流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期操作步驟

1、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期操作步驟取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，按ixi06cells/ mL以1mL接種于100mm培養(yǎng)皿內(nèi)24h后，進(jìn)行所需的處理（比如加藥，照射）特定時間后終止培養(yǎng)，進(jìn)行下一步的實驗收集原培養(yǎng)液，洗后的PBS和消化后的細(xì)胞，將三者混勻放入 15ml離心管中1000rpm離心5min （短時低速離心）棄上清，用1.5ml預(yù)冷PBS, 1000rpm離心5min后去除PBS和細(xì)胞懸液內(nèi)的細(xì)胞碎片加入1.5ml預(yù)冷PBS在渦旋狀態(tài)下加入3.5ml無水乙醇，混勻 后，于4c固定30min或-20C長期保存。1000r/min 離心 5min將乙醇吸除，加PBS清洗混勻1000r/min

2、,5min 再離心一遍，將殘留在細(xì)胞上的乙醇除去吸除離心管內(nèi)PBS,加入200ul PB*口 2ul的RNA酶（0.25mg/ml）（37下孵育30min）加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室溫下避光染色 30min將離心管內(nèi)的細(xì)胞過濾（300um尼龍網(wǎng)膜）至含有PBS的EP管中（PI具有很強(qiáng)的粘附性，容易使細(xì)胞聚團(tuán)），標(biāo)記EP 管提前一天網(wǎng)上預(yù)約開機(jī)（先開儀器后開軟件）流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)一般分為5部分：流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)；激光光源及光束成形系統(tǒng)； 光學(xué)系統(tǒng)；信號檢測、存貯、顯 示、分析系統(tǒng)；細(xì)胞分選系統(tǒng)。編輯版 word檢測前先渦旋使細(xì)胞混勻懸浮呈單個細(xì)胞，然后插入流式細(xì)胞儀上流動室內(nèi)

3、充滿鞘液，細(xì)胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光（488nm激發(fā)光源）熒光信號變成電信號輸出到計算機(jī)，軟件分析（熒光染料和細(xì)胞DNA分子特異性結(jié)合，可以檢測出細(xì)胞周期各時相細(xì)胞比例）在用第三方軟件分析之前，將流式結(jié)果按如下所示導(dǎo)出Mur口Fw£kcrt UM fd* +QiMOH+q1Mrlw,，4w ,d 工 uur.'lTI尸士二結(jié)果分析Modfit軟件分析編輯版word二Hl胃片CLm a MrllrlfMf d* UwI if*Flowjo軟件分析編輯版wordZ01S062Q q-1.£ce- Z-，色11

4、 - Fl»rJ«El li £dli t Srsjk Ri 印Lv sjji Hll10134B20= . Fcrwu-d Scatter CFSt. . HI5BEeIp £di l ®/h Qc hjLhj Qi Jf？lp&回l1回回/闌 回回只一S囪創(chuàng)圖，口pii 4E.5 Ad X”腎 S WictictPSC-Hl In：, f ftiwar£:口., 國ScattrSi iiCamt 的1 / *3】士 1K> 0>回 1工，心小胃626"5巴,_10-江口工1|-|承口兇回山回©

5、;力豳.JI ，!. ?。?尸I M -.創(chuàng)困卜工6EREO-血 R-ad FluOTIMftBauy | 國|* 5rHMin3 7054 / Ml： 4J 171編輯版wordFCM-DNA量分析1個細(xì)胞增殖群時，可將 DNA含量分布組方圖分為三部分，即 G0/1、S G2M。G0/1和G2M細(xì)胞峰的DNA分布均為正態(tài)分布，S期可以認(rèn)為是一個加寬的正態(tài)分布檢測結(jié)果刻錄光盤保存關(guān)機(jī)（先關(guān)軟件后關(guān)儀器，關(guān)機(jī)前需清洗）正常細(xì)胞DNA含量:2n-4n凋亡細(xì)胞：核內(nèi)DNA斷裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段 DNA穿膜丟失，胞內(nèi)DNA含量減少。PI染色后，熒光強(qiáng)度減 小而形成一個DNA含量小于2n的

6、分布區(qū)（亞G1峰）。Plc dy : Fint匚件仙 nd p o JOclOkd! IDO 00 1口.G七5,亞 flf M M r%p fi? M t *t -17 7 ?Cfcp X *(n *. :口 HI 1 M卜GV 4 30nTgl &Fhm* K> 融.Folal 兇代 D. *口。、A>i工 0.42 %goC .1fr Mod a ari ovanti 3Ti5 Al cId ev«7ts 31 &6 Urs 口kh* p»"r 靜»! EO RCt:DG，Chemo la FA«1、縱坐標(biāo)Ce

7、ll Number：即計數(shù)的有效細(xì)胞數(shù)；2、橫坐標(biāo)DNA Content:即DNA含量；3、G1、G2、S三期在圖中已經(jīng)標(biāo)示；4、右側(cè)數(shù)字含義：Dip G1-53.84% at 55.56,即G1期DNA含量平均值為 55.56; 53.84%MP G1 期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的 53.84% Dip G2-5.64%at 107.72,即G2期DNA含量平均值為107.72, 5.64崛P G2期細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的5.64%;Annexin V-EGFP/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡基本原理：磷脂酰絲氨酸(PS)能與連接素V ( Annexin V)發(fā)生特異 結(jié)合；PI是核酸熒光染料，不能透過正常細(xì)胞膜，只能

8、進(jìn) 入已經(jīng)破損的細(xì)胞膜，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光，熒光強(qiáng)度與PI結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系。正常細(xì)胞：膜完整，PS不外翻一一PI-/Annexin V-凋亡早期：膜完整，PS翻轉(zhuǎn) PI-/Annexin V +凋亡晚期：PS外翻，膜通透，性增加一一 PI+/Annexin V +壞死細(xì)胞：膜嚴(yán)重破損，PS不外翻 PI+/Annexin V +幾乎不存在膜結(jié)構(gòu) PI+/Annexin V -實驗步驟：取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按1X 1C6 cells/ mL以1mL接種于培養(yǎng)皿內(nèi)24h后，進(jìn)行所需的處理（比如加入藥物）特定時間后終止培養(yǎng)，進(jìn)行下一步的實驗細(xì)胞用0.25%夷酶37c消化5min（胰酶

9、消化時間不易過長，以防引起 假陽性）加入PBS制成細(xì)胞懸液（移液槍吹打 6-8次）倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)（單個分離懸浮）將細(xì)胞懸液移入15ml離心管中2000rpm離心 5min,PBS吸除用PBS清洗細(xì)胞2次（2000rpm,離心5min收集細(xì)胞）用 400ul 1x Binding Bufer 懸浮細(xì)胞（濃度大約為 1 x 106 cells/ml）在細(xì)胞懸液中加入5ul Annexin V-EGF巳 輕輕混勻后于2-8C避光條 件下孵育15 min加入10ul PI后輕輕混勻，于2-8C避光條彳下孵育5 min在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長采用 Ex.= 488nm雙波長激發(fā)，Em.二 510 nm檢測EGFP熒光（FL1 channel和575 nm的發(fā)射波長檢測 PI。細(xì)胞應(yīng)可分成三個亞群：活細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，凋亡 細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光，壞死細(xì)胞（包括極晚期凋亡細(xì)胞）有綠 色和紅色熒光雙重染色。圖2-5-2細(xì)胞;同亡的Annexin VTITGPI檢測法在流式細(xì)