、結(jié)構(gòu)和濃度。泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋口的富集率（泡沫中蛋口質(zhì)的濃度/最初溶液 屮蛋白質(zhì)濃度），另一方面提咼p悔蛋白的提取率（泡沫屮蛋白質(zhì)的提取率/最初的 蛋

20、白質(zhì)質(zhì)量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數(shù)最大。二、抽提、沉淀鹽析常用的鹽析劑是硫酸鍍，其溶解度大、價格便宜。硫酸鍍沉淀蛋口質(zhì)的能力很強, 其飽和溶液能使大多數(shù)的蛋白質(zhì)沉淀下來。對酶沒有破壞作用。ph的控制：應(yīng)從酶的溶解度與穩(wěn)定性兩個方面考慮，在酶等電點時其溶解度最 小易沉淀，但有些酶再等電點時穩(wěn)定性較差，因此耍選擇最佳pll值一般耍求在 酶最穩(wěn)定的ph值的前捉下再考慮最適宜酶沉淀的ph值。在操作屮一旦確定最佳 ph值后，在添加硫酸鍍之前甲酸或堿調(diào)節(jié)好酶液的ph值，要盡量避免溶液ph 值的波動以免破壞酶的穩(wěn)定性。在添加硫酸鞍吋要注意攪拌，并注意硫酸錢的加 入速度，一般是曲少到多，緩慢加入

21、，硫酸鞍盡可能磨成細粉。溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩(wěn)定性能較好，可在常溫下進行鹽析操作，而 對于大多數(shù)酶，盡可能在低溫下操作。酶液的凈置：加完硫酸鞍后，酶液要靜置一段吋間，使晦蛋白完全沉淀下來，酶 靜置后，就不要再加以攪拌。有機溶劑沉淀冇機溶劑選擇：可用丁酶蛋白沉淀的冇機溶劑包括醇類物質(zhì)等，如卬醇、乙醇、 異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋口質(zhì)的變性，酶蛋口在其中的溶解度也 較低。冇機溶劑沉淀操作：冇機溶劑一般都使蛋白質(zhì)變性，當溫度較高時變性蛋白質(zhì)分 了就會變成永久失活。因此用有機溶劑處理時最好在0°c以下進行。用有機溶劑 沉淀得到的酶蛋白不要放置過久，要盡快加水溶解。聚合物絮

22、凝劑沉淀聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭奪水分子，具有脫水作用使iw 沉淀。聚乙二醇作為-種沉淀劑的優(yōu)點是在水溶液中，其濃度可達到50%,濃度 為6%-12%的蛋口質(zhì)大都可以沉淀卜來。這種試劑不需要低溫操作，而且對蛋口 質(zhì)的穩(wěn)定述冇一定的保護作用。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必 去除。用金屬離子和絡(luò)合物沉淀酶和其他蛋白質(zhì)都會形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉淀的缺點是酶與 金屈離了相互作用后，可逆變化較茅，尤其是用筑基衍生物，它結(jié)合的金屈離 子會催化酶變性而失活。用特殊試劑沉淀法用鏈霉素可選擇性去除核酸，從而使胞內(nèi)酶沉淀出來。鏈霉素鹽（濃度為0. 5-l.omg/m

23、g蛋白質(zhì)）對于選擇性沉淀核酸的效果比鎰離子還要好，酶不易失 活。親和沉淀將親和反應(yīng)的高度選擇性、低處理量特性與沉淀操作的大處理量、地選擇性有機 結(jié)合形成了親和沉淀技術(shù)。將配基與可溶性載體偶聯(lián)后形成載體-配基復合物， 該復合物與生物分子結(jié)合后在一定條件下可以沉淀出來。配基-載體復合物可以選擇性地與蛋口質(zhì)結(jié)合，溶液中的pii值、離了強度及蛋白 質(zhì)濃度等條件對親和結(jié)合的彩響力并不大，只冇競爭性的配基會降低產(chǎn)物與原配 基的親和結(jié)合力，甚至使親和結(jié)合發(fā)生逆轉(zhuǎn)。引導產(chǎn)生沉淀的方法有：離子交聯(lián)；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷 的疏水基團；改變ph值，誘導產(chǎn)生疏水沉淀；溫度誘導產(chǎn)生沉淀。親和結(jié)合：將親

24、和配基加入到含有h的物蛋白質(zhì)的溶液中，調(diào)節(jié)好有關(guān)沉淀的條 件，使之冇利于親和結(jié)合。洗滌：為經(jīng)過處理的粗制液中發(fā)生親和沉淀可能會發(fā)生非特異性結(jié)合，尤其是使 用帶電的聚合物，離子交換的效應(yīng)將使其他蛋白質(zhì)共同沉淀，因此在分離口的物 之前要洗滌沉淀物。其做法是：加入適當?shù)那逑磩┲匦氯芙獬恋?，再沉淀；或?專一性洗脫z前，徹底清洗沉淀。在上述過程中耍始終保持目的蛋白質(zhì)與配基處 于親和結(jié)合狀態(tài)。配基-載體復合物與目的蛋白質(zhì)的分離：分離結(jié)束z后，要確 保冋收目的蛋口質(zhì)和配基-載體復合物，目的蛋口質(zhì)要達到一定的純度，冋收率 要高。方法簡介第三章蛋白酶的活性檢測方法由于蛋白酶研究的興盛，使蛋白酶活性測定的方法也

25、得到了發(fā)展。 這里簡要介紹兒種各具特色的蛋口酶活力測定的新方法。dna/澳乙錠熒光分析法_|1基本原理澳乙錠插入雙鏈dna的堿基對z間時，可使dna的熒光增加25倍 接 近飽和的澳乙錠(0. 5tg/m 1)與dna混合時，其熒光增加量與dna的濃 度呈正比。當?shù)鞍踪|(zhì)(如組蛋自)與d7a結(jié)合時，阻止了澳乙錠的插入，結(jié) 果，熒光消失。組蛋白與dna有非常高的親和力，組蛋白加入雙鏈dna溶 液時，全部結(jié)臺到dna雙鏈上，溶液中沒有游離的組蛋白存在，直到所冇 結(jié)合部位都飽和。溶液熒光的卜降量與組蛋白的加入量呈止比。在dna-組蛋白一澳乙錠潛藏屮加入蛋白酶時，蛋白酶水解結(jié)合在d 鏈上的組蛋口，使dna

26、結(jié)合部位暴露出來，澳乙錠重新插入dna雙鏈中， 熒光增加量與蛋白酶活性星正比。據(jù)此，通過測定dna溶液的熒光增量來 計算蛋白酶的活性。2酵活性測定方法2. 1直接熒光測定在17x75ram的硼酶玻璃管中，加入含有0. 5 / g / ml滇乙錠的 ph8.0的tris緩沖液1.2ml和10#1 dna 組蛋白復合物(其屮古0. 5fg 胸腺dna和1. 5fg完整組蛋白)，于37oc平衡5分鐘后，加入約10111 蛋白酶，在一定的間隔時間內(nèi)，測定熒光增量。激發(fā)波長為525nm,發(fā) 射波長為600nnio 1_2. 2間接熒光測定為了改善靈敏度，dna -組蛋白 的結(jié)合在5001 eppendo

27、rf管中進行 向eppendor管中加入1. 2ml含 0. 5/g/ml乙錠的ph8. 0的=rrig緩沖液，10/1 dna -組蛋白 混合液(含1_5 g組蛋白和0. 5 g dna),于37oc保溫5分鐘，充分混 勻后，取樣10 1加入熒光管中，再加入10蛋白酶混勻后，測定熒光增ill1_3本方法的特點1_3. 1靈敏度高，足以在納克水平定量測定多種蛋白卿活性。如可 檢測10個細胞提取液中的蛋白酶活性。1_3. 2快速，適用于大量樣品的測定。如蛋白酶分離純化過程中， 測定麵化中間產(chǎn)物的酶活性，血清屮q1-抗胰蛋白酶活性等。1|3. 3結(jié)果穩(wěn)定，重復性好。組蛋口與dna結(jié)合穩(wěn)定，22oc

28、 10小 時內(nèi)都很穩(wěn)定，且不受離子濃度和變性劑的影響,如150retoolnaci. loretool mgc12 和 cact2 及 0. 02sds、0. 04 十二烷基肌氨酸、2 triton 等對組蛋口與dna的結(jié)合都無明顯影響。此法還可同時測定蛋白酶抑制 劑。fja 法流動注射分析(flow injection analysis, f1a)是近年發(fā)展起來的又 一項應(yīng)用廣泛的分析測試新技木。fm具冇重復性好、反應(yīng)迅速、省時、試 劑消耗少、適應(yīng)性廣等特點，已廣泛用于分析化學、生物化學、臨床檢驗 及食品分析等多種領(lǐng)威。目前f1a在酶活性檢測屮也得到應(yīng)用。下而介紹 用熒光標記底物測定蛋口酶活

29、性的fia法。1基木原理用熒光索異硫氧酸鹽(fttc)標記蛋白酶底物牛血清白蛋& (bsa),然后 將標記的bsa偶聯(lián)到2-f- 1 一甲基毗碇（fmp）活化的分離膠上，制成分析 柱。當酶液流過分析柱時，蛋口酶將標記在bsa上的熒光基團解離下來， 通過熒光光度計檢測酶解流出液的熒光強度來測定蛋白酶的活性。為了消 除樣品中可能存在的熒光物質(zhì)對測定結(jié)果的影響，在分析系統(tǒng)中設(shè)置一個 與分析柱完全一樣的對照柱僅以分離膠代替fitcbsa -分離膠待測酶 液通過分析柱測得的熒光強度，減去待測酶液通過對照柱所測得的熒光強 度，即為酶實際水解的熒光素的熒光強度。2測定程序首先用fttc標記bsa,然后偶聯(lián)到用fmp活化的分離膠上.制成分析 柱。將分析柱代替hplc（或常壓系統(tǒng)）中的層析柱。待測樣品液注射進樣后 由微量泵送人分析柱，酶經(jīng)過分析柱時.將標記在bsa±的熒光基團解離 下來。酶解流出液經(jīng)熒光檢測儀測出熒光強度，由記錄儀記錄下來。3特點本法精確度高、結(jié)果可靠。因為酶解反應(yīng)在恒溫條件下進行，并設(shè)置 了對照柱，排除